Optimierung der Probenvorbehandlung für sp-ICP-MS: Aufdeckung der Silbernanopartikel-Verteilung in biologischen Geweben

Zusammenfassung

Die rasante Verbreitung technisch hergestellter Nanopartikel (ENPs) hat die menschliche Exposition erhöht, doch aktuelle Analysetools können ENPs in biologischen Matrizen nicht gleichzeitig quantifizieren und charakterisieren. Einzelpartikel-induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie (sp-ICP-MS) bietet simultane Quantifizierung und physikalische Eigenschaftsbewertung, aber ihre Anwendung auf Gewebe ist durch unzureichende Vorbehandlungsprotokolle begrenzt, die Partikelintegrität verändern oder die Rückgewinnung verringern können. In dieser Studie evaluierten wir systematisch fünf Lösungsmittel – Natriumhydroxid (NaOH), Tetramethylammoniumhydroxid (TMAH), Salpetersäure (HNO₃), Salzsäure (HCl) und Proteinase K – mit Silbernanopartikeln (nAg) als Modellsystem. NaOH-Behandlung erreichte >90 % Gewebeauflösung bei Erhalt der Partikelgröße und Minimierung der Ionisierung, und übertraf damit die anderen Reagenzien. Die Erweiterung des NaOH-Protokolls auf Herz-, Lungen-, Milz- und Nierenhomogenate bestätigte seine breite Anwendbarkeit. Schließlich wandten wir die optimierte Vorbehandlung an, um das Schicksal intravenös verabreichter nAg versus Ag⁺ in Mäuseblut und -leber zu untersuchen. sp-ICP-MS zeigte, dass nAg in der Leber weitgehend partikulär (~80 %) blieb, aber im Blutstrom ionisierte (~95 %), während Ag⁺ in beiden Kompartimenten ionisch blieb. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass NaOH-Vorbehandlung genaue sp-ICP-MS-Analysen von ENPs in vivo ermöglicht und die Bedeutung der Partikel-zu-Ion-Umwandlung für die Bestimmung von Biodistribution und Kinetik hervorhebt.

Einleitung

Fortschritte in der Nanotechnologie haben die Produktion technisch hergestellter Nanopartikel (ENPs) unter 100 nm beschleunigt, die einzigartige Vorteile wie verbesserte Gewebepenetration und reaktive Oberflächen bieten. Silbernanopartikel (nAg) werden weit in Konsumgütern und Pharmazeutika eingesetzt, geschätzt für ihre anhaltende Ag⁺-Freisetzung und leitenden Eigenschaften. Doch dieselben nanoskaligen Attribute, die Funktionalität verleihen, können auch Gesundheitsrisiken bergen, einschließlich Blut-Hirn-Schranken-Störung und Entzündungsreaktionen. Angesichts der Allgegenwart von ENPs bleibt eine rigorose Bewertung sowohl von Gefahr als auch Exposition – gemeinsam das ENP-Risiko definierend – essenziell.

Während umfangreiche Forschung zur ENP-Toxizität vorliegt, haben weniger Studien tatsächliche Expositionszenarien quantifiziert. Neuere Arbeiten zeigten unterschiedliche intrazelluläre Verteilungen für nAg versus Ag⁺ in Zellkulturen, was die Notwendigkeit unterstreicht, Partikel von Ionen in Geweben zu differenzieren. Konventionelles ICP-MS quantifiziert Gesamtmetallgehalt, kann aber Partikel- versus Ionenarten nicht auflösen, während TEM Größendaten liefert, aber quantitative Fähigkeiten fehlen. Daher ist eine Methode, die präzise Quantifizierung mit physikalischer Eigenschaftsanalyse koppelt, kritisch für die Aufklärung von ENP-Biotransformation.

Einzelpartikel-ICP-MS (sp-ICP-MS) kann einzelne Partikel detektieren, liefert Größenschätzungen aus Spitzenintensität und Konzentration aus Spitzenhäufigkeit, während Ionen über Hintergrundsignalanalyse unterschieden werden. Vorherige Studien wandten sp-ICP-MS auf Umwelt- und Handelsproben an, aber die Nutzung in biologischen Geweben war begrenzt, weitgehend aufgrund unzureichender Vorbehandlung, die ENPs degradieren oder verändern kann. Unterschiedliche Lösungsmittel variieren in ihrer Fähigkeit, Gewebe zu lysieren, ENPs zurückzugewinnen und Partikelintegrität zu bewahren. Diese Studie bewertet und optimiert daher Vorbehandlungsstrategien für sp-ICP-MS-Analyse von nAg in Mausgeweben, um einen zuverlässigen Workflow für simultane Quantifizierung und physikalische Eigenschaftsbewertung von ENPs in vivo zu etablieren.

Materialien und Methoden

ENPs

Die 30, 70 und 100 nm Biopure nAg (nAg30, nAg70, nAg100) wurden von nanoComposix (San Diego, CA, USA) bezogen. RM8013, ein Standard für Transport-Effizienz-Kalibrierung, wurde vom National Institute of Standards and Technology (Gaithersburg, MD, USA) erhalten. Alle ENP-Suspensionen wurden 10 min vor Gebrauch soniziert.

Reagenzien

Lösungen von 0,1 mol L⁻¹ NaOH, 25 % TMAH, 30 % HCl und Proteinase K wurden von Wako (Osaka, Japan) gekauft. Eine 70 % HNO₃-Lösung stammte von Kanto Kagaku (Tokyo, Japan).

Tiere

Weibliche BALB/c-Mäuse (6 Wochen alt) wurden von Japan SLC (Shizuoka, Japan) bezogen. Mäuse wurden unter 12-h Licht/Dunkel-Zyklus mit ad libitum Zugang zu Futter und Wasser gehalten. Alle Verfahren entsprachen den ethischen Richtlinien der Osaka-Universität, Japan.

Messung der Partikelgrößenverteilung durch Dynamische Lichtstreuung

nAg wurde in MilliQ-Wasser auf 10 µg mL⁻¹ Ag verdünnt. Ein 1 mL Aliquot wurde in eine Zeta-Kapillarzelle (Malvern Instruments) gegeben und auf einem Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments) analysiert, um mittleren Durchmesser und Zeta-Potenzial zu bestimmen.

Messung der Gesamtmasse von Ag

Gesamt-Ag-Konzentrationen wurden auf einem Agilent 7700x ICP-MS (Agilent Technologies) gemessen. Betriebsbedingungen: HF-Leistung 1550 W, Ar-Fluss 1,05 L min⁻¹, Verweilzeit 100 ms. Rhodium diente als interner Standard. Messungen wurden in Triplicate durchgeführt.

Analyse von sp-ICP-MS und Berechnung

sp-ICP-MS-Analyse nutzte dasselbe Instrument mit HF-Leistung 1550 W, Ar-Fluss 1,05 L min⁻¹, Verweilzeit 10 ms und Gesamtlaufzeit 30 s. Partikelgrößenberechnungen employed das Einzelpartikel-Tool von RIKILT.

Kritische Partikelkonzentration für sp-ICP-MS

nAg-Stocklösungen (1,0 mg mL⁻¹) wurden seriell verdünnt, um 2000, 800, 700 und 600 pg mL⁻¹ Lösungen zu erzeugen, die weiter zehnfach verdünnt wurden, um 40 distincte Konzentrationen für sp-ICP-MS-Evaluation zu generieren.

Optimierung der Vorbehandlungsmethoden für Mausleber

Leberhomogenate wurden durch Mischen von Gewebe mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, w/v = 1:10) und Homogenisieren hergestellt. Jedes Homogenat wurde mit 100 ng mL⁻¹ nAg gespiked und dann mit einem der folgenden Reagenzien im 1:1 v/v-Verhältnis behandelt: 0,1 mol L⁻¹ NaOH, 25 % TMAH, 30 % HCl oder Proteinase K (10 U mL⁻¹ in 0,01 M Tris-HCl, 0,01 M EDTA, 0,5 % SDS). Proben wurden 3 h bei 37 °C inkubiert, Rückstände gesammelt, gewogen und Überstände 500-fach für sp-ICP-MS verdünnt.

