Auswirkungen von C60-Fulleren auf die Wechselwirkung von Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat mit DNA in Silico und seine zytotoxische Aktivität gegen menschliche leukämische Zelllinien in vitro

Hintergrund

Der Vertreter der Kohlenstoff-Nanostruktur C₆₀ Fulleren besitzt einzigartige physikalisch-chemische Eigenschaften und biologische Aktivität, nicht nur als Antioxidans oder Photosensibilisator, sondern auch als Modifikator der toxischen Wirkung von Krebsmedikamenten aufgrund seiner Fähigkeit, in das Zellinnere einzudringen und als Wirkstoffträger zu wirken [1,2,3,4 ]. C₆₀ -Molekül kann mit Chemotherapeutika wie Doxorubicin, Cisplatin und Paclitaxel interagieren und mit ihnen Komplexe bilden, die die therapeutische Wirkung verstärken [5,6,7,8].

Carbacylamidophosphate (CAPh) sind organische Moleküle, die aufgrund ihrer besonderen Struktur, biologischen Aktivität und Perspektiven der biomedizinischen Anwendung aufgefallen sind [9,10,11,12]. Die Anwesenheit von Peptid- und Phosphoramidgruppen, die im Fragment C(O)N(H)P(O) des Moleküls miteinander kombiniert sind, bestimmt seine Wechselwirkung mit biologischen Molekülen und Zellmembranen. Die Variation von Substituenten in der Nähe von Phosphoryl- und Carbonylgruppen bietet die Möglichkeit, die stereochemischen und pharmakologischen Eigenschaften von CAPh zu modulieren. Insbesondere wurde gezeigt, dass verschiedene CAPh-Repräsentanten antineoplastische Aktivität besitzen [13, 14].

Kürzlich haben wir bestätigt, dass Dimethyl-N-(benzoyl)-amidophosphat, das für CAPh in millimolaren Konzentrationen verwendet wird, die Lebensfähigkeit von leukämischen L1210-Zellen verringert und dass seine toxische Wirkung durch C₆₀ . begünstigt wird Fulleren [15]. Wir haben auch gezeigt, dass die Einführung zusätzlicher aromatischer Substituenten und elektronegativer CCl₃ Gruppe in die CAPh-Struktur führte zu einer Erhöhung der Toxizität [16]. Somit wurde eine signifikante toxische Wirkung von Dimorfolido-N-trichloracetylphosphoramid gegenüber menschlichen Leukämiezellen unterschiedlicher Herkunft gezeigt, aber seine effektive Konzentration war immer noch hoch und es gab keine Verstärkung der Toxizität nach kombinierter Wirkung mit C₆₀ Fulleren wurde beobachtet. In Fortsetzung dieser Untersuchungen synthetisierten wir einen neuen Vertreter von CAPh-Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat (HL), der zwei Phenoxysubstituenten anstelle von Morfolidogruppen in der Nähe der Phosphorylgruppe aufweist (Abb. 1).

Die Struktur von Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat (HL)

ТDas Ziel der Forschung war die Abschätzung der biologischen Aktivität von Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat (HL) allein oder in Kombination mit C₆₀ Fullerene mit In-silico-Analyse ihrer Wechselwirkung mit DNA und In-vitro-Untersuchung der zytotoxischen Wirkung gegen menschliche leukämische Zelllinien.

Methoden/Experimental

Chemikalien

RPMI 1640 Flüssigmedium, Fetales Rinderserum (FBS), Penicillin/Streptomycin und L-Glutamin (Biochrom, Deutschland), Dimethylsulfoxid (DMSO) (Carl Roth GmbH+Co, Deutschland), MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid] (Sigma-Aldrich Co, Ltd., USA), HCl (Kharkivreachim, Ukraine).

Charakterisierung einer chemischen Verbindung

Um die Löslichkeit zu erhöhen, haben wir das Natriumsalz von Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat (HL) gemäß den folgenden Reaktionen erhalten (Abb. 2).

Schema der Löslichkeit von Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat (HL) in Natriumsalz

Die Trichlorphosphazothrichloracetyl-Lösung (0,035 M) in 200 ml Chloroform wurde langsam zu einer gut gerührten Natriumphenolat-Suspension (0,106 M, 12,3 g) in 150 ml Chloroform gegeben (Abb. 2; Stufe 1). Die Mischungstemperatur durfte nicht über 40–50 °C ansteigen. Das Rühren wurde etwa 1 h fortgesetzt, und dann wurde die Lösung auf 70 °C erhitzt und 20 min bei diesen Bedingungen gerührt. Das resultierende Produkt Triphenoxyphosphazothrichloracetyl wurde eingedampft. Dann wurden 40 ml 1 M NaOH zugegeben und 90 Minuten unter Rückfluss erhitzt (Abb. 2; Stufe 2). Eine resultierende Mischung wurde eingedampft. Der feste Niederschlag von Natrium-HL wurde dreimal mit Diethylether gewaschen und aus i . umkristallisiert -Propanol als weißes kristallines Pulver (80% Ausbeute). Farblose Kristalle von NaL·3H₂ O für die Röntgenanalyse geeignet wurden von i . erhalten -PrOH:H₂ O (9:1 v /v ) langsame Verdampfung der Lösung. Die Verbindung ist luftstabil, gut löslich in Wasser und Alkoholen. MP 215 °С.

HL wurde durch Elementaranalyse und IR- und NMR-Spektroskopie identifiziert:Elementaranalysen (C, H, N) wurden mit dem Elementaranalysator EL III Universal CHNOS durchgeführt. IR-Spektralmessungen wurden für Proben als KBr-Pellets auf einem Perkin-Elmer Spectrum BX FT-IR-Spektrometer mit einer Auflösung von 2 cm ^− 1 . durchgeführt und Ansammlungen von 8 Scans, die kombiniert werden, um zufällige Absorptionsartefakte im Spektralbereich 4000–400 cm ^− 1 . zu mitteln . ¹ H-NMR-Spektren in DMSO-d6-Lösungen wurden auf einem AVANCE 400Bruker-NMR-Spektrometer bei Raumtemperatur aufgenommen.

HL:IR (cm ⁻¹ ):1639 vs, sh (νCO); 1353 s, sh (Amid II); 1194 s, sh (νPO); 941 s, sch (νPN).

¹ H-NMR (DMSO-d₆ ):7,05 (t, 2H, γ-CH₂ ); 7.205, 7.255 (dt, 8H, α- und β-CH₂ ).

Für CCl₃ C(O)N(Na)P(O)(OC₆ H₅ )₂ die elementare Zusammensetzung wurde bestimmt, %:C 40,58, H 2,35, N 3,15; und berechnet, %:C 40,37, H 2,42, N 3,36.

Synthese und Charakterisierung von C₆₀ Fulleren

Eine hochstabile wässrige Kolloidlösung von C₆₀ Fulleren (200 μM, Reinheit> 99,5%, durchschnittliche Nanopartikelgröße bis 50 nm) wurde an der Technischen Universität Ilmenau (Deutschland) wie in [17, 18] beschrieben synthetisiert.

Weltkultur

Die Experimente wurden an der humanen akuten leukämischen T-Zell-CCRF-CM-Zelllinie durchgeführt. Die Zelllinie wurde vom Leibniz-Institut DSMZ – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen erworben:CCRF-CM (ACC 240). Die Zellen wurden in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 2 mM Gluthamin, unter Verwendung von 25 cm ² . kultiviert Kolben bei 37 °C mit 5 % CO₂ im befeuchteten Inkubator.

Zellen in RPMI 1640-Medium wurden mit C₆₀ . inkubiert Fulleren (16 μM) oder HL (2,5, 5 und 10 μM) einzