Toxizitätsstudie zu Perowskit-Nanopartikeln an Epithelzellen der Atemwege

Einführung

Lanthan-Strontium-Manganit (LSM) ist ein Nanopartikel, das mit einer auf Perowskit basierenden Kristallstruktur ausgestattet ist. Es hat die allgemeine Form von "ABO3", wobei Lanthan und Strontium in der A-Stelle und Mangan in der B-Stelle sind. Dies führt zu der allgemeinen Formel La_1 − x Sr_x MnO₃ , wobei x für die Strontium-Dotierung steht, die von der Anwendung des Nanopartikels abhängig ist. LSM kann in Pulverform als Bandguss, Luft-/Thermo-/Plasmaspray und für Brennstoffzellenanwendungen verwendet werden [1,2,3,4].

Bei den jüngsten Bemühungen, die Umweltverschmutzung zu reduzieren und eine auf Wasserstoff basierende Wirtschaft zu schaffen, konzentrierte sich viel Forschung auf Festoxid-Brennstoffzellen (SOFCs) [5, 6]. LSM-Perowskite wiederum haben aufgrund ihrer bedeutenden Rolle in SOFCs als eines ihrer wichtigsten Elektrodenmaterialien [4, 7] Aufmerksamkeit in der Forschung auf sich gezogen. LSM-Nanopartikel sind kugelförmige Metallpartikel mit großer Oberfläche, die als braunes oder schwarzes kristallines Pulver erscheinen. Obwohl zahlreiche Studien zu den mechanischen und elektrischen Eigenschaften von LSM durchgeführt wurden [1, 3, 8, 9], hat sich nur sehr wenig Forschung auf seine biologischen Wirkungen konzentriert [10,11,12]. Zahlreiche Nanopartikel haben gezeigte Tendenzen zur Förderung der Schleimsekretion und -akkumulation, werden also mit Atemwegserkrankungen in Verbindung gebracht [13, 14]. Die Forschung an LSM-Nanopartikeln zeigt vielversprechende Ideen für biomedizinische Anwendungen [15,16,17]. Kürzlich hat die Forschung zu LSM ihr Potenzial für die Krebstherapie gezeigt [12, 18, 19]. Mit den richtigen Syntheseverfahren und Oberflächenmodifikationen hat LSM die Fähigkeit, ein MRT-Kontrast- und Hyperthermiemittel sowie ein Arzneimittelträger zu sein [20,21,22]. Die Möglichkeit einer Toxizität sollte jedoch vor weiteren medizinischen Anwendungen geprüft werden. Es gibt nur begrenzte Studien zur toxischen Wirkung von Perowskit [10, 23] und es wurde bisher keine signifikante toxische Wirkung berichtet.

In dieser Studie untersuchten wir die Toxizität von LSM-Nanopartikeln, während wir primären Trachealepithelzellen ausgesetzt waren, um den Konzentrationsbereich der Toxizität zu bestimmen. Anschließend analysierten wir die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und die Schädigung der Mitochondrien zusammen mit der Reaktion auf die Schleimsekretion mit Fluoreszenzmikroskopie [24]. Das Ausmaß der Apoptose-Progression mit oder ohne LSM-Nanopartikel wurde mit Cytochrom-C- und Caspase-3-Assays untersucht [25].

Ergebnisse und Diskussionen

NPs-Charakterisierung und Zelllebensfähigkeits-Assay

Die Toxizität von Nanopartikeln hängt von ihren physikalischen Eigenschaften wie Geometrie, Größenverteilung und Oberfläche ab. Vor den Toxizitätsexperimenten wurden diese Eigenschaften mit SEM analysiert. Die LSM-Nanopartikel zeigten eine signifikante Oberflächenrauheit und waren in Aggregaten verschiedener Größen mit einem Durchmesser von ungefähr 35 nm bis 200 nm verteilt (Abb. 1).