Vielseitigkeitsbewertung der NaOH-Vorbehandlung in verschiedenen Organen

Herz-, Lungen-, Milz- und Nierengewebe wurden in PBS (w/v = 1:10) homogenisiert und mit 100 ng mL⁻¹ nAg gespiked. Eine 1 mol L⁻¹ NaOH-Lösung wurde im 1:1 v/v-Verhältnis zugegeben, und Proben wurden 3 h bei 37 °C inkubiert. Rückstände wurden gewogen und Überstände 500-fach für sp-ICP-MS verdünnt.

Bewertung von Menge und physikalischen Eigenschaften von nAg₁₀₀ und Ag⁺ in Mäusen nach einmaliger intravenöser Verabreichung

nAg₁₀₀ und AgNO₃ wurden auf 0,25 mg mL⁻¹ (Ag⁺) in 5 % Glucose verdünnt. Mäuse erhielten intravenöse Injektionen von nAg₁₀₀ (1,5 oder 0,75 mg kg⁻¹), AgNO₃ (1,5 oder 0,75 mg kg⁻¹ als Ag⁺) oder 5 % Glucose (Kontrolle). 24 Stunden post-Injektion wurden Blut- und Leberproben gesammelt. Leberhomogenate wurden in PBS (w/v = 1:10) hergestellt und dann mit TMAH oder NaOH (1:1 v/v) für ICP-MS und sp-ICP-MS-Analyse behandelt.

Ergebnisse und Diskussion

Optimierung der Partikeldetektion durch sp-ICP-MS

Genaues sp-ICP-MS erfordert, dass nicht mehr als ein Partikel während jeder Verweilzeit in das Plasma eintritt; andernfalls werden mehrere Partikel fälschlicherweise als einzelnes Ereignis summiert, was Größenschätzungen aufbläht. Wir verdünnten nAg₁₀₀ seriell und trugen detektierte versus theoretische Partikelzahlen auf. Während niedrige Konzentrationen eine lineare Beziehung ergaben, lieferten höhere Konzentrationen weniger detektierte Ereignisse als erwartet, was Mehrpartikel-Interferenz anzeigt (Abb. 1a). Subtraktion der detektierten von den theoretischen Werten zeigte, dass Abweichungen signifikant wurden, wenn detektierte Ereignisse 500 überschritten, was einen praktischen Schwellenwert für zuverlässige Analyse etabliert (Abb. 1b).

Bestimmung der optimalen Partikelzahl pro Verweilzeit für genaue sp-ICP-MS-Analyse. Eine Reihe von nAg-Lösungen (600 fg mL⁻¹ bis 2.500 pg mL⁻¹) wurde per sp-ICP-MS analysiert. a Um die Beziehung zwischen nAg₁₀₀-Konzentration und detektierter Partikelzahl zu bestimmen, wurden eine Kurve für detektierte Partikel (durchgezogene Linie) und theoretische Werte (gestrichelte Linie) geplottet. b Die Anzahl der detektierten Partikel subtrahiert vom theoretischen Wert wurde auf der vertikalen Achse geplottet, um die optimale Partikelzahl zu bestimmen. Jeder Punkt ist das Ergebnis eines einzelnen Versuchs (n = 1).

Validierung mit nAg variierender Durchmesser bestätigte, dass die sp-ICP-MS-Einstellungen genaue Größenschätzungen lieferten: gemessene Durchmesser von 30,0 ± 1,2 nm, 65,1 ± 0,6 nm und 97,4 ± 0,6 nm für nAg30, nAg70 und nAg100. Dynamische Lichtstreuung (DLS)-Messungen (36,4 ± 1,6 nm, 70,6 ± 1,7 nm, 101 ± 1,0 nm) stimmten eng mit sp-ICP-MS-Ergebnissen überein, was das analytische Protokoll validierte.

Optimierung der Vorbehandlungsmethoden für Detektion von nAg in Mauslebergewebe

Effektive Vorbehandlung muss Gewebe lysieren, ENPs ohne Veränderung ihres physikalischen oder chemischen Zustands zurückgewinnen und Ionisierung oder Aggregation vermeiden. Wir verglichen fünf Lösungsmittel – NaOH, TMAH, HNO₃, HCl und Proteinase K – mit Leberhomogenaten, gespiked mit 100 ng mL⁻¹ nAg.

Rückstandsanalyse zeigte, dass NaOH, TMAH und Proteinase K >90 % der Lebermatrix auflösten, während HNO₃ und HCl nur ~75 % auflösten (Abb. 2a). Da ~80 % des Gewebes Wasser ist, deutet die geringere Auflösung durch saure Reagenzien auf unvollständige Matrixentfernung hin.

sp-ICP-MS-Rückgewinnungsdaten zeigten, dass saure Behandlungen nAg vollständig ionisierten, während Proteinase K es teilweise ionisierte. Im Gegensatz dazu bewahrten NaOH und TMAH nAg als intakte Partikel mit vernachlässigbarer Ionendetektion (Abb. 2b). Größenverteilungsanalyse zeigte, dass TMAH-Behandlung einen Shift von 100 nm auf 120 nm und Verbreiterung der Verteilung verursachte (Abb. 2c-d), was Aggregation nahelegt. NaOH-Behandlung behielt die ursprüngliche 100 nm Größe bei (Abb. 2c-d), was ihre Eignung bestätigt.

NaOH-Vorbehandlung ist die optimale Methode für Detektion von nAg₁₀₀ in Mausleber. Fünf Lösungsmittel wurden als Vorbehandlungslösungen gescreent, um Gewebe zu lysieren (NaOH, TMAH, HNO₃, HCl und Proteinase K). Das Leberhomogenat wurde mit nAg₁₀₀-Lösung gemischt, um eine finale Ag-Konzentration von 100 ng mL⁻¹ zu erhalten und mit jedem Lösungsmittel bei 37 °C behandelt. Nach 3 h: a Rückstandsraten in jeder Gruppe als Indikator für Gewebeauflöslichkeit, b Rückgewinnungsraten (schwarze und weiße Balken stellen die Rate des als Partikel und als Ionen detektierten Silbers dar), c durchschnittliche Partikeldurchmesser im Balkendiagramm und d Partikelgrößenverteilung im Bienenwarm-Chart wurden per sp-ICP-MS analysiert. Ergebnisse als Mittelwert ± SD (n = 3).

TMAHs Tendenz, die Dielektrizitätskonstante durch Zersetzung in Trimethylamin und Methanol zu erhöhen, kann das Zeta-Potenzial von nAg verringern und Aggregation fördern. Kurzzeitige (1 min) TMAH-Exposition bewahrte jedoch Partikelgröße (~100 nm), was bestätigt, dass verlängerte Behandlung für Aggregation verantwortlich ist.

Bewertung der Vielseitigkeit der NaOH-Vorbehandlung in verschiedenen Organen

Um NaOHs breite Anwendbarkeit zu bestätigen, wandten wir das Protokoll auf Herz-, Lungen-, Milz- und Nierenhomogenate an, gespiked mit nAg. Rückstandsanalyse zeigte >95 % Auflösung (Abb. 3a). sp-ICP-MS detektierte das zugesetzte Ag als Partikel in allen Geweben, mit Rückgewinnungsraten im 80–120 %-Bereich, akzeptabel nach FDA-Standards (Abb. 3b). Partikeldurchmesser blieben in allen Organen nahe 100 nm (Abb. 3c-d), was die Konsistenz der Methode unterstreicht.

NaOH-Vorbehandlung ist die optimale Methode für Detektion von nAg₁₀₀ in verschiedenen Organen. Wie in Abb. 2 wurden Herz-, Nieren-, Lungen- und Milzhomogenate mit nAg₁₀₀ gemischt und mit NaOH-Lösung inkubiert. Nach 3 h wurden a Rückstandsraten (schwarze und weiße Balken: Rückstandsraten in NaOH- bzw. PBS-Behandlung), b Rückgewinnungsraten (schwarze und weiße Balken: Rate von Ag als Partikel bzw. Ionen detektiert), c durchschnittliche Partikeldurchmesser im Bienenwarm-Chart und d Partikelgrößenverteilung im Bienenwarm-Chart per sp-ICP-MS in jedem Gewebeproben analysiert. Ergebnisse als Mittelwert ± SD (n = 3).

Diese Daten bestätigen gemeinsam, dass NaOH-Vorbehandlung eine robuste, reproduzierbare Plattform für Quantifizierung und Charakterisierung von nAg in diversen Tiergeweben via sp-ICP-MS bietet.

Bewertung von sp-ICP-MS für quantitative und physikalische Eigenschaftsanalysen von nAg und Ag⁺ in biologischen Geweben

Um praktische Relevanz zu demonstrieren, verglichen wir das Schicksal intravenös verabreichter nAg₁₀₀ versus Ag⁺ in Mäuseblut und -leber. ICP-MS bestätigte Ag-Präsenz in beiden Kompartimenten für beide Behandlungen (Abb. 4a,b). sp-ICP-MS offenbarte jedoch distinkte Speziation: im Blut existierte Ag vorwiegend als Ionen (>95 %) unabhängig von der verabreichten Form, während in der Leber ~80 % des Ag aus nAg₁₀₀ als Partikel blieb, mit minimaler Partikelpräsenz nach Ag⁺-Verabreichung (Abb. 4c,d). Partikelgrößenanalyse von Leber-nAg₁₀₀ zeigte einen durchschnittlichen Durchmesser von ~80 nm, kleiner als die verabreichten 100 nm, was partielle Ionisierung und mögliche Transformation im Lebergewebe widerspiegelt (Abb. 4e).

Simultane Quantifizierung und physikalische Eigenschaftsanalysen von intravenös verabreichten nAg₁₀₀ und Ag⁺. nAg₁₀₀ und Ag⁺ wurden Mäusen intravenös verabreicht (0,75 oder 1,5 mg kg⁻¹). Nach 24 h wurden Lebern und Blut gesammelt. Alle Proben wurden mit NaOH-Lösung vorbehandelt. Ag-Konzentration in a Blut und b Leber per ICP-MS gemessen. nAg in c Blut und d Leber per sp-ICP-MS gemessen. Der durchschnittliche Durchmesser der in der Leber detektierten Partikel ist in e gezeigt. Ergebnisse als Mittelwert ± SE (n = 3).

Schlussfolgerungen

Wir haben ein optimiertes NaOH-Vorbehandlungsprotokoll etabliert, das genaue sp-ICP-MS-Analyse von Silbernanopartikeln in Mausgeweben ermöglicht und simultane Quantifizierung und Partikelgrößencharakterisierung liefert. Anwendung dieses Workflows auf intravenös verabreichte nAg₁₀₀ und Ag⁺ zeigte, dass nAg in vivo partiell ionisiert, mit ~80 % partikulär in der Leber und ~95 % ionisiert im Blutstrom. Diese Ergebnisse unterstreichen die Wichtigkeit, Partikel-zu-Ion-Umwandlung bei der Bewertung von ENP-Biodistribution und -Kinetik zu berücksichtigen. Die Methode ist breit auf diverse Gewebe anwendbar und kann in Risikobewertungsstudien eingesetzt werden, um ENP-Expositionsdynamik und biologische Reaktionen aufzuklären.

Abkürzungen

Ag

Silber

Ag⁺

Silberion

DLS

Dynamic light scattering (Dynamische Lichtstreuung)

ENPs

Engineered nanoparticles (Technisch hergestellte Nanopartikel)

HCl

Hydrochloric acid (Salzsäure)

HNO₃

Nitric acid (Salpetersäure)

ICP‑MS

Inductively coupled plasma‑mass spectrometry (Induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie)

nAg

Silver nanoparticles (Silbernanopartikel)

nAg₁₀₀

100 nm nAg

nAg₃₀

30 nm nAg

nAg₇₀

70 nm nAg

NaOH

Sodium hydroxide (Natriumhydroxid)

PBS

Phosphate‑buffered saline (Phosphatgepufferte Salzlösung)

sp‑ICP‑MS

Single particle ICP‑MS (Einzelpartikel-ICP-MS)

TEM

Transmission electron microscope (Transmissionselektronenmikroskop)

TMAH

Tetramethylammonium hydroxide (Tetramethylammoniumhydroxid)