Gezielte Nanoliposom-Gabe von Paclitaxel und P-gp-Inhibitor über PD-L1-Antikörper zur Überwindung multiresistenter Magenkrebs

Zusammenfassung

Multidrug-Resistenz (MDR) basierend auf ATP-abhängigen Efflux-Transportern (P-Glykoprotein (P-gp)) bleibt ein Haupthindernis für eine erfolgreiche Chemotherapie. Hier untersuchten wir das Potenzial von PD-L1-mAb-konjugierten Nanoliposomen als gezielte Abgabeplattform für die Co-Delivery von Paclitaxel (PTX) und P-gp-spezifischem Transportinhibitor (TQD, Tariquidar) in medikamentenresistenten Magenkrebszellen. Zwei Medikamente, PTX und TQD, wurden in einem präzisen Verhältnis in einem einzigen Vehikel ko-beladen, um die Aussicht auf kombinierte chemotherapeutische Wirkung zu erhöhen. Zellaufnahmestudien zeigten, dass PD-PTLP eine höhere Internalisierungseffizienz in PD-L1-Rezeptor-überexprimierenden SGC7901/ADR-Zellen aufwies als nicht-targeted PTLP. Die höchste Synergie wurde bei einem Gewichtsverhältnis von 1/0,5 (PTX/TQD) beobachtet, und die Kombination von PTX und TQD führte zu einem offensichtlichen synergistischen Effekt im Vergleich zu den einzelnen Medikamenten allein. Unsere In-vitro-Ergebnisse zeigten, dass TQD effektiv war, die Multidrug-Resistenz in SGC7901/ADR-Zellen umzukehren. Der IC50-Wert von PD-PTLP betrug 0,76 µg/ml im Vergleich zu 6,58 µg/ml und 7,64 µg/ml für PTX und TQD jeweils. PD-PTLP löste signifikant höhere Mengen an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und Zellapoptose aus im Vergleich zu freiem PTX oder TQD. Darüber hinaus zeigte die In-vivo-Antitumor-Studie, dass die Kombinationschemotherapie von PD-PTLP eine signifikante Hemmung der Tumorlast von medikamentenresistenten Xenograft-Tumoren mit signifikant höheren terminalen Desoxynukleotidyl-Transferase-dUTP-Nick-End-Labeling (TUNEL)-positiven Zellen bewirkte. Ferner führte freies PTX zu einem signifikanten Anstieg der AST- und ALT-Werte, während PD-PTLP im Vergleich zur Kontrolle nicht signifikant unterschiedlich war, was den Sicherheitsindex anzeigt. Insgesamt glauben wir, dass die Kombination eines Antikrebsmedikaments mit einem P-gp-Inhibitor eine potenzielle Richtung für die Behandlung medikamentenresistenter Magentumoren bieten könnte.

Einleitung

Gegenwärtige chemotherapeutische Behandlungen auf Basis einzelner Medikamentenregime sind weit davon entfernt, perfekt zu sein, und leiden unter schweren Nebenwirkungen bei höheren Dosen und führen gleichzeitig zur Entwicklung von Medikamentenresistenz [1]. Das vergangene Jahrzehnt hat die hohe therapeutische Wirksamkeit von Kombinationsmedikamentenregimen in der Krebstherapie erlebt [2]. Die Kombination von zwei oder mehr Medikamenten hat sich als synergistische antikrebswirksame Wirkung erwiesen, aufgrund der unterschiedlichen pharmakologischen Wirkungen der Kombinationsmedikamente [3, 4]. Die Wahl der richtigen Medikamentenkombination hängt jedoch von mehreren Faktoren ab, einschließlich Krebszelltyp, hydrophile/hydrophobe Medikamente, biochemische Aktivitäten und pharmakokinetische Muster der Medikamente. Unter allen ist die Kombination von Medikamenten selektiv für spezifische Krebsarten [5].

Magenkrebs ist eine globale Gesundheitsbelastung und die zweithäufigste Ursache für krebsbedingte Todesfälle weltweit. Die Prävalenz von Magenkrebs ist in Ostasien wie Japan, Korea und China hoch, wobei China die höchste Sterberate der Welt meldet [6]. Im Durchschnitt werden jährlich 400.000 neue Fälle in China registriert, und die meisten Fälle werden in fortgeschrittenen/späten Stadien diagnostiziert [7, 8]. Trotz enormer Fortschritte in Behandlungsstrategien hat sich die Überlebensrate nicht verbessert und die Therapie scheiterte. Das Behandlungsversagen wird hauptsächlich der Entwicklung von Chemoresistenz und der schweren Toxizität der Chemotherapiedosis sowie dem Wiederauftreten von Magenkrebs zugeschrieben [9]. Daher besteht eine dringende Aufgabe, die therapeutische Wirksamkeit zu verbessern und Metastasen und Wiederauftreten von Magenkrebs zu überwinden.

Paclitaxel (PTX) ist eines der wichtigen Medikamente, die in der Magenkrebsbehandlung indiziert sind [10]. PTX hemmt die Zellreplikation, indem es mit dem Abbau von Mikrotubuli interferiert, was zu Zellzyklusarrest führt. Der Erwerb von Multidrug-Resistenz (MDR) ist jedoch ein großes Hindernis für den Erfolg der Chemotherapie [11, 12]. Der ATP-abhängige Efflux, vermittelt durch Transmembrantransporter der ATP-bindenden Kassette (ABC)-Familie, in der P-Glykoprotein (P-gp) als häufigster Faktor gilt, ist in Magenkrebs überexprimiert [13]. Andererseits dient PTX als Substrat für P-gp-Rezeptoren, wobei der Medikamentenefflux die intrazelluläre Medikamentenkonzentration reduziert, was zu geringer Wirksamkeit und hoher Resistenz führt [14]. In diesem Zusammenhang ist Tariquidar (TQD) ein potenter P-gp-Inhibitor der dritten Generation und wurde berichtet, die Überexpression von P-gp-Rezeptoren in verschiedenen Krebszellen umzukehren [15, 16]. Allerdings legten Berichte nahe, dass die TQD-Verabreichung frühzeitig beendet werden muss, da sie die P-gp-Funktion des normalen physiologischen Systems beeinträchtigt. P-gp-Expression ist erforderlich, um die Blut-Hirn-Schranke (BHS) aufrechtzuerhalten und Toxine aus normalen Geweben zu entfernen [17]. Da P-gp in normalen Geweben vorhanden ist und als Barriere gegen zelluläre Toxine fungiert, könnte eine nicht-spezifische Inhibition von PTX oder TQD potenziell in normale physiologische Funktionen eingreifen und zu unerwünschter Toxizität führen. Zudem sind PTX und TQD hoch lipophile Medikamente mit begrenzter Löslichkeit in wässrigen Lösungen und systemischem Blut, was die Notwendigkeit eines stabilen Arzneimittelabgabesystems erfordert, das auf Magenkrebs im Körper zielt [18].

Das Arzneimittelabgabesystem (DDS) erhöhte die Konzentration der eingekapselten Medikamente im Krebsgewebe signifikant und bot eine anhaltende Freisetzung des Medikaments über einen längeren Zeitraum [19]. In diesem Zusammenhang ist Liposom einer der weitverbreiteten Arzneimittelträger zur Verbesserung der therapeutischen Wirksamkeit bei Krebs. Liposomen gewannen an Bedeutung aufgrund ihrer Biokompatibilität, strukturellen Oberflächenmodifikationen, hydrophilen/lipophilen Arzneimittelbeladung und hoher Arzneimittelbeladungskapazität [20]. Die Medikamente konnten stabil in der Lipiddoppelschicht des Liposoms eingebaut werden und leicht mit verlängerter Zirkulationsfähigkeit (PEGylierung) durch den Enhanced Permeation and Retention (EPR)-Effekt ausgestattet werden [21]. Kürzlich wurde Liposomen die Fähigkeit zugeschrieben, multiple Medikamentenverhältnisse nach intravenöser Verabreichung beizubehalten [22]. Diese Idee wurde 2017 nach FDA-Zulassung demonstriert: Vyxeos® (liposomale Formulierung) mit Verhältnissen von Cytarabin:Daunorubicin zur Behandlung von Leukämie [23]. Im Vergleich zu nicht-targeted Formulierungen waren ligand-targeted Formulierungen sehr attraktiv und vielversprechend. In diesem Zusammenhang ist PD-1 ein Zelloberflächenrezeptor, bekannt für die Downregulation des Immunsystems und die Unterdrückung der T-Zell-Entzündungsaktivität. Die PD-L1-Expression wurde bei 50 % der Magenkrebspatienten berichtet, was PD-L1 als Targeting-Rezeptor für Nanopartikel-Internalisierung ausweist [24, 25]. Der PD-L1-monoklonale Antikörper (mAb) könnte spezifisch an die extrazelluläre Domäne des PD-L1-Proteins binden und könnte eine exzellente therapeutische Strategie zur Verbesserung der antikrebswirksamen Effizienz sein [26].

Das Hauptziel der vorliegenden Studie war es, die Abgabe von Kombinationsmedikamenten, PTX und TQD, zu verbessern, um die antikrebswirksame Effizienz gegen Magenkrebs zu steigern. Zu diesem Zweck wurde PTX- und TQD-beladenes PD-L1/Nanoliposom formuliert und auf antikrebswirksame Effizienz unter In-vitro- und In-vivo-Bedingungen evaluiert. Die In-vivo-Wirksamkeit wurde in einem auf Magenkrebszellen basierenden Xenograft-Modell evaluiert und Immunhistochemie (IHC) wurde durchgeführt.

Schlussfolgerung

Zusammenfassend realisierten wir eine Kombinationstherapie gegen MDR-Tumoren durch eine programmierte Abgabestrategie. Wir demonstrierten das Potenzial der Kombination von PTX und P-gp-Inhibitor (TQD) bei der Hemmung der Tumorlast von multiresistenten SGC7901/ADR-Xenograft-Tumoren. Die Co-Delivery von PTX und TQD in einem multifunktionalen Nanoträger ermöglichte die ratiometrische Kontrolle der ko-beladenen Antikrebsmedikamente, hemmte die P-gp-Effluxpumpe und zeigte synergistische antikrebswirksame Effizienz. Wir glauben, dass die Kombination eines Antikrebsmedikaments mit einem P-gp-Inhibitor eine potenzielle Richtung für die Behandlung medikamentenresistenter Tumoren bieten könnte.

Materialien und Methoden

Formulierung von PD-L1-mAb-konjugierten PTX/TQD-beladenen Nanoliposomen

Eidotter-Phosphatidylcholin (EPC), 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE), 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-2000] (DSPE-PEG) und DSPE-PEG2000-Maleimid (DSPE-PEG2000-Mal) wurden in einer Chloroformlösung im Molchenverhältnis 3/2/0,5/0,25 zusammen mit PTX und TQD gemischt, und das organische Lösungsmittel wurde mit einem Rotationsverdampfer verdampft, gefolgt von Gefriertrocknung für 3 h. Der Lipidfilm wurde mit einer 250 mM Ammoniumsulfatlösung bei pH 7,0 hydratisiert. Die großen multilamellaren Liposomen wurden 30 Minuten in einem Bad-Ultraschallator (Branson ultrasonicbath, USA) bei 65 °C soniziert. Die Liposomen wurden streng 1 Stunde gegen große Volumen destilliertem Wasser dialysiert, um das freie Medikament und die ursprünglichen Komponenten auszutauschen. Die Liposomen wurden in Phosphat-gepuffertem Salin (PBS, pH 7,4) redispergiert. Der PD-L1-mAb wurde im Verhältnis 8:1 (Liposom:mAb) mit dem Liposom gemischt und 4 h bei 4 °C inkubiert. Der PD-L1-mAb wird durch Wechselwirkung zwischen Sulfhydrylresten auf den Antikörpern und den C-terminalen Maleimidgruppen der Liposomen an das DSPE-PEG2000-Mal konjugiert. Die PD-L1-konjugierten Liposomen wurden 10 Minuten bei 10.000 rpm zentrifugiert, der Überstand entfernt und in PBS-Puffer redispergiert und bei 4 °C bis zur weiteren Analyse gelagert. Die Menge an PTX und TQD, die im Liposom eingekapselt war, wurde durch HPLC-Methode bewertet. Ein Agilent Technologies HPLC-System Modell 1260 Infinity, ausgestattet mit einem Agilent Technologies-Autosampler und G1315D-Diodenarray-Detektor, wurde in der Studie verwendet. Die mobile Phase besteht aus einer Mischung von Acetonitril/Wasser (70:30 v/v) bei einer Flussrate von 1 ml/min. Eine C18-Säule (5 µm, 150 × 60 mm, ODS-3) wurde verwendet, um die Proben zu eluieren und bei 227 nm zu detektieren. Vorher wurde das PTX/TQD-beladene Liposom in Acetonitril gelöst und 15 Minuten vortexiert, durch einen 0,45 µm Filter filtriert, und 10 µl Aliquot wurde in die HPLC-Säule injiziert.

Größenverteilung und Partikelmorphologie-Analyse

Die Größenverteilung und das Zeta-Potenzial der medikamentenbeladenen Formulierungen wurden mit einem Malvern Zetasizer (UK) bei 25 °C bestimmt. Vor dem eigentlichen Experiment wurden Nanopartikel-Dispersionen 10-fach mit destilliertem Wasser verdünnt und das Experiment wurde im Triplikat bei einem Detektionswinkel von 90° durchgeführt. Die Morphologie der Nanopartikel wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bewertet. Die Nanopartikel-Dispersionen wurden 10-fach mit destilliertem Wasser verdünnt und auf ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter gegeben und mit einer IR-Lampe getrocknet, und dann wurde die Probe mit TEM (CM 30, Philips (Eindhoven, Niederlande)) nach Färbung mit Uranylacetat (1 % w/v) evaluiert.

Freisetzungsprofil-Analyse

Das Freisetzungsprofil von PTX und TQD aus dem Nanoliposom wurde durch Dialysemethode bewertet. Zu diesem Zweck wurden 15 mg lyophilisiertes Pulver von PD-L1-mAb-konjugierten PTX- und TQD-beladenen Nanoliposomen (PD-PTLP) in 1 ml destilliertem Wasser gelöst und in einer Dialysemembran (MWCO 3,5 kDa) versiegelt und in 30 ml jeweiligem Freisetzungspuffer bei 37 °C eingetaucht. Zu vorgegebenen Zeitpunkten wurden Aliquots der Proben entnommen und mit gleicher Menge Freisetzungspuffer ersetzt. Die Studie wurde 72 h fortgesetzt. Die Proben wurden durch 0,22 µm Spritzenfilter filtriert und in die HPLC-Säule injiziert und mit der oben genannten Methode evaluiert.

Zellaufnahmestudien

SGC7901/ADR-Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) kultiviert, ergänzt mit 10 % FBS und 100 IE/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin unter 5 % CO₂-Atmosphäre bei 37 °C. Ein konfokaler Laserscanning-Mikroskop (BX61WI; Olympus, Tokio, Japan) wurde verwendet, um die zelluläre Verteilung und zelluläre Aufnahme von PTLP und PD-PTLP in SGC7901/ADR-Zellen zu bewerten. Zu diesem Zweck wurden 1 × 10⁵ Zellen in jedes Well einer 12-Well-Platte gesät und 18 h inkubiert. Die Zellen wurden dann mit PTLP und PD-PTLP exponiert und 3 h inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit kaltem PBS gewaschen und mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) für 10 min fixiert. Die Zellen wurden erneut mit PBS gewaschen und mit 4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) für 10 min gefärbt. Schließlich wurden die Zellen sorgfältig gewaschen und unter CLSM beobachtet. Der kompetitive Experiment zur Aufnahme von PD-PTLP wurde durch Vorbehandlung der Zellen mit freiem PD-L1-mAb für 30 min und Waschen durchgeführt. Die Zellen wurden in zwei Gruppen aufgeteilt, eine mit freiem PD-L1-mAb behandelt und die andere unbehandelt. Die Zellen wurden mit PD-PTLP inkubiert und 3 h inkubiert, und dieselbe Methode wurde für die zelluläre Aufnahmeanalyse befolgt.

Protein-Expression durch Western-Blot-Assay

Die SGC7901/ADR-Zellen wurden in einer 6-Well-Platte mit einer Aussaatdichte von 3 × 10⁵ Zellen/Well gesät und 18 h inkubiert. Die Zellen wurden mit verschiedenen Formulierungen (PTX, TQD, PTLP, PD-PTLP) behandelt und 24 h inkubiert. Zellen wurden gewaschen und mit Stripping-Puffer extrahiert und mit einem Standard-Lysepuffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) lysiert. Die Zellen wurden 15 Minuten bei 12.000 rpm zentrifugiert und der Überstand gesammelt und die Proteinquantifizierung mit BCA-Proteinassay (Beyotime) durchgeführt. Gleichmäßige Proteinmengen wurden in 8 % SDS-PAGE-Gel geladen und dann auf eine Nitrozellulosemembran (EMD Millipore, Billerica, MA, USA) transferiert. Die Membran wurde 1 h mit 5 % Magermilch blockiert, um unspezifische Bindungsstellen zu inhibieren. Die Membran wurde über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern (P-gp und GAPDH, 1:1000, Abcam, MA, USA) inkubiert. Die Membran wurde mit TBST gewaschen und erneut mit Sekundärantikörpern von Peroxidase-markierten Ziegen-anti-Ratte- oder -Maus-Antikörpern (Ratte oder Maus, 1:10.000, Abcam, MA, USA) bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membranen wurden erneut mit TBST gewaschen. Die Blots wurden unter einer verstärkten Chemilumineszenzmethode (EMD Millipore) visualisiert.

In-vitro-Zytotoxizitätsanalyse

Der zytotoxische Effekt einzelner Medikamente und Formulierungen wurde durch MTT-Assay bewertet. Kurz gesagt, Krebszellen wurden mit einer Dichte von 1 × 10⁴ Zellen/Well in einer 96-Well-Platte geschichtet und 18 h inkubiert. Die Zellen wurden dann mit freiem PTX, TQD, PTLP und PD-PTLP jeweils für 24 h behandelt. Anschließend wurden die Zellen sorgfältig gewaschen und mit 15 µl einer 5 mg/ml MTT-Lösung versetzt und 3 h zusätzlicher Inkubation unterzogen, dann wurden 100 µl DMSO hinzugefügt, um die Formazankristalle zu extrahieren. Die resultierende Absorption wurde bei 570 nm mit einem automatisierten Mikroplattenleser gemessen. Die Zelllebensfähigkeit wird berechnet als OD der Testgruppe/OD der Kontrolle × 100 %. Der Kombinationsindex wurde mit CalcuSyn^TM-Software bewertet. Alle Experimente wurden im Triplikat durchgeführt.

In-vitro-Apoptose- und Reaktive-Sauerstoffspezies-Analyse

Für den Apoptose-Assay wurden Krebszellen mit einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen/Well in einer 12-Well-Platte geschichtet und 18 h inkubiert. Die Zellen wurden dann mit freiem PTX, TQD, PTLP und PD-PTLP jeweils für 24 h behandelt. Die Zellen wurden durch Stripping extrahiert und zentrifugiert und die Pellets in 100 µl Bindungspuffer redispergiert. Die Zellen wurden mit einer Kombination aus 5 µl Annexin-V/FITC und 2,5 µl PI-Arbeitslösung ko-gefärbt und 15 min inkubiert. Die gefärbten Zellen wurden mit einem Durchflusszytometer (BD FACS Calibur, BD Biosciences, CA, USA) analysiert. Annexin-V und PI repräsentieren den frühen bzw. späten Apoptose-Indikator basierend auf den strukturellen Komponenten lebender und toter Zellen.

2,7-Dichlorfluorescin-Diacetat (DCFH-DA) wurde als Sonde für die reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) Analyse verwendet. Für die quantitative Analyse wurden 1 × 10⁴ Zellen/Well in einer 96-Well-Schwarzbodenplatte gesät und 18 h inkubiert. Die Zellen wurden dann mit freiem PTX, TQD, PTLP und PD-PTLP jeweils für 24 h behandelt. Die Zellen wurden mit PBS-Puffer gewaschen und dann 30 min gemäß Herstellerangaben mit 1 ml DCFH-DA-Lösung inkubiert. Anschließend wurden die Zellen lysiert und 15 Minuten bei 10.000 rpm zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde in eine neue 96-Well-Platte übertragen und die Fluoreszenz bei 485 nm mit einem automatisierten Mikroplattenleser gemessen. Gleichzeitig wurden separate Zellsätze ähnlich verarbeitet und Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop (Nikon A1, Japan) beobachtet.

Antitumor-Wirksamkeit von PD-PTLP im Xenograft-Modell

Die Antitumor-Wirksamkeitsstudie wurde an BALB/c-Nacktmäusen durchgeführt, die vom Laboratoriumstierzentrum, dem Vierten Angehängten Krankenhaus der Harbin Medical University, Harbin, bezogen wurden. Alle Tierversuche wurden gemäß den nationalen Standards für Laboratoriumstierqualität durchgeführt. Die Experimente wurden streng gemäß den Richtlinien des Experimental Animal Committee des Vierten Angehängten Krankenhauses der Harbin Medical University, Harbin, durchgeführt. Die Tiere wurden subkutan mit 1 × 10⁶ SGC7901/ADR-Zellen in 150 µl Kulturmedium in die rechte Flanke der Mäuse injiziert. Die Tumoren durften wachsen, bis sie 100 mm³ erreichten, bevor der eigentliche Experiment begann. Die Mäuse wurden gleichmäßig in fünf Gruppen mit je acht Mäusen aufgeteilt. Die Einzeldosis von PTX und TQD wurde auf 5 mg/kg festgelegt, während die Kombination eine Gesamtdosis von 5 mg/kg verwendete. Die Schwanzveneninjektion erfolgte alle drei Tage, insgesamt wurden drei Injektionen durchgeführt. Zu vorgegebenen Tagen wurden Tumorvolumen und Körpergewicht gemessen. Das Tumorvolumen wurde berechnet, indem der längste und kürzeste Durchmesser der Tumoren mit einem digitalen Messschieber gemessen wurden. Tumorvolumen (V) = ½ × Länge × Breite (mm)². Die Mäuse wurden am Ende der Studie geopfert und der Tumor extrahiert und gewogen. Der Tumor wurde immunhistochemischer (IHC) Analyse unterzogen. Die Tumoren wurden extrahiert, in dünne Scheiben geschnitten und in 10 % Formalinlösung fixiert. Die Tumoren wurden in Paraffinwachs eingebettet und dann der TUNEL-Assay gemäß Herstellerangaben durchgeführt.

Serum-Biochemische Analyse

Die Mäuse wurden mit den jeweiligen Formulierungen verabreicht; 24 h später wurden die Mäuse geopfert und Blutproben von der Kontroll- sowie den testbehandelten Tiergruppen entnommen. Das Serum wurde vom Vollblut getrennt und bei −80 °C bis zur weiteren Analyse gelagert. Die serum-biochemische Analyse wurde durchgeführt, um die Leberleistung zu bewerten. Aspartat-Transaminase (AST) und Alanin-Transaminase (ALT) wurden gemessen, um die Leberfunktion zu bewerten. Alle Messungen wurden gemäß den Verfahren des biochemischen Kit-Assays durchgeführt.

Ergebnisse und Diskussion

Herstellung und Charakterisierung von PTX/TQD-beladenen PD-L1-konjugierten Nanoliposomen

PTX wurde in der Klinik breit eingesetzt und ist primär in der Behandlung von Magenkrebs indiziert. Die Mehrheit der Patienten leidet jedoch offenbar unter schlechter therapeutischer Antwort aufgrund der Multidrug-Resistenz (MDR) des Magenkrebses. Eine Erhöhung der PTX-Dosis führte zu erhöhter systemischer Toxizität, wodurch MDR zu einem Haupthindernis für die erfolgreiche Krebstherapie wurde. Unter der Vielzahl von MDR-Mechanismen wird der P-gp-vermittelte Medikamentenefflux als primär verantwortlich für die Medikamentenresistenz in Krebszellen angesehen [27]. Daher verwendeten wir in dieser Studie ein zweites Medikament (TQD) als P-gp-Inhibitor, um das MDR-Phänomen in den Krebszellen zu überwinden und die antikrebswirksame Effizienz von PTX zu verbessern. Wir untersuchten sorgfältig den Gewichtsanteil der beiden Medikamente, in dem sie den synergistischen Effekt zeigen. Um den antikrebswirksamen Effekt zu maximieren, ist es wichtig, die mehreren Medikamente in einem einzigen Nanopartikelsystem ko-zuzuliefern. Die gleichzeitige Abgabe von zwei Medikamenten (PTX und P-gp-Inhibitor) wird die effiziente Unterdrückung des Medikamentenefflux-Mechanismus ermöglichen und die Aussicht auf erhöhte intrazelluläre Konzentrationen in den Krebszellen erhöhen [28]. Zu diesem Zweck haben wir in dieser Studie zwei Medikamente in der Lipiddoppelschicht von Nanoliposomen beladen, die als extrem stabil in der systemischen Zirkulation gelten (Abb. 1). Um das tumor-spezifische Targeting zu verbessern, wurden Nanoliposomen oberflächenkonjugiert mit PD-L1-mAb. Die Maleimidgruppe im Nanoliposom wird mit der Thiolgruppe des PD-L1-mAb binden und eine stabile kovalente Bindung bilden. Eine mögliche Einschränkung der Maleimid-Konjugation ist jedoch, dass die Reaktion reversibel ist: Das Produkt könnte Retro-Michael-Additionsreaktionen mit biologischen Thiolen im Plasma eingehen, was zur Freisetzung des Maleimids führen könnte. Dies haben wir jedoch durch maximale Oberflächenkonjugation des Antikörpers auf dem Maleimid-Lipososom überwunden. Es wurde berichtet, dass tumor-targeting Liganden die therapeutische Last spezifisch in das Tumorgewebe liefern und unnötige Nebenwirkungen in normalen Geweben vermeiden. Früher berichteten Patel et al., dass die Einbindung von P-gp-Inhibitor mit PTX die MDR in Ovarialkrebszellen unter In-vitro-Bedingungen überwinden konnte [11]. Ähnlich berichteten Zou et al. und Zhang et al., dass die PTX-Zytotoxizität gegen SKOV-3TR und A2780-Adr multiresistente Zellen in Gegenwart von Tariquidar signifikant zunahm. In diesen Studien wurde jedoch entweder die physikalische Kombination von PTX + TQD verwendet oder ein nicht-targeted Träger entwickelt [29, 30]. Wichtig ist, dass all diese Studien nur unter In-vitro-Bedingungen durchgeführt wurden. Die vorliegende Studie konzentrierte sich auf das Design des gezielten Nanoträgers unter Verwendung einer relativ neuen Klasse von Targeting-Agenten, dem PDL1-Antikörper. Zudem demonstrierte die vorliegende Studie die Wirksamkeit von PTX + TQD im Xenograft-Tumormodell und bewertete auch die Blutparameter, um sie mit der systemischen Toxizität in Verbindung zu bringen.

Schematische Illustrationen der Beladung von Paclitaxel und Tariquidar in PD-L1-monoklonalem Antikörper (mAb)-oberflächenkonjugierten Nanoliposomen. Das Liposom wurde durch Hydratation des Dünnschichtlipidfilms und Sonikation zur Bildung der medikamentenbeladenen Nanoliposomen hergestellt

Die durchschnittliche Partikelgröße von PTLP betrug 135,6 ± 1,26 nm, während sie nach Konjugation mit PD-L1-mAb (PD-PTLP) auf 168,59 ± 1,34 nm anstieg. Die Partikelgröße stieg aufgrund des hohen Molekulargewichts des PD-L1-mAb an; dennoch war die Gesamtgröße unter 200 nm und die kugelförmige Form bemerkenswert (Abb. 2a). Nanopartikelgrößen unter 200 nm ermöglichen eine höhere Anreicherung im Tumorgewebe aufgrund des Enhanced Permeation and Retention (EPR)-Effekts. Zudem ermöglicht die Anwesenheit von PEG eine verlängerte Blutzirkulationszeit in der systemischen Zirkulation. Das Zeta-Potenzial von PD-PTLP betrug 22,1 ± 1,21 mV, was keine unspezifische Bindung an Blutkomponenten zulässt. PD-PTLP zeigte eine hohe Einkapselungseffizienz von ~95 % für beide Medikamente (PTX und TQD). PD-PTLP zeigte auch eine hohe Medikamentenbeladung von 12–14 % w/w für PTX und TQD jeweils (Abb. 2b).

Physikochemische Charakterisierung von PTX/TQD-beladenen PD-L1-konjugierten Nanoliposomen. a Morphologieanalyse von PD-PTLP mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). b Medikamentenbeladungskapazität von PD-PTLP. c In-vitro-Freisetzung von PTX und TQD aus PD-PTLP bei pH 7,4-Puffer und pH 5,0-Pufferbedingungen bei 37 °C. **p < 0,01 ist der statistische Unterschied in der Medikamentenfreisetzung zwischen pH 7,4- und pH 5,0-Puffern

In-vitro-Medikamentenfreisetzung

Das Freisetzungsverhalten von PTX und TQD aus PD-PTLP wurde in pH 7,4- und pH 5,0-Bedingungen bei 37 °C untersucht. Wie in Abb. 2c gezeigt, wurde eine kontrollierte Freisetzung der Medikamente (PTX und TQD) aus dem PD-PTLP über den gesamten Studienzeitraum (72 h) beobachtet. Die Freisetzung der Medikamente aus der dicken Doppelschicht des Nanoliposoms könnte für die langsame und anhaltende Freisetzung der beiden Medikamente aus dem PD-PTLP verantwortlich sein. Es muss angemerkt werden, dass kein signifikanter Unterschied im Freisetzungsmuster von PTX und TQD in pH 7,4 und pH 5,0 beobachtet wurde. Zu späteren Zeitpunkten wurde ein signifikanter Unterschied in der Freisetzung unter verschiedenen pH-Bedingungen beobachtet. Es ist erwähnenswert, dass keine pH-responsiven Elemente im Nanoliposom hinzugefügt wurden und die höhere Medikamentenfreisetzung in sauren Bedingungen auf die höhere Diffusion bei niedrigerem pH zurückgeführt werden könnte. Zum Beispiel wurden ~85 % von PTX in pH 5,0-Bedingungen freigesetzt im Vergleich zu ~55 % Medikamentenfreisetzung bei physiologischem pH. Ein ähnliches Muster schneller Freisetzung kleiner Moleküle bei sauren Bedingungen und langsamerer Freisetzung bei basischen pH-Bedingungen wurde von anderen Forschern demonstriert. Dennoch könnte die relativ niedrige Medikamentenfreisetzung in pH 7,4-Bedingungen unnötige systemische Nebenwirkungen reduzieren und die systemische Zirkulation verlängern, während die höhere Medikamentenfreisetzung in pH 5,0 der höheren therapeutischen Wirksamkeit im Tumorgewebe zugutekommen könnte.

In-vitro-Zellaufnahmeanalyse

Die Abgabeeffizienz von gezielten (PD-PTLP) und nicht-gezielten (PTLP) Nanoliposomen wurde in SGC7901/ADR getestet. Die zelluläre Aufnahme wurde mit Rhodamin-B als Fluoreszenz-Tracker bewertet. Rhodamin-B ist ein häufig verwendetes Fluorophor ohne zellbiologische Interaktionen. Der Zellkern wurde mit blauem DAPI gefärbt und die rote Farbe stammte von den Nanopartikeln. Die CLSM-Daten zeigen eindeutig, dass PD-PTLP eine starke rote Fluoreszenz in den Krebszellen im Vergleich zu nicht-targeted PTLP aufwies. Eine höhere rote Fluoreszenz in PD-PTLP-behandelten Krebszellen wird auf die höhere Nanopartikel-Internalisierung zurückgeführt (Abb. 3a). Das Ergebnis der CLSM-Daten deutet darauf hin, dass der auf der Zellmembran exprimierte PD-L1-Rezeptor vom PD-L1-mAb erkannt wurde, der auf der Nanoliposooberfläche konjugiert war. Ein nicht-spezifischer oder passiver Aufnahmemechanismus war in PTLP-behandelten Krebszellen evident. Die PD-L1-Targeting-Spezifität wurde durch das PD-L1-mAb-Vorbehandlungsexperiment weiter bestätigt. Die SGC7901/ADR-Zellen wurden mit PD-L1-mAb vorbehandelt und 30 min inkubiert. Die Zellen wurden dann mit PD-PTLP und PTLP exponiert und 3 h inkubiert. Wie gezeigt (Abb. 3b), zeigten Zellen, die mit PD-L1-mAb vorbehandelt wurden, signifikant weniger rote Fluoreszenz im Vergleich zu unbehandelten Zellen, was darauf hindeutet, dass PD-L1-mAb von den oberflächenexprimierten Rezeptoren verbraucht wurde und keine zusätzlichen Rezeptoren für Bindung und Internalisierung verfügbar waren, was zu geringerer Nanopartikel-Aufnahme und -Internalisierung führte. Diese CLSM-Bilder zeigten eindeutig die Targeting-Spezifität von PD-PTLP in SGC7901/ADR-Krebszellen.

a Konfokale Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) Bilder von SGC7901/ADR-Zellen nach Inkubation mit PTLP und PD-PTLP für 3 h; CLSM-Bilder von SGC7901/ADR-Zellen, vorbehandelt mit/ohne PD-L1-mAb nach Inkubation mit PD-PTLP für 3 h. Rhodamin B wurde als fluoreszierender Tracker und DAPI zur Färbung des Zellkerns der Krebszellen verwendet

Dual-medikamentenbeladene Nanoliposomen verstärken anti-proliferativen Effekt

Für die Kombinationstherapie wurden verschiedene Verhältnisse von zwei Medikamenten (PTX und TQD) verwendet, um das Ausmaß des synergistischen oder additiven Effekts auf die resistenten Magenkrebszellen zu bestimmen. Zur Berechnung des Isobologramms und des Kombinationsindex (CI) wurde CalcuSyn-Software (Biosoft, Version 2.1) verwendet. Das Isobologramm kann basierend auf der Chou-Talalay-Gleichung erklärt werden. Die CI-Werte werden charakterisiert durch synergistisch (CI < 0,9), additiv (CI = 1) und antagonistisch (CI > 1). Wie gezeigt, zeigten alle Kombinationsverhältnisse von PTX und TQD einen CI-Wert von < 1, was einen synergistischen Wirkmechanismus bedeutet (Abb. 4a). Genauer gesagt, wurde die höchste Synergie bei einem Gewichtsanteil von 1/0,5 (P/T) beobachtet, während der Synergiegrad mit zunehmender TQD-Gewichtsanteil abnahm, was die Wichtigkeit der Anwesenheit beider Medikamente in spezifischem Gewichtsanteil zeigt. Zu niedrige und zu hohe Konzentrationen von TQD in einem Kombinationsregime ergaben nicht den besten synergistischen Effekt. Für alle In-vitro-Experimente verwendeten wir P/T = 1/0,5 Verhältnis in der Studie.

a Kombinationsindex (CI) verschiedener Gewichtsanteile von PTX und TQD in SGC7901/ADR-Zellen. Der Kombinationsindex wurde mit CalcuSyn^TM-Software bewertet. b In-vitro-Zelllebensfähigkeiten von SGC7901/ADR-Zellen nach Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von freiem PTX, TQD, PTLP und PD-PTLP für 24-h-Inkubationszeitraum. c Western-Blot-Analyse der P-gp-Expression in SGC7901/ADR-Zellen nach Behandlung mit jeweiligen Formulierungen. **p < 0,01 und ***p < 0,001 ist der statistische Unterschied zwischen freiem PTX- und PD-PTLP-behandelter Gruppe

Der in-vitro-zytotoxische Effekt einzelner sowie kombinierter Medikamente wurde nach 24-h-Inkubationszeitraum durch MTT-Protokoll bestimmt. Wie in Abb. 4b gezeigt, hatte leeres NP keinen Effekt auf die Zelllebensfähigkeit, was die Möglichkeit einer Interferenz in den endgültigen Ergebnissen ausschließt. Die Monotherapie mit PTX und TQD zeigte zwar einen konzentrationsabhängigen zytotoxischen Effekt in den resistenten Magenkrebszellen; sie blieb jedoch in der Behandlung weit hinter der nennenswerten Wirksamkeit zurück. Der anti-proliferative Effekt des Einzelwirkstoffs wurde bemerkenswert verbessert, wenn er mit dem zweiten Medikament kombiniert in einem Nanoliposom eingekapselt war. Die Kombination von PTX und TQD führte zu einem offensichtlichen synergistischen Effekt im Vergleich zu den einzelnen Medikamenten allein. Zudem zeigte das PD-L1-mAb-konjugierte Nanoliposom (PD-PTLP) den stärksten anti-proliferativen Effekt, was den Einfluss des Targeting-Liganden auf der Nanopartikeloberfläche anzeigt. Diese verstärkte Zelltötung in der PD-L1-targeted Behandlungsgruppe könnte auf die hohe zelluläre Internalisierung von PD-L1-targeted Nanoliposomen durch SGC7901/ADR-Zellen zurückzuführen sein, konsistent mit der zellulären Aufnahmeanalyse. Der IC50-Wert von PD-PTLP betrug 0,76 µg/ml im Vergleich zu 6,58 µg/ml und 7,64 µg/ml für PTX und TQD jeweils. Eine zehnfache Abnahme des IC50-Werts von PD-PTLP deutet eindeutig darauf hin, dass die Resistenz gegen PTX in P-gp-überexprimierenden SGC7901/ADR durch TQD umgekehrt wurde. Unsere In-vitro-Ergebnisse zeigten, dass TQD effektiv war, die Multidrug-Resistenz in SGC7901/ADR-Zellen umzukehren. Die Ergebnisse zeigten auch, dass Nanoliposomen die pharmakologischen Wirkungen der eingekapselten Medikamente beibehielten und die Medikamente kontrolliert in den Krebszellen freisetzten. Die Kombinationstherapie mit PTX und TQD steigerte die antikrebswirksame Effizienz mit erhöhter synergistischer Aktivität, übertraf die minimalen Vorteile der Monotherapie und mögliche damit verbundene Nebenwirkungen. Insgesamt könnte die Kombinationstherapie von PTX mit einem effektiven P-gp-Inhibitor in Nanoliposomen eine vielversprechende Strategie sein, um MDR zu überwinden und Magenkrebs zu behandeln.

Um den molekularen Mechanismus zu bewerten, wurde Western-Blot-Analyse an SGC7901/ADR durchgeführt. Wie gezeigt (Abb. 4c), hatte PTX keinen Effekt auf die P-gp-Protein-Expression, während TQD im Gegensatz dazu die P-gp-Expression signifikant herunterregulierte, was seine pharmakologische Rolle als P-gp-Inhibitor bestätigt. Interessanterweise zeigten die kombinationsmedikamentenbasierten PTLP und PD-PTLP keinen signifikanten Unterschied in der Protein-Expression im Vergleich zu TQD-behandelten Krebszellen. Das Ergebnis demonstrierte den Vorteil, PTX und TQD (P-gp-Inhibitor) zusammen in einem einzigen Nanoträgersystem zu laden. Das Western-Blot-Ergebnis konnte mit den Zelllebensfähigkeitsergebnissen korroboriert werden, wo die Kombination von PTX + TQD die MDR umkehrte und höhere antikrebswirksame Effizienz in Magenkrebszellen zeigte.

Apoptoseanalyse durch Durchflusszytometrie

Die Apoptoseanalyse einzelner Formulierungen wurde durch Annexin V-FITC/PI-Färbemethode mit Durchflusszytometrie bewertet. Die Apoptoseergebnisse sind in Abb. 5a dargestellt. Wie gezeigt, zeigten Kontrollzellen keine Anzeichen von Apoptose, während freies PTX und TQD einen offensichtlichen Anstieg der Apoptosezellen zeigten. Kombinationsmedikamentenbasiertes PTLP zeigte eine zweifach höhere Apoptose im Vergleich zu einzelnen Medikamenten, was den synergistischen antikrebswirksamen Effekt der Formulierungen anzeigt. Wichtiger noch, PD-PTLP zeigte die höchste Apoptose der Krebszellen mit etwa 60 % im Apoptosebereich. Der verstärkte Apoptoseeffekt von PD-PTLP wurde auf die höhere Internalisierung von dual-medikamentenbeladenen Nanoträgern und das synergistische Potenzial von PTX und TQD in ratiometrischer Weise zurückgeführt. Der P-gp-Silencing-Effekt von TQD im Kombinationsregime verstärkte den antikrebswirksamen Effekt von PTX in den Krebszellen. Die Apoptoserate einzelner Medikamente lag im Bereich zwischen 20 und 25 %, während bei PD-PTLP-behandelten Zellen etwa 60 % Apoptosezellen beobachtet wurden. PD-PTLP induzierte mehr Apoptose als freie Medikamente und nicht-targeted Liposomen, was suggeriert, dass PD-L1 PTX/TQD effizienter liefern könnte, um Apoptose der SGC7901/ADR-Zellen zu induzieren.

a Apoptoseassay von SGC7901/ADR-Zellen nach Färbung mit Annexin V/PI-Kombination mittels Durchflusszytometrie. Die Zellen wurden mit einer festen Konzentration von 2 µg/ml behandelt. b Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) Analyse von SGC7901/ADR-Zellen mit 2,7-Dichlorfluorescin-Diacetat (DCFH-DA) als Sonde. ***p < 0,001 ist der statistische Unterschied zwischen freiem PTX- und PD-PTLP-behandelter Gruppe

Intrazelluläre ROS-Level-Bestimmung

Wir untersuchten die Fähigkeit einzelner Medikamente und Dual-Medikamente, den Redox-Zustand der Krebszellen zu beeinflussen, indem wir den Level an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Magenkrebszellen bewerteten. ROS-Level in Krebszellen wurden durch DCFH-DA (grüne Fluoreszenz) evaluiert. Quantitative ROS-Daten sind in Abb. 5b dargestellt. Wie gezeigt, zeigten unbehandelte Zellen keine Anzeichen von ROS; jedoch induzierten PTX oder TQD spürbare ROS-Generierung. Wichtig ist, dass TPLP und PD-PTLP signifikant höhere ROS-Level auslösten im Vergleich zu freiem PTX oder TQD oder unbehandelten Kontrollzellen. Ein bemerkenswert höherer ROS-Wert deutet auf das Potenzial von PD-PTLP hin, höhere Apoptose zu fördern. Mikroskopische Bilder korrelieren mit den quantitativen Ergebnissen mit hellster und höherer Intensität grüner Fluoreszenz im Vergleich zu unbehandelten oder freiem PTX oder TQD behandelten Krebszellen. Die höhere Intensität der grünen Fluoreszenz ist ein Indikator für höhere ROS-Produktion. Oxidativer Stress wie ROS wird als wichtiger Indikator für zelluläre Zytotoxizität betrachtet. Studien haben gezeigt, dass Induktion von ROS eine Vielzahl physiologischer Ereignisse einschließlich DNA-Schäden, Entzündungen und Zellapoptose induziert.

Kombination von PTX und TQD hemmte Wachstum in medikamentenresistenten Tumoren

Schließlich wurden therapeutische Wirksamkeit und Toxizitätsparameter der Formulierungen an einem medikamentenresistenten SGC7901/ADR-Xenograft-Tumormodell untersucht (Abb. 6a). Die Medikamente wurden intravenös bei einer festen Dosis von 5 mg/kg alle 3 Tage mit insgesamt drei Injektionen verabreicht. PTX/TQD wurde bei einem festen Gewichtsanteil von 1/0,5 verabreicht. Wie erwartet, zeigten freies PTX und freies TQD keine hemmende Wirkung auf das Wachstum von MDR-Tumoren, was die Tatsache suggeriert, dass SGC7901/ADR-Zellen Medikamententoleranz auf der Proliferation von MDR-Tumoren manifestieren. P-gp-Inhibitor (TQD) war zwar effizient in der Hemmung der Medikamenteneffluxpumpen, führte jedoch nicht zu verbesserten therapeutischen Ergebnissen. Im Vergleich dazu zeigte die Kombination von PTX + TQD (PTLP) eine signifikante Hemmung des Wachstums von medikamentenresistenten Tumoren. Die beste Antitumor-Wirksamkeit wurde mit PD-PTLP beobachtet, das dreifach wirksam im Vergleich zur Kontrolle, 2,5-fach im Vergleich zu freien Medikamenten und etwa zweifach wirksam in der Reduktion der Tumorlast im Vergleich zu nicht-targeted Formulierungen war (p < 0,05; p < 0,001). Das finale Tumorvolumen von Kontrolle, freiem PTX, TQD, PTLP und PD-PTLP betrug ~2000 mm³, ~1650 mm³, 1625 mm³, ~1000 mm³ und ~650 mm³ jeweils. Freie Medikamente waren zu Beginn leicht wirksam; wuchsen jedoch gleich wie die unbehandelte Kontrollgruppe. Die Ergebnisse zeigen eindeutig das Potenzial der Kombination von PTX + P-gp-Inhibitor als einzigartige Strategie zur effektiven Kontrolle der Tumorlast. Die umfangreiche Tumorsuppression in PD-PTLP deutet eindeutig auf die größere Antitumor-Wirksamkeit der gezielten Formulierungsgruppe hin. Die Tumoren wurden extrahiert und gewogen; Tumorgewichte waren konsistent mit den Tumorvolumendaten (Abb. 6b). Die PD-PTLP-behandelte Mäuse-Gruppe zeigte den kleinsten Tumor im Vergleich zu jeder anderen formulierungsbehandelten Gruppe (p < 0,001). Um den Inhibitor-Effekt einzelner Tumoren weiter zu verifizieren, wurden Tumoren dem TUNEL-Assay unterzogen (Abb. 6c). Wie gezeigt, zeigte PD-PTLP große Bereiche von Apoptose-Färbung im Vergleich zu unbehandelter Kontrolle oder freien Medikamenten. PD-PTLP zeigte offensichtliche Apoptose-Merkmale mit desorganisierten Zellanordnungen. Der prominente Tumorabtötungseffekt von PD-PTLP zeigt die größere Krebszellinhibition in medikamentenresistenten Tumorzellen. Die exzellente Wirksamkeit von PD-PTLP wurde hauptsächlich auf die Anwesenheit des gezielten Liganden (PD-L1-mAb) zurückgeführt, der an die jeweiligen Rezeptoren bindet und die intrazellulären Konzentrationen erhöht. Die Anwesenheit des Kombinationsregimes und die kontrollierte Freisetzung über längere Zeit trugen ebenfalls zur verbesserten Wirksamkeit bei. Zusätzlich könnte die dichte hydrophile PEG-Oberflächenkorona exzellente physikalische Stabilität der Partikel bieten und potenziell unnötige Proteinadsorption und schnelle Clearance vermeiden. Die lange Zirkulation und nanoskalige Größe kommen wiederum der höheren Anreicherung der Partikel im Tumorgewebe zugute [31,32,33].

In-vivo-Antitumor-Wirksamkeit verschiedener Formulierungen gegen multiresistente (MDR) SGC7901/ADR-Tumoren; a Tumorvolumen, b Tumorgewicht-Analyse und c TUNEL-Assay von Tumorgeweben. Die Mäuse wurden mit einer festen Dosis von 5 mg/kg mit Dauer von drei Mal für drei Verabreichungen behandelt. Apoptotische Zellen wurden durch TUNEL-Assay evaluiert. *p < 0,05 und **p < 0,05 (PTLP vs. PD-PTLP), ***p < 0,001 (PTX vs. PD-PTLP)-behandelte Gruppe.

Systemische Toxizitätsanalyse

Die Veränderung des Körpergewichts ist ein guter Indikator für systemische Toxizität. Wie gezeigt (Abb. 7a), verloren Mäuse, die mit freiem PTX behandelt wurden, ~20 % des Körpergewichts am Tag 10, was sich allmählich zum Ende der Studie hin auf das ursprüngliche Körpergewicht erholte. Ein Verlust von mehr als 5 % des Körpergewichts gilt als schwere innere Toxizität und 20 % Körpergewichtsverlust als signifikanter nachteiliger Effekt freier Medikamente [31]. Im Gegensatz dazu verursachten PTLP oder PD-PTLP keinen solchen Körpergewichtsverlust und die Mäuse blieben während des gesamten Studienzeitraums gesund, was den Sicherheitsindex der Nanoliposomen anzeigt. Die Sicherheit der Nanopartikel wurde weiter durch Messung der Plasmaspiegel von Enzymen untersucht. Plasmaspiegel von Aminotransferasen (AST und ALT) wurden nach 24-h-Verabreichung der jeweiligen Formulierungen gemessen (Abb. 7b, c). Wie gezeigt, führte freies PTX zu einem signifikanten Anstieg (p < 0,01) der AST- und ALT-Werte, während PD-PTLP und PTLP im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle nicht signifikant unterschiedlich waren. AST wird bei Organschäden wie Herz, Niere oder Leber in das Serum freigesetzt, während ALT spezifisch bei Leberverletzung freigesetzt wird [34]. Die AST- und ALT-Werte dienen als spezifischer Indikator für Organschäden und in diesem Zusammenhang erwies sich PD-PTLP als sicherer Träger.

Systemische Toxizitätsanalyse einzelner Formulierungen in SGC7901/ADR-Tumoren; a Mäuse-Körpergewichtsanalyse; b, c blutbiochemische Evaluation der Serumspiegel von AST und ALT als systemische Toxizitätsparameter. *p < 0,05 und **p < 0,01 ist der statistische Unterschied zwischen freiem PTX- und PD-PTLP-behandelter Gruppe

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten.

Abkürzungen

EPR:

Enhanced Permeation and Retention Effekt

PD-PTLP:

PD-L1-mAb-konjugierte PTX- und TQD-beladene Nanoliposomen

P-gp:

P-Glykoprotein

PTLP:

PTX- und TQD-beladene Nanoliposomen

PTX:

Paclitaxel

TQD:

Tariquidar