Magen-Parietal- und Darm-Becherzellsekretion:ein neuartiger zellvermittelter In-vivo-Metabolismus aus Metallnanopartikeln, der durch chinesische Kräuter mit Durchfall verbessert wird

Einführung

Mit der rasanten Entwicklung der Nanotechnologie und ihrer Anwendungen wird heute eine Vielzahl von technisch hergestellten Nanostrukturmaterialien in Pharmazeutika, biomedizinischen Produkten und anderen Industrien verwendet. Die aufkommenden Nanotechnologieprodukte haben ein enormes Potenzial für zukünftiges Wirtschaftswachstum und Entwicklung, aber die Risiken der Nanotechnologie für die Umwelt und die menschliche Gesundheit sind noch nicht vollständig verstanden. Um die Auswirkungen von Nanopartikeln auf den menschlichen Körper, ihre Wechselwirkungen mit biologischen Systemen und ihre potenzielle Risikobewertung zu untersuchen, wurde die Nanotoxikologie als ein neues multidisziplinäres Thema betrachtet, das zunehmende Aufmerksamkeit von Regierungen und Wissenschaftlern auf sich zieht und die Biosicherheit von Nanomaterialien als Schlüsselfaktor etabliert. wissenschaftliches Problem. Bis heute sind viele Berichte eng mit der Wechselwirkung zwischen Nanopartikeln und menschlichen Zellen verbunden. Zum Beispiel können einige Nanopartikel wie Graphenoxide, Goldnanocluster und Kohlenstoffpunkte in das Zytoplasma oder den Zellkern eindringen, einen Zellzyklusarrest oder eine Zellapoptose, die Bildung von Lungengranulomen und die Stimulation der immunologischen Zellsekretion einiger Zytokine auslösen [1,2, 3].

Mit der Entwicklung neuartiger molekularer Bildgebungsverfahren wurden Metallnanopartikel wie Goldnanopartikel, Silbernanopartikel, magnetische Nanopartikel und Quantenpunkte aktiv als multifunktionale theranostische Reagenzien untersucht und werden für die gezielte In-vivo-Bildgebung, magnetisch induzierte Erwärmung, photothermische oder photodynamische Therapie oder als hocheffiziente Wirkstoffabgabesysteme, unter anderem. Es wurde beobachtet, dass sich diese multifunktionalen Nanosonden auf Metallnanopartikelbasis an Tumorstellen befinden, und ein Teil von ihnen befindet sich auch im Leber- und Milzgewebe und kann sich im Nieren-, Lungen- und Hirngewebe verteilen [4,5,6, 7,8,9,10]. Da die Niere nur die Nanopartikel mit einem Durchmesser von weniger als 5 nm entfernt, sind die meisten Nanopartikel auf diese Weise nur sehr schwer zu entfernen [11, 12]. Daher ist die Reinigung von Metallnanopartikeln in vivo zu einem herausfordernden wissenschaftlichen Schlüsselproblem geworden. Bis heute gibt es jedoch keine überzeugenden alternativen Wege und detaillierten Mechanismen, um Metallnanopartikel aus dem menschlichen Körper zu entfernen. Daher ist es unser Anliegen geworden, Metallnanopartikel in vivo zu reinigen.

Bis heute werden Metallnanopartikel hauptsächlich auf drei Wegen in den Organismus eingebracht, wie intravenös, oral und intraperitoneal, von denen die intravenöse Injektion aufgrund ihrer schnellen Verteilung im gesamten Körper die häufigste Methode ist [4, 13, 14] . Der Abbau der Metallkerne derartiger Nanopartikel durch den Organismus ist jedoch nach Möglichkeit äußerst schwierig, was zum Hauptproblem führt, nämlich den Auswirkungen der Anreicherung von Restnanopartikeln. Es sollte beachtet werden, dass die Qualität von In-vivo-Metallnanopartikeln durch das Gleichgewicht zwischen Nanopartikel-induzierter Bioaktivität und unerwünschter Toxizität bestimmt wird. Aus toxikologischer Sicht wird eine toxische Wirkung nur dann hervorgerufen, wenn sich an einem Zielort ausreichende Mengen an Nanopartikeln befinden und die Ausscheidung aus dem Organismus der beste Weg ist, um die Wirkung einer übermäßigen Menge an Nanopartikeln, die sich in den Zellen und Geweben befinden, zu stoppen. Daher ist ein genaues Verständnis ihrer Clearance-Pfade für jede medizinische Anwendung und für eine umfassende Risikobewertung von entscheidender Bedeutung.

Es gibt einige Studien, die mit der Clearance von Nanopartikeln aus In-vivo-Geweben oder -Organen wie Niere, Leber und Lunge in Verbindung stehen [15,16,17]. Diese Experimente liefern jedoch lediglich Informationen über den Clearance-Mechanismus, um Partikel aus dem einzelnen Organ statt aus dem ganzen Körper zu entfernen [18]. Bezüglich der systemischen In-vivo-Clearance wurden zwei Hauptausscheidungswege von intravenös injizierten Nanopartikeln beschrieben, nämlich der Hepato-biliäre System (HBS)-Kot-Weg für größere Nanostrukturen, die vom Organismus nicht biologisch abbaubar sind, wie einige Arten magnetischer Nanopartikel [19, 20] und der Nieren-Urin-Weg für kleine Nanopartikel wie Quantenpunkte, Fullerene, Gold-Nanocluster und andere Arten von Gold-Nanopartikeln mit einem Durchmesser von weniger als 5 nm [16, 21, 22]. Diese beiden Wege zeigen jedoch eine begrenzte Clearance-Rate für In-vivo-Metallnanopartikel.

Souris et al. zeigten, dass sich Siliziumdioxid-Nanopartikel in hoher Konzentration in der Darmwand anreicherten und dass die Konzentration von intravenös injizierten 50–100 nm Siliziumdioxid-Nanopartikeln in der Leber viel niedriger war als in der Darmwand und im Stuhl [20]. Eine andere Studie zeigte, dass Nanopartikel mit einer Größe von bis zu 500 nm unabhängig von Modifikationen aus dem Fischkörper eliminiert werden können und dass die Eliminationsrate von 500 nm Partikeln schneller und effizienter war als die von 50 nm Partikeln, obwohl die größeren Nanopartikel weit über die Fähigkeit hinausgehen von HBS [23]. Diese Daten zeigen, dass der HBS-Weg möglicherweise nicht der wichtigste Ausscheidungsweg von In-vivo-Nanopartikeln ist und dass es andere Ausscheidungswege für In-vivo-Nanopartikel geben könnte.

Darmbecherzellen (GCs) sind stark polarisierte Ausscheidungszellen, die im gesamten Darmtrakt vorhanden sind. Es wird angenommen, dass diese spezialisierten Epithelzellen eine wichtige Schutzfunktion im Darm spielen, indem sie mehrere Mediatoren synthetisieren und sezernieren [24,25,26]. Wanget al. berichteten, dass Becherzellen (GCs) Nanopartikel aufnehmen können [27] und Sun et al. fanden heraus, dass sich intravenös injizierte Nanopartikel in den intestinalen GCs verteilten [28]. Dennoch ist die Wechselwirkung zwischen den Nanopartikeln und den intestinalen GCs bis heute nicht im Detail untersucht. Insbesondere wird in keinem Bericht vollständig geklärt, wie diese Nanopartikel in die GCs-Zellen gelangen können und ob sich diese Nanopartikel in den GCs des gesamten Darmgewebes verteilen. Um den Ausscheidungsweg von Metallnanopartikeln in das Darmgewebe aufzuklären, ist es entscheidend zu klären, welche Rolle Darm-GCs bei diesem neuartigen Ausscheidungsweg von Nanopartikeln spielen. Da Metallnanopartikel durch HBS ausgeschieden werden und in den Darm gelangen können, haben wir uns daher darauf konzentriert, zwischen der HBS-vermittelten und der durch intestinale GCs vermittelten Ausscheidung zu unterscheiden (Schema 1).

Der intestinale GC-Ausscheidungsweg von Nanopartikeln

In dieser Studie haben wir vier Arten gewöhnlicher Metallnanopartikel wie magnetische Nanopartikel, Silberdreieck-Nanopartikel, Gold-Nanocluster und Gold-Nanostäbe als Forschungsziele ausgewählt. Dank der charakteristischen optischen Eigenschaften von Goldnanostäbchen dienten sie als Werkzeug zur Beobachtung der Darmverteilung von Nanopartikeln durch Zwei-Photonen-Anregung, während die anderen drei Partikeltypen als repräsentative Beispiele für verschiedene andere metallische Nanomaterialien dienten. Mäusemodelle wurden mit Unterbindung des Hauptgallengangs hergestellt, um die Verbindung zwischen HBS und dem Darmtrakt zu verhindern. Die Metallnanopartikel wurden Mäusen über die Schwanzvene injiziert, dann wurden Nacktmäuse aufgezogen und 7 Tage lang Kot gesammelt, und die Tiere wurden schließlich getötet und das Darm- und Magengewebe wurde gesammelt, in Scheiben geschnitten und schließlich analysiert mit hochauflösendem Transmissionselektroskop und ICP-MS, um die Verteilung von Metallnanopartikeln im Darmgewebe zu untersuchen. Darüber hinaus wurde das Vorhandensein von Metallnanopartikeln im Kot der Mäuse mit CBD-Ligation gemessen. Darüber hinaus haben wir in dieser Studie, um den Mechanismus der Nanopartikel-Sekretion von GCs und PCs weiter aufzudecken, ein kürzlich entwickeltes Durchfallmodell bei Mäusen verwendet, das durch chinesische Kräuter induziert wird.

Materialien und Methoden

Synthese und Charakterisierung von dreieckigen Silbernanoplatten

Die dreieckigen Silbernanoplättchen wurden mit einigen Modifikationen synthetisiert, die zuvor von Mirkin [29] und Kollegen beschrieben wurden [30]. In einem typischen Experiment bei Raumtemperatur mit Luft wurde AgNO₃ (0,1 mM, 100 ml), Trinatriumcitrat (30 mM, 6 ml), PVP (30 kDa Molekulargewicht, 0,7 mM, 6 ml) und 240 µl H₂ O₂ (30 Gew.-%) wurden geordnet in einen 250-ml-Kolben gegeben. Nach kräftigem Schütteln der kombinierten Lösungen im Kolben, 0,8 ml einer frisch zubereiteten Lösung von 0,1 M NaBH₄ wurde schnell gespritzt. Innerhalb weniger Sekunden wurde die Farbe der Lösung gelb, was die Bildung von Silbernanokügelchen anzeigte. In den nächsten Stunden wurde der Kolben ohne weitere Farbänderungen unter Sonnenlicht oder Leuchtstofflampe gestellt, bis die Lösung blau wurde (höchstens 5 h). Und die endgültige Lösung wurde zur weiteren Verwendung im Kühlschrank bei 4 °C aufbewahrt.

Das Absorptionsspektrum der hergestellten Lösung wurde mit einem UV-vis-NIR-Spektrometer (UV-3600, Shimadzu, Japan) unter Verwendung einer 1-cm-Küvette mit optischem Weg gemessen. Die Spektren wurden in einem Bereich von 200 bis 950 nm mit einem 2 nm Spalt aufgenommen. Die Analyse durch Transmissionselektronenmikroskopie wurde auf JEM-200CX (JEOL, Japan) durchgeführt, indem das kohlenstoffbeschichtete Kupfer-TEM-Gitter in die gesammelten Nanopartikel in 1 ml entionisiertem Wasser getaucht wurde, nachdem insgesamt 10 ml der Lösung in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert wurden bei 6000 U/min für 30 min bei 25 C. Aus den TEM-Bildern wurden insgesamt 200 dreieckige Silbernanoplättchen ausgewählt, um die Verteilung ihrer Kantengrößen statistisch zu berechnen.

Superparamagnetischer Magnetit (Fe₃ .) O₄ ) Nanopartikel, Goldnanocluster und Goldnanostäbchen wurden gemäß unseren früheren Berichten [31,32,33] synthetisiert und charakterisiert und bei Raumtemperatur gelagert.

Vorbereitung von Tiermodellen mit Unterbindung des Gallengangs

Gesunde weibliche Wistar-Ratten (180–220 g) und weibliche unhöfliche Mäuse (20–22 g) wurden von Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd. (Shanghai, China) bezogen. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Gesetzen und institutionellen Richtlinien durchgeführt. Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Shanghai Jiao Tong University (NO.SYXK2007-0025) genehmigt. Der Ductus choledochus wurde nach einer ursprünglich von Lee beschriebenen Methode mit einigen Modifikationen ligiert [34]. Kurz gesagt, diese Mäuse wurden mit Pentobarbital (25 mg/kg) anästhesiert und auf einem chirurgischen Holztuch fixiert. Es wurde ein mittlerer Bauchschnitt gemacht und das Bauchgewebe wurde sorgfältig getrennt, um das CBD deutlich freizulegen. Zwei sterile medizinische chirurgische Nylonnähte (Shanghai Jinhuan Industry CO., Ltd., Shanghai, China) mit einem Durchmesser von 0,2 mm wurden unter die CBD gelegt, und an beiden Enden eines Segments der CBD wurden drei Knoten hergestellt (Abb. 1b, c). Schließlich wurde das CBD dann zwischen den beiden Enden abgeschnitten, gefolgt vom endgültigen Verschluss des Abdomens. Am 14. Tag nach der Unterbindung des Hauptgallengangs wurden von jeder Maus Blutproben entnommen, um die Hauptfunktion der Leber zu testen.

Charakterisierung der dreieckigen Silbernanoplättchen. a UV-vis-Spektrum der hergestellten Lösung. b TEM-Aufnahme der gesammelten Silbernanopartikel nach der Zentrifugation. c Größenverteilung der ausgewählten dreieckigen Silbernanoplättchen (200 Nanopartikel aus TEM-Bild)

Injektion von Nanopartikeln in die Mäuse

Nach Abschluss der CBD-Ligation wurden 12 Mäuse zufällig in vier Gruppen eingeteilt:Kontrollgruppe 1, Silber-Nanoplatten-Testgruppe, magnetische Nanopartikel-Testgruppe und Gold-Nanocluster-Testgruppe. Eine zusätzliche Kontrollgruppe bestand aus fünf Mäusen ohne CBD-Ligation. Die Mäuse in den Kontrollgruppen wurden mit einer intravenösen Injektion von 0,9%iger wässriger NaCl-Lösung behandelt, während den Testgruppen eine Nanopartikelsuspension wie dreieckige Silbernanoplättchen, magnetische Nanopartikel, Goldnanostäbchen und Goldnanocluster in einer Dosis von 150 µl injiziert wurde ( 550 µg/ml). Alle vier Suspensionen von Nanopartikeln wurden vor der Verwendung durch Beschallung für 1 min frisch dispergiert. Die Mäuse wurden durch Inhalation von 5% Isofluran anästhesiert, bis sich der Muskeltonus entspannt hatte, dann wurden vier Arten von Nanopartikel-Suspensionen intravenös mit einer 1-ml-Spritze injiziert.