REM-Aufnahme der physikalischen Eigenschaften von LSM. Die Einzelpartikelgröße hatte einen Durchmesser von etwa 35 nm und die Aggregation der LSM-Größe variierte von 200 nm bis zu einigen μm

Wir haben in unserer vorherigen Studie zahlreiche Toxizitätsexperimente an Trachea-Atemwegszellen mit einer Vielzahl von NPs durchgeführt [26, 27], daher wurde diese Zelllinie für diese biologische Studie ausgewählt. Um die Gesamttoxizität von LSM auf Tracheazellen zu beurteilen, wurde der kolorimetrische CCK8-Zelllebensfähigkeitstest durchgeführt [25, 27]. Wie in Abb. 2 zu sehen ist; Zellviabilitätsassay gab es eine dramatische Veränderung der Population von 50 auf 100 μg/ml LSM-Konzentrationen. Bei LSM-Konzentrationen von mehr als 100 μg/ml blieb die Population jedoch in einem relativ stabilen Bereich und zeigte keine signifikanten Veränderungen.

Lebensfähigkeit der Luftröhrenzellen nach Erhöhung der LSM-Konzentration, hier als Log[ng/ml] gezeigt. Zur Messung wurde der kolometrische CCK8-Zelllebensfähigkeitstest verwendet, und sein Durchschnitt pro Konzentrationsinkrement wurde berechnet. (n> 6)

Produktion von ROS und Mucin Release

Die ROS-Produktion initiiert die Apoptose und trägt somit zur Zytotoxizität von Nanopartikeln bei. Gemäß Abb. 3; ROS-Produktion, eine Erhöhung der Konzentration von LSM hat keinen großen Einfluss auf die ROS-Produktion. Die LSM-Konzentration von 250 μg/ml unterschied sich am stärksten von der Kontrolle, aber ihre Abweichung war nicht signifikant, was darauf hindeutet, dass LSM keinen bemerkenswerten Einfluss auf die ROS-Produktion hat.

ROS-Produktion von Luftröhrenzellen nach Erhöhung der LSM-Konzentration. Die Verhältnisse der ROS-Produktion pro LSM-Konzentrationsbehandlung wurden durch Vergleich mit der Kontrollgruppe berechnet. (n> 100)

Aus Abb. 4; mucus bata gab es nach einer 15-minütigen Behandlung keine signifikante Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen, und mit steigender LSM-Konzentration nahm die Muzinsekretion ab. Die Mucinfreisetzung wurde auf bis zu 40 % reduziert, wenn die Zellen mit 500 μg/ml LSM behandelt wurden, und könnte möglicherweise mit noch höheren Konzentrationen von LSM weiter reduziert werden. Diese Verringerung legt nahe, dass LSM eine hemmende Wirkung auf die Schleimfreisetzung hat.

Ergebnisse der Mucinsekretion nach 15-minütiger Behandlung mit steigenden LSM-Konzentrationen. Die Verhältnisse wurden für jede LSM-Konzentration durch Vergleich mit der Kontrollgruppe berechnet. Die Bewertung der Zelloberflächen-Mucinsekretion wurde durch ELLA (enzyme-linked lectin Assay) durchgeführt. (*:n> 6, p < 0.05)

Mitochondriale Schäden und Apoptoseprozesse

Das frühe Stadium der Apoptose wird typischerweise durch eine mitochondriale Schädigung repräsentiert. Um dieses Phänomen zu analysieren, wurde der JC-1-Farbstoff als Indikator für das mitochondriale Membranpotential verwendet. Das durch den JC-1-Farbstoff induzierte Intensitätsverhältnis korreliert mit dem Verlust der mitochondrialen Integrität, und gemäß Abb. 5 nahm mit steigender LSM-Konzentration die mitochondriale Schädigung nach 100 μg/ml LSM-Behandlung signifikant zu. Obwohl die Ergebnisse zeigen, dass die Mitochondrienschädigung nach 100 μg/ml LSM-Behandlung signifikant ist, zeigen Caspase3 und Cytochrom C leichte Abnahmen, wie unten beschrieben. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass LSM Schäden an den Mitochondrien verursachen könnte, aber die Zellen haben immer noch die Fähigkeit, in der Apoptoseprogression auf einem niedrigen Niveau zu bleiben und die Apoptosemarkerexpression zu reduzieren.

Fluoreszenzintensitätsergebnisse des JC-1-Indikatorfarbstoffs unter vier verschiedenen Behandlungsbedingungen auf Luftröhrenzellen, um die mitochondriale Integrität anzuzeigen. (*, **, ***:n> 100, p < 0.05)

Apoptose kann auch durch die Expression von Cytochrom C und Caspase 3 gemessen werden. Wie in Fig. 6a gezeigt; Apoptose-Ergebnis auf Cytochrom C, gab es eine moderate Abnahme der Apoptose-Raten zwischen den verschiedenen Konzentrationen von LSM und der Kontrollgruppe. Der gleiche Trend ist in Abb. 6b zu sehen; Apoptose-Ergebnis bei Caspase 3, was auf eine sehr minimale Toxizität aufgrund von LSM hinweist. Insgesamt waren die durch LSM verursachten mitochondrialen Schäden und Apoptoseergebnisse auf Luftröhrenzellen der Atemwege sehr gering, was darauf hindeutet, dass LSM keine signifikante toxische Wirkung auf die Epithelzellen der Luftröhre hat.

Gemessene Apoptoseergebnisse durch a Cytochrom-C-Expression, b Caspase-3-Ausdruck. Die Verhältnisse wurden pro LSM-Konzentrationsbehandlung durch Vergleich mit der Kontrollgruppe (HBSS) erhalten. (*:n> 100, P < 0.05)

Schlussfolgerungen

Neuere Nanotoxizitätsstudien haben aufgrund ihrer breiten Verwendung in industriellen und kommerziellen Produkten viel Aufmerksamkeit auf die toxischen Wirkungen von Nanopartikeln gelenkt. Die Hauptsorge der Nanotoxizität ist auf die Bildung von ROS zurückzuführen. Zum Beispiel TiO₂ NPs werden aufgrund der großen Menge an erzeugten ROS, die zu Zelltod und Mutationen führen können, als eine Art krebserregendes Material angesehen [28]. Es gibt verschiedene Arten von Materialien und Verbindungen, die als Perowskit klassifiziert werden und über die in den letzten Jahren in einer Vielzahl unterschiedlicher Anwendungen berichtet wurde. Dies ist die erste Studie zur Bestimmung der LSM-Toxizität auf Epithelzellen der Atemwege, die einer der Hauptwege für die Aufnahme von NPs durch Zellen sind. Diese Studie zielte darauf ab, die Wirkung von LSM auf Luftröhrenzellen zu untersuchen, um seine Toxizität zu bewerten. Die Ergebnisse zeigten, dass LSM keinen signifikanten Einfluss auf die Apoptoseprogression, gemessen anhand der Cytochrom-C- und Caspase-3-Expression, die Mitochondrienintegrität gemessen anhand der JC-1-Fluoreszenz, das Zellüberleben und die ROS-Produktion hat. Die Behandlung zeigte jedoch eine unterdrückende Wirkung auf die Schleimsekretion und verringerte die Schleimproduktion, wenn die LSM-Konzentrationen erhöht wurden. Letztendlich wurde durch die Ergebnisse dieser Studie festgestellt, dass LSM gegenüber Epithelzellen der Atemwege nicht toxisch ist, keine signifikanten Veränderungen in den Apoptosestadien verursacht und zusätzlich die Schleimsekretion verringert, die die Lebensfähigkeit der Zellen gefährden kann. Dies deutet auf das Potenzial von LSM hin, die Beseitigung von Atemwegsschleim zu beeinträchtigen. In unserer Studie haben wir das Toxizitätspotenzial der LSM-NPs nachgewiesen und die Ergebnisse zeigen, dass das potenzielle Risiko der toxischen Wirkung relativ geringer ist als bei anderen NPs, die für industrielle und kommerzielle Anwendungen verwendet wurden. Es müssen jedoch weitere Untersuchungen durchgeführt werden, um festzustellen, ob LSM sicher als Wirkstoff in kommerzielle Solar- und Energiespeicherprodukte integriert werden kann.

Materialien und Methoden

Kultur der Trachea-Primärzellen

Die primären Epithelzellen der Trachea wurden aus normalem bovinem Bronchialepithel gemäß zuvor veröffentlichten Protokollen isoliert [26]. Die Zellen wurden in serumfreiem Medium (SFM) gezüchtet und gehalten, das mit präqualifiziertem humanen rekombinanten epidermalen Wachstumsfaktor 1–53 (EGF 1–53) und Rinderhypophysenextrakt (BPE) (Thermo Fisher) versorgt wurde. Die primären Luftröhrenzellen wurden in mit Kollagen () vorbeschichteten 15-cm-Falcon-Platten kultiviert und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C, 5 % CO₂ . inkubiert . Die Zellzählungen wurden unter Verwendung von Trypanblau (Sigma)-Ausschluss und einem Bright-Line-Hämozytometer durchgeführt. Die Zellen wurden passiert, als die Konfluenz 80 % erreichte.

Zellvorbereitung

Zellen wurden bei 5 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen pro Well in einer kollagenbeschichteten 96-Well-Platte (75% Konfluenz) für Zellviabilitätstests, 5 × 10 ⁵ Zellen pro Well in einer kollagenbeschichteten 4-Well-Platte (75% Konfluenz) für Ca ²⁺ Signalisierung, ROS und Mitochondrienanalyse. Nach der Aussaat wurden die Zellen 24 h in SFM inkubiert, das mit präqualifiziertem humanem rekombinantem EGF 1–53 und BPE (Thermo Fisher) ergänzt wurde. Nach 24 h Inkubation wurde das Medium von den Zellen entfernt und die Kultur zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült. PBS-Wäsche wurde durch Nanopartikel ersetzt, die in Ca ²⁺ . beschallt wurden mit Hanks oder Ca ^2 + -kostenlose Hanks.

Zelllebensfähigkeitstest

Die photokolorimetrische Bestimmung der Zytotoxizität wurde mit dem Farbstoff CCK-8 (Dojindo Laboratories, Tokyo, Japan) bewertet [27, 25]. CCK-8 ist nicht radioaktiv und bietet eine kolorimetrische Bestimmung des Prozentsatzes lebensfähiger Zellen, die unterschiedlichen NP-Konzentrationen ausgesetzt sind. Dieses Assay-Kit misst die metabolische Aktivität von Dehydrogenasen in den lebensfähigen Zellen, um WST-8-Tetrazoliumsalz in wasserlösliches Formazan umzuwandeln. Es wurde durch Zugabe von CCK-8 in HBSS in einer 1:10-Verdünnung hergestellt. Die Zellen wurden mit HBSS gespült und 100 μl des Farbstoffs wurden in jede Vertiefung geladen. Dann wurden die Zellen bei 37 °C, 5 % CO₂ . inkubiert Inkubator für 6 h. Die Absorption wurde unter Verwendung eines Thermo Multiscan EX Plattenlesegeräts (Thermo Multiskan EX Plattenlesegerät, VWR, CA, USA) bei einer optischen Dichte von 450 nm (650 nm Referenz) gemessen. Ein Durchschnitt wurde aus drei separaten Datensätzen für jede Konzentration, einschließlich der unbehandelten Kontrolle, aus drei unabhängigen Experimenten berechnet und als Prozentsatz der unbehandelten Kontrolle tabelliert.

Die Zelllebensfähigkeit wurde berechnet durch \(\frac{OD_{450\mathrm{Behandlung}}-{OD}_{650\mathrm{Behandlung}}}{O{D}_{450\mathrm{Kontrolle}}-O {D}_{650\mathrm{control}}}\ast 100\%\).

Lanthan-Strontium-Manganit-Nanopartikel

Lanthan-Strontium-Manganit (La_0,15 .) Sr_0,85 MnO₃ ) (LSM) Nanopartikel (35 nm, 99,5%) (Nanostructured&Amorphous Materials Inc.) wurde in dieser Studie verwendet. Alle NP-Proben wurden vor der Verwendung beschallt. Die verwendeten Konzentrationen waren 500 μg/ml, 250 μg/ml, 100 μg/ml und 50 μg/ml. Der verwendete Konzentrationsbereich wurde nach den Konzentrationen von TiO₂ . festgelegt In früheren Berichten gefundene NPs (Dowding et al. 2014; Dowding et al. 2012; Gurr et al. 2005; Hirst et al. 2009; Niu et al. 2011). Die LSM-NPs wurden mit Hanks-Lösung (Invitrogen, CA, USA) rekonstituiert, bevor sie einzeln getestet und unmittelbar vor der Verwendung etwa 5 Minuten lang beschallt wurden.

Rasterelektronenmikroskop

LSM-NPs wurden zu 5 μg/ml präpariert und auf einen sauberen Siliziumwafer tropfengegossen und luftgetrocknet, um Restwasser zu entfernen. Die Größe der NPs wurde unabhängig unter Verwendung eines Rasterelektronenmikroskops (Gemini SEM, Zeiss) bestätigt.

Intrazelluläre Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies

Die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) wurde durch Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung der Oxidation von CM-H2DCFDA-Farbstoff (Invitrogen, CA, USA) bewertet [24]. Die Zellen (1 ×   105 Zellen/Vertiefung) wurden 24 h lang kultiviert, bevor sie mit PBS-Lösung gespült wurden. Die Proben wurden durch Auftragen eines Beladungspuffers mit 2 μM rekonstituiertem CM-H2DCFDA-Farbstoff in Medium für 30 Minuten gefärbt. Die gefärbten Proben wurden dreimal mit PBS gewaschen und für 5 Minuten Erholungszeit für zelluläre Esterasen beiseite gestellt, um die AM- oder Acetatgruppen zu hydrolysieren und den Farbstoff auf Oxidation ansprechen zu lassen. Hanks-Puffer, der LSM-NPs in Konzentrationen von 0 bis 500 μg/ml in 50 μg/ml enthielt, wurde dann mit den Zellen für 15 Minuten bei 37 °C inkubiert, gefolgt von Waschen mit PBS. Fluoreszenzbilder von ROS, die in Zellen erzeugt wurden, wurden aufgenommen und analysiert, indem das Verhältnis der Zunahme der Fluoreszenzintensität zwischen verschiedenen Behandlungen und Kontrollgruppen berechnet wurde.

Mitochondrien-Schadensmessung

Das mitochondriale innere Transmembranpotential wurde mit polychromatischem 5,5′,6,6′-Tetrachlor-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidoazolyl-carbocyaniojodid (JC-1 Sigma) bewertet [25]. JC-1 ist ein lipophiles fluoreszierendes Kation, das in die Mitochondrienmembran eingebaut werden kann, wo es von Aggregaten des Membranpotentialzustands abhängt. Die Aggregation verändert die Fluoreszenzeigenschaften von JC-1 und verschiebt sich von grüner zu roter Fluoreszenz. Intakte mitochondriale Membranen, die mit JC-1 gefärbt wurden, zeigen eine ausgeprägte rote mitochondriale Fluoreszenz, die durch Fluoreszenzmikroskopie nachweisbar ist. Ein Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials führt zu einer nachfolgenden Abnahme der grünen Fluoreszenz und einer Zunahme der roten Fluoreszenz. Vor der Stimulation der NPs wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und mit JC-1-Färbereagenz (1:1000) in Medium bei 37 °C für 30 Minuten inkubiert, gefolgt von Waschen mit PBS und Zellbehandlung. Das mitochondriale Membranpotential wurde durch Fluoreszenzmikroskopie in Zeitintervallen von 10 Minuten nachgewiesen.

Messung von [Ca ²⁺ ]_c

Alle Experimente wurden unter dunklen Bedingungen durchgeführt. Die Zellen wurden mit einem Rhod-2 AM-Farbstoff (1 μM) (K _d = 570 nM, λ_Ex = 552 nm und λ_Em = 581 nm) (Invitrogen, CA, USA) für 45 Minuten. Die Zellen wurden dann zweimal mit PBS gewaschen, bevor sie mit Hanks-Puffer inkubiert und mit der entsprechenden NPs-Konzentration behandelt wurden. Alle Ca ²⁺ Signalexperimente wurden in einem thermoregulierten Zustand bei 37 °C durchgeführt, montiert auf einem Nikon-Mikroskop (Nikon Eclipse TE2000-U, Tokio, Japan) [24, 25, 27] (Chen et al. 2011).

Mucinsekretion und ELLA

Die Zellen wurden bei 1 × 10 ⁶ . ausgesät Zellen pro Well in einer 6-Well-Platte und 24 h kultiviert. Primäre Luftröhrenzellen wurden dann mit PBS gespült und für 15 Minuten mit den entsprechenden LSM-NP-Konzentrationen (500 μg/ml, 250 μg/ml und 100 μg/ml), hergestellt in PBS, stimuliert. Der Überstand, der sekretiertes Mucin enthielt, wurde gesammelt und kurz bei 8000 U/min zentrifugiert, um die restlichen NPs zu entfernen. Der Überstand wurde dann in einer 96-Well-Platte (Nunc MaxiSorp, VWR, CA, USA) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Danach wurde die 96-Well-Platte mit PBST (PBS + 0,05% Tween-20) gewaschen und dann mit 1% BSA blockiert. Die 96-Well-Platte wurde erneut mit PBST gewaschen und mit Lektin (Weizenkeimagglutinin, WGA) (Sigma-Aldrich, MO, USA), konjugiert an Meerrettichperoxidase (HRP; 5 mg/ml) (Sigma-Aldrich, MO, USA), bei 37 °C für 1 h. Das Substrat, 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB; Sigma-Aldrich, MO, USA), wurde bei Raumtemperatur in jede Vertiefung gegeben, gefolgt von H₂ SO₄ (Sigma-Aldrich, MO, USA), um die Reaktion zu beenden. Die optische Dichte wurde bei 450 nm gemessen (Chen et al. 2011; Kemp et al. 2004).

Immunoassay (ELISA)-Vorbereitung

Die Zellen wurden mit einer Dichte von 1 × 10 ⁶ . ausgesät Zelldichte in einer 6-Well-Platte und 24 h kultiviert. Luftröhrenzellen wurden dann mit PBS gespült. Die Zellen wurden 2 h lang mit den entsprechenden LSM-NPs-Konzentrationen (0–500 μg/ml) in PBS stimuliert. Die Zelllyse wurde mit dem Peirce RIPA-Zelllysatreagenz vorbereitet, und das Lysat wurde gesammelt und in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Die Proben wurden bei ~ 14.000×g . zentrifugiert 15 Minuten lang, um die Zelltrümmer und NPs zu pelletieren. Der Überstand wurde dann in einer 96-Well-Platte über Nacht bei 4 °C inkubiert. Danach wurde die 96-Well-Platte mit PBST (PBS + 0,05% Tween-20) gewaschen und dann mit 1% BSA blockiert. Die 96-Well-Platte wurde erneut mit PBST gewaschen und mit Kaninchen-Anti-Caspase 3, Antikörper in aktiver Form (Millipore, polyklonaler Antikörper) und Maus-Anti-Cytochrom C (Invitrogen, monoklonaler Antikörper) 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Verwenden Sie dann einen sekundären Antikörper (Anti-Kaninchen- und Anti-Maus-konjugierte Meerrettich-Peroxidase, HRP, Millipore) und folgen Sie dem gleichen Verfahren wie bei ELLA, um die Absorptionsintensität zu messen [25].

Bildanalyse

Die Bildanalyse wurde mit einem invertierten Nikon Eclipse TE2000-U Fluoreszenzmikroskop durchgeführt. Jedes Foto wurde mit einer Vergrößerung von × 10 aufgenommen und unter Verwendung von Simple PCI (Compix Inc., Imaging Systems, Sewickle, PA, USA) analysiert. Die gezeigten Daten für zytosolische Calciumkonzentrationen werden durch Rhod-2-Fluoreszenz dargestellt. Bilder wurden alle 0,5 s aufgenommen und zur Analyse automatisch in Graustufen umgewandelt. Einfache PCI lieferte die Pixelintensitäten (mittlerer Grauwert) ausgewählter Bereiche, jeder mit einer mittleren Fluoreszenz pro Frame für 200 Zellen über 100 s (~ 200 Frames) unmittelbar nach der Nanopartikel-Stimulation. Die für die Immunfluoreszenzfärbung gezeigten Daten sind eine Darstellung der Proteinexpression nach 1–2 stündigen Behandlungen mit Graphen. Alle Experimente wurden mindestens dreimal unabhängig durchgeführt und bestätigt.

Statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittelwert  ± SD dargestellt. Jedes Experiment wurde unabhängig mindestens dreimal durchgeführt. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung einer Einweg-ANOVA-Testanalyse mit p . bestimmt Werte < 0,05 (GraphPad Prism 4.0, GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA).

Abkürzungen

BPE:

Rinderhypophysenextrakt

ELISA:

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

LSM:

Lanthan-Strontium-Manganit

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies

SFM:

Serumfreies Medium

SOFCs:

Solaroxidierte Brennstoffzellen