Verteilung von Nanopartikeln im Gewebe

Am siebten Tag nach Injektion der Metall-Nanopartikel-Suspension wurden die Mäuse anästhesiert und ihr Darmgewebe entnommen, 24 h in 10 % Formaldehyd fixiert und dann in Paraffin eingebettet. Ein Leica RM2135 Rotationsmikrotom wurde verwendet, um 5 µm dicke Schnitte der fixierten Proben herzustellen. Schließlich wurden die Schnitte mit Alkohol entwässert und in Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Die Schnitte der Proben wurden unter einem Phasenkontrastmikroskop (Olympus, RX-71, Japan) betrachtet.

Am siebten Tag nach Injektion der Metall-Nanopartikel-Suspension wurden die Darm- und Magengewebe unmittelbar nach dem Vertikutieren der Mäuse gesammelt und in 2,5% Glutaraldehydlösung fixiert. Die fixierten Proben wurden seriell in Ethanol dehydriert und mit Epoxidharz eingebettet. Danach wurde eine ultradünne Darmprobe hergestellt und mit hochauflösendem TEM (FEI, Tecnai G2 Spirit Biotwin, USA) beobachtet.

Am selben Tag wurde ihr Darmgewebe unmittelbar nach der Tötung entnommen und unter Verwendung eines In-vivo-Bildgebungssystems (IVIS-100-Bildgebungssystem, Caliper) in Verbindung mit einer kühlladungsgekoppelten (CCD) Kamera und einem rot fluoreszierenden Protein abgebildet (DsRed)-Filter (Caliper Life Sciences). Bilder und Messungen von Fluoreszenzsignalen wurden mit der Software Living Image 3.2 (Caliper Life Sciences) aufgenommen und analysiert.

Metallgehalt des Kots

Außerdem wurden alle Mäusefäkalien innerhalb von 7 Tagen nach der Injektion gesammelt, und die Fäkalien wurden gewogen und mit Königswasser unter Erhitzen verdaut. Schließlich wurde der Metallgehalt in der Lösung mit einem ICP-MS (Agilent 7500a, USA) bestimmt.

Herstellung chinesischer Kräuterextrakte

Sennablatt 10 g, Rhabarber 2 g und Fructus-Cannabisextrakte 1 g wurden zu 100 ml Wasser gegeben, 10 min auf 100 °C erhitzt und dann durch zwei Lagen Mull filtriert [35]. Schließlich wurden die Filtrate gesammelt und unter reduziertem Druck auf 0,3 µg/ml konzentriert. Die Extrakte aus Sennesblättern wurden wie unten beschrieben hergestellt und bei 4°C gelagert, bevor die Tests durchgeführt wurden.

Becherzellenanalyse

Zunächst wurden sechs männliche Kunming-Mäuse nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen aufgeteilt:die Kontrollgruppe und die Durchfallgruppe; beide wurden 7 Tage lang täglich mit Kochsalzlösung und chinesischen Kräuterextrakten über eine orale Sonde (0,1 ml) behandelt. Am siebten Tag nach der Verabreichung mit der Sonde wurden die Mäuse getötet, das Darmgewebe gesammelt und das Darm- und Magengewebe in Tissue Tek OCT eingefroren und auf einem Leica CM 1510 S Kryostat (Sakura Funetek, USA) geschnitten. Die 8 µm Schnitte wurden in Alcian Blue (1% Alcain Blue 8GX in 3% Eisessig) 5 min gefärbt und schließlich in destilliertem Wasser gespült. Diese Probe wurde vor dem Waschen in 1 % Periodsäure oxidiert und dann 15 min in Schiffs Reagens behandelt. Bilder der Gewebeschnitte wurden unter Verwendung eines inversen Mikroskops aufgenommen. Das Magengewebe wurde auf positiv geladenen Objektträgern für die Zwei-Photonen-Lumineszenz-Bildgebung gesammelt.

Goldgehalt des Darmgewebes und des Kots

Kurz gesagt, wurden 9 männliche Kunming-Mäuse in jede der drei Gruppen gemäß der unterschiedlichen Behandlung eingeteilt:Kontrollgruppe, Ligationsgruppen und Ligations-+Diarrhö-Gruppen. Dann wurden diesen Mäusen 100 µl GNRs (1 µg/ml) intravenös injiziert. Am zweiten Tag nach der Schwanzveneninjektion wurden die Kontroll- und Ligaturgruppen mit Kochsalzlösung behandelt, gleichzeitig wurden die Ligations- und Durchfallgruppen mit chinesischen Kräuterextrakten behandelt. Die Behandlungsdosis wurde konstant gehalten und über die folgenden 7 Tage täglich per Schlundsonde (0,1 ml) verabreicht. Am siebten Tag wurden die Mäuse getötet und die Darmgewebe in Tissue Tek OCT eingefroren und auf einem Leica CM 1510 S Kryostat (Sakura Funetek, USA) geschnitten. Schnitte (8 µm) wurden auf positiv geladenen Objektträgern für die Zwei-Photonen-Lumineszenz-Bildgebung gesammelt. Alle Mäusefäkalien wurden nach der Injektion gesammelt. Der Kot wurde gewogen und mit Königswasser unter Erhitzen verdaut. Schließlich wurde der Goldgehalt in der Lösung mit einem ICP-MS (Agilent 7500a, USA) bestimmt.

Statistische Analyse

Jedes Experiment wurde dreimal im Doppel wiederholt. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert  ± SD dargestellt. Statistische Unterschiede wurden mit dem t . ausgewertet getestet und berücksichtigt bei P < 0.05.

Ergebnisse und Diskussion

Synthese und Charakterisierung der Nanopartikel

Dreieckige Silbernanoplättchen wurden durch schnelle thermische Syntheseverfahren synthetisiert und zeigten eine gute Wasserlöslichkeit. Noch wichtiger ist, dass die besondere dreieckige Form dieser Nanopartikel die Identifizierung durch Elektronenmikroskopie erleichtert. Wie in Abb. 1 gezeigt, zeigten präparierte Silbernanopartikel im UV-Vis-Spektrum einen starken Peak bei 648,5 nm, der dem in der Ebene liegenden Dipoloberflächenplasmonenband entspricht, und zwei bescheidene Peaks bei niedrigeren Wellenlängen, entsprechend dem in der Ebene liegenden (482 .). nm) und Quadrupolresonanzen außerhalb der Ebene (333 nm), was auf die Bildung einer Dreiecksarchitektur hindeutet [36], was durch das TEM-Bild der nach der Zentrifugation gesammelten Silbernanopartikel weiter bestätigt wird. Eine TEM-Aufnahme (Abb. 1b) zeigte, dass die vorbereiteten Chargen eine Subpopulation von Silbernanokügelchen enthielten, die möglicherweise zum SPR-Peak bei 389 nm beitrugen [36]. Die Kantenlänge der gerafften dreieckigen Silbernanoplättchen betrug 44,3 nm mit guter monodisperser Verteilung.

Magnetische Nanopartikel mit 20 nm Durchmesser und Au-Nanocluster mit 5 nm Durchmesser wurden hergestellt und ihre Charakterisierung ist in Zusatzdatei 1:Abbildung S1 bzw. S2 dargestellt. Die TEM-Bilder und UV/Vis-Spektren von Au-Nanostäbchen sind in Zusätzliche Datei 1:Abbildung S3.

Vorbereitung der CBD-Ligationsmäusemodelle

Die Ligation des Gallengangs (CBD) ist ein bekanntes experimentelles Modell, das verwendet wird, um eine cholestatische Fibrose der Leber zu induzieren [37, 38]. Hier führten wir Experimente an Mäusen mit CBD-Ligation durch, um die Verbindung zwischen HBS und Darmtrakt vollständig zu blockieren (Abb. 2a, b), um sicherzustellen, dass Metall-Nanoplatten nach intravenöser Injektion nur über den Blutkreislauf in das Darmgewebe transportiert wurden. Im Vergleich zu normalen Kontrollen zeigten die behandelten Gruppen 14  Tage nach CBD-Ligation aufgrund von Gallenstauung eine starke Zunahme des Durchmessers und der Dicke der Wand des Hauptgallengangs (Abb. 2d). Darüber hinaus waren, wie in Abb. 2e gezeigt, die TBIL- und AST-Spiegel in der Ligaturgruppe signifikant höher als in der Kontrastmittelgruppe. Diese Ergebnisse legten nahe, dass nach dem erfolgreichen Aufbau des CBD-Ligations-Mäusemodells der Hauptgallengang absolut blockiert war und dass die Verbindung zwischen HBS und dem Darmtrakt vollständig abgeschnitten war, wodurch Cholestase und cholestatische Fibrose der Leber induziert wurden [39].

a Eine schematische Darstellung der Beziehungen von HBS zum Darmtrakt. b, c Ligation von CBD (weiße Pfeile). d CBD-Schwellung am 14. Tag nach CBD-Ligation (weißer Pfeil). e Untersuchung der wichtigsten Leberfunktion. *P < 0.05

Die Wirkung von vier Arten von Nanopartikeln auf das Darmgewebe

Normalerweise stellt das Darmepithel eine semipermeable Barriere bereit, die es kleinen Mengen von Molekülen unterschiedlicher Größe und Eigenschaften ermöglicht, das intakte Epithel sowohl durch aktive als auch durch passive Mechanismen zu durchdringen. Im Allgemeinen gilt:Je größer das Molekül, desto geringer ist die Wahrscheinlichkeit, dass es diese Barriere überschreitet. Sobald die Darmschleimhaut jedoch entzündet oder beschädigt ist, wird es für das Darmepithel schwieriger, fremde und große Partikel fernzuhalten, da sich die Räume zwischen den Zellen öffnen [40, 41]. In Anbetracht der Tatsache, dass Nanopartikel die Ursache für die pathologischen Veränderungen des Darmgewebes und die daraus resultierende Erhöhung der Durchlässigkeit der Darmwand sein können, die dazu führt, dass die Nanopartikel die Darmwand passieren, haben wir eine histopathologische Untersuchung des Darmgewebes nach Exposition gegenüber vier verschiedene Arten von Nanopartikeln:magnetische Nanopartikel, Silberdreieck-Nanopartikel, Gold-Nanostäbe und Gold-Nanocluster. Wie in Abb. 3 gezeigt, wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen Kontrollgruppe und Testgruppe beobachtet, noch gab es andere histologische Veränderungen wie entzündliches Infiltrat [42]. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Metallnanopartikel keine pathologischen Veränderungen des Darmgewebes verursachten, wodurch die Möglichkeit ausgeschlossen wurde, dass Nanopartikel aus den Zwischenräumen zwischen den Zellen austreten.

Histopathologischer Schliffbild verschiedener Darmgewebeproben von Mäusen mit CBD-Ligation. a Kontrollgruppen:Mäuse, die mit Kochsalzlösungsinjektion über Schwanzvenen behandelt wurden (obere Felder). b Testgruppen:Mäuse, die mit einer dreieckigen Silber-Nanoplatten-Suspension behandelt wurden, die über die Schwanzvenen injiziert wurde (untere Felder)

Verteilung von Metall-Nanopartikeln in Darm-GCs

GCs sind eine der vier Hauptzelltypen, die im gesamten Darmtrakt vorkommen und für die Produktion und Erhaltung einer schützenden Schleimdecke verantwortlich sind, indem sie hochmolekulare Glykoproteine, sogenannte Muzine, synthetisieren und sezernieren, die die Ausscheidung von Darminhalt fördern und stellen die erste Verteidigungslinie gegen physikalische und chemische Schäden dar, die durch aufgenommene Nahrung, Mikroben und das mikrobielle Produkt verursacht werden [43, 44]. Die GCs waren aufgrund ihres hohen Schleimgehalts leicht zu identifizieren. Wie in Abb. 6 gezeigt, befanden sich die dreieckigen Silbernanoplättchen innerhalb der Darm-GCs im gesamten Darmtrakt, und die verschiedenen Phasen ihrer Sekretion aus den GCs konnten ermittelt werden. Abbildung 4d zeigt, wie einige dreieckige Silbernanoplättchen von einem GC nach außen und in den Darm sezerniert wurden. Abbildung 4e zeigt, dass einige dreieckige Silbernanoplättchen, die in den Schleiminhalt der intestinalen GCs eingekapselt waren, zur Sekretion bereit waren. In Abb. 4f ist dargestellt, wie einige dreieckige Silbernanoplättchen aus einem GC ausgestoßen wurden, während andere noch darin waren. Aus den TEM-Bildern fanden wir, dass einige dreieckige Silbernanoplättchen in einem Aggregationsmodus (Abb. 4 (a2, d und e), grüne Pfeile) gezeigt wurden, während andere sich in einem Dispersionsmodus befanden (Abb. 4 (a1, b1, b2, c1, c2 und f), weiße Pfeile). Aggregation ist ein häufiges Phänomen von Nanopartikeln und wird im Allgemeinen beobachtet, wenn ihre Konzentration in Zellen stark erhöht ist [45]. Im Gegenteil, eine Abnahme der Konzentration von Nanopartikeln verhindert deren Aggregation.

Verteilung von dreieckigen Silbernanoplättchen in intestinalen GCs von Mäusen mit CBD-Ligation. Die Mäusegruppe mit CBD-Ligation wurde mit dreieckigen Silber-Nanoplatten behandelt, die 7 Tage nach der Ligation über die Schwanzvene injiziert wurden. Darm-GCs verschiedener Darmgewebe. A Duodenum, dreieckige Silber-Nanoplättchen wurden in einem Aggregationsmodus (grüner Pfeil) gezeigt, während einige dreieckige Silber-Nanoplättchen in einem Dispersionsmodus waren (weiße Pfeile). B Jejunum, dreieckige Silbernanoplättchen am Darm-GC (weiße Pfeile). C Ileum und einige dreieckige Silber-Nanoplättchen wurden ausgeschieden, während einige noch drin waren. D Im Dickdarm wurden einige dreieckige Silbernanoplättchen nach außen und in den Darm sezerniert. E , F Rektum, einige dreieckige Silbernanoplättchen waren bereit zur Ausscheidung (Dispersionsmodus, weiße Pfeile), während andere noch im Inneren waren (Aggregationsmodus, weißer Pfeil)

Ähnliche Ergebnisse wurden für Gold-Nanocluster, magnetische Nanopartikel und Gold-Nanostäbchen beobachtet, wie in Zusätzliche Datei 1 gezeigt:Abbildung S4, S5 und S6. Diese Ergebnisse zeigten eindeutig, dass sich diese drei Arten von Metallnanopartikeln in den GCs des Darmtrakts befinden, was indirekt unterstützt, dass diese Metallnanopartikel durch den GCs-Pfad entfernt werden können.

Obwohl GCs entlang der gesamten Linie des Darmtrakts verteilt sind, ist ihr Beitrag zum gesamten Epithelvolumen nicht identisch. Im Dünndarm von Mäusen nimmt die Volumendichte der GCs vom Duodenum zum Ileum progressiv zu. Dieser Trend setzt sich im Dickdarmtrakt fort, wobei die Dichte der GCs im Kolonepithel ebenfalls von proximal nach distal, vom Kolon zum Rektum, zunimmt [43]. Basierend auf der Tatsache, dass dreieckige Silber-Nanoplättchen, magnetische Nanopartikel und Gold-Nanocluster in den Darm-GCs im gesamten Darmtrakt existierten und der Beitrag der GCs zum gesamten Epithelvolumen völlig unterschiedlich ist, glauben wir, dass der Dickdarm der wichtigste sein könnte Ausscheidungsort für den Ausscheidungsweg der intestinalen GCs.

Aufgrund ihrer charakteristischen Form konnten dreieckige Silbernanoplättchen leicht durch TEM-Bildgebung an den Stellen unterschieden werden, die im vorgeschlagenen Weg zum Erreichen der GCs beschrieben wurden. Obwohl magnetische Nanopartikel und Gold-Nanocluster mit dieser Technik nicht von anderen Strukturen unterschieden werden konnten, zeigt zusätzliche Datei 1:Abbildung S4, dass der Darmtrakt der CBD-Ligationsgruppe immer noch eine gewisse Menge an Gold-Nanoclustern enthält, was uns zu dem führt. Schlussfolgerung, dass der oben erwähnte Mechanismus der GC-Ausscheidung auch auf andere Arten von Metallnanopartikeln angewendet wird.

Darüber hinaus zeigen die ICP-MS-Ergebnisse, wie in Zusätzliche Datei 1:Abbildung S7 gezeigt, eindeutig, dass diese Nanopartikel immer noch vom Ligationsmäusekörper sezerniert werden können. Diese Ergebnisse bewiesen, dass die Becherzellen des Darmgewebes an einem wichtigen Weg zur Ausscheidung von Nanopartikeln beteiligt sind.

Potenzieller Mechanismus des Transports von Metall-Nanopartikeln in das Darmblutgefäß

Die oben erwähnten Ergebnisse zeigen, dass diese vier Arten von Metall-Nanopartikeln (magnetische Nanopartikel, Silberdreieck-Nanopartikel, Gold-Nanostäbchen und Gold-Nanocluster) in den GCs im gesamten Darmtrakt verteilt waren, aber die Art und Weise, wie die Nanopartikel in die GCs eintreten, war immer noch nicht so aufgeklärt. Da die Mausmodelle mit CBD-Ligation mittels Schwanzveneninjektion mit einer Suspension von Metall-Nanopartikeln behandelt wurden, konnten diese Nanopartikel nur durch den Blutfluss in die Darmgefäße transportiert werden. Wie durch TEM-Bildgebung gezeigt, befanden sich tatsächlich einige dreieckige Silbernanoplättchen im Blutkörperchen (Abb. 5a, weiße Pfeile). Darüber hinaus haben frühere Studien gezeigt, dass Nanopartikel mit geringer Größe von den Blutkörperchen in das gesamte Kreislaufsystem abgegeben werden können [46]. In Abb. 5b ist zu sehen, dass einige dreieckige Silbernanoplättchen die Membran der Blutgefäße durchdringen (grüne Pfeile), während sich einige dreieckige Silbernanoplättchen in den Blutkörperchen befanden (rote Pfeile). Daraus schließen wir, wie Abb. 8 zeigt, dass dreieckige Silbernanoplättchen von den Blutkörperchen transportiert und dann in das Plasma abgegeben wurden, gefolgt von der Membran der Gefäßwand der Darmgefäße und schließlich bei den GCs ankamen.

Distribution of triangular silver nanoplates in the intestinal vessels of mice with CBD ligation. a Triangular silver nanoplates located in the blood corpuscle (white arrows). b Triangular silver nanoplates penetrated into the vascular wall (green arrows), while some located in the blood corpuscle (red arrows)

Goblet Cell Analysis Assay

Goblet cells play a key role in the excretion pathway of nanoparticles. In this study, we found that metal nanoparticles can be secreted from these goblet cells. Following this statement, if the secretion process of the goblet cells is accelerated, it would theoretically be possible that the excretion of nanoparticles will also increase. To address this, we established a diarrhea model induced by a Chinese herb used in traditional medicine. In order to explore how diarrheic processes influence the secretion of GCs, a histological analysis of the intestinal GCs was conducted. It must be acknowledged that an increased number of intestinal tissue goblet cells increases the mucin production [47]. As shown in Fig. 6, in the diarrhea groups, the total number of goblet cells in the small intestinal and the large intestinal were significantly higher compared to the controls. In addition, the percentage and number of cavitated goblet cells in the intestinal tissues were significantly higher in the diarrhea groups compared to the controls. These observations let us assert that the amount of intestinal tissue cells increases in response to diarrhea, suggesting an increased excretion by the GCs. These results are consistent with data reported previously [47].

Photomicrographs of intestinal tissue stained with Alcian Blue/Schiff’s reagent to visualize goblet cells. Images are representative of mice treated with saline (Ligation groups) and senna leaf (ligation + diarrhea groups) with arrows indicating non-cavitated goblet cell (green arrow) and cavitated goblet cell (red arrow) secreting mucin. All bars are 100 μm

Gold Contents of the Intestinal Tissues and the Feces

It has been reported that the two-photon action cross-section (TPACS) of a nanorod can reach 2320 GM, which is much higher than that of organic fluorophores and within the range of that of quantum dots, providing a promising approach to detect the distribution of the gold nanorods in biological tissues using two-photon excitation [48, 49]. In this part of the study, in order to observe the intestinal distribution of nanoparticles in the ligation groups and the ligation + diarrhea groups, two-photon luminescence of the AuNRs core was measured. As shown in Fig. 7, the gold contents of small and large intestinal were significantly higher for the ligation groups compared with those observed in ligation + diarrhea groups. The gold elemental contents in intestinal tissues were quantified by ICP-MS 7 days after tail vein injection. The gold contents of intestinal tissues were significantly higher in the ligation groups compared to that in the ligation + diarrhea groups (P  < 0.001) throughout the study (Fig. 7). These results indicate that the level of excreted nanoparticles by the goblet cells of the diarrhea groups is higher than that of any of the other groups.

Two-photon-laser scanning confocal microscopy images of intestinal tissue sections at 7 days after tail vein injection of GNRs (excitation 780 nm, emission 601–657 nm)

In the next experiment, we analyzed the gold contents in the feces of mice. As shown in Fig. 8a, the gold contents of feces were significantly higher in the control group compared to that in the ligation groups or the ligation + diarrhea groups (P < 0,001). Moreover, in the ligation + diarrhea groups, the gold contents were significantly higher than in the ligation groups (Fig. 8a). These results suggest that diarrhea accelerates the process of nanoparticles being secreted by the intestinal goblets cells. Combined with quantitative analysis of gold elements in feces, we further proved that the goblet cells of intestinal tissues are involved in an important pathway for the excretion of nanoparticles.

Content of GNRs at the intestinal tissues 7 days after injection (a ), and gold element content of feces (b ) based on ICP-MS analysis. ***P  < 0.01, showing a significant difference between ligation groups and ligation + diarrhea groups

Effects of Parietal Cells on Gastric Secretion of Metal Nanoparticles

Parietal cells are mainly distributed in the bottom of the stomach and the gastric body, which secrete hydrochloric acid and internal factor. Furthermore, we found that gold nanoclusters distributed in the gastric tissues of mice with CBD ligation (Additional file 1:Figure S4B). Therefore, we hypothesized that parietal cells may be involved in the excretion of nanoparticles. As expected, from two-photon luminescence images, it was found that gold nanorods are distributed in the gastric tissues (Fig. 9a, b). In addition, as Fig. 9c, d shows, we observed that triangular silver nanoplates are distributed in the parietal cells of gastric tissue. Combined with the previous research results, we speculate that the parietal cells are involved in the secretion of nanoparticles.

Distribution of nanoparticles in the gastric tissue. (a ) und (b ):Two-photo-laser scanning confocal microscopy images of intestinal tissue sections 7 days after tail vein injection of GNRs (Excitation:780 nm, Emission:601-657 nm). (c ) TEM image of the gastric parietal cells; (d ) Triangular silver nanoplates located in the gastric parietal cells (white arrows)

Conclusions

In summary, we successfully prepared and applied triangular silver nanoplates, magnetic nanoparticles, gold nanorods, and gold nanoclusters as tracking agents. Mice with CBD ligation were treated with the previously prepared nanoparticles via tail vein injection to study the gastric-intestinal tissue distribution and excretion of these nanoparticles. We also analyzed the excretion pathways of gold nanoclusters and magnetic nanoparticles. It must be stated that gold nanoclusters are mainly cleaned away via kidney urinary pathway, whereas magnetic nanoparticles are mainly removed from the organism via HBS pathway. As the excretory capabilities of kidney and HBS for in vivo applications of metal nanoparticles are very limited, the GCs and PCs excretion pathway may provide another important alternative way for the excretion of these nanoparticles. Concerning this issue, we also found that the process of nanoparticles secreted from GCs and PCs is accelerated by diarrhea, further proving that the GCs and PCs represent an important pathway for the excretion of metal nanoparticles. Admittedly, our knowledge is still limited with respect to the in vivo clearance of nanoparticles as, for example, the concrete mechanism underlying the GCs and PCs secretion pathways, and the clearance efficiency of nanoparticles in intestinal GCs, thus further investigations are urgently needed. To sum up, this novel pathway of in vivo clearance of metal nanoparticles has great potential in short-term applications such as new drug design and development, nanoparticle-based labeling and in vivo tracking, and biosafety evaluation of in vivo nanoparticles.

Abkürzungen

CBD:

Common bile duct

CCD:

Charge-coupled device

GCs:

Goblet cells

GNRs:

Gold nanorods

HBS:

Hepato-biliary

PCs:

Parietal cells

System Fe₃ O₄ :

Superparamagnetic magnetite

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

TPACS:

Two-photon action cross-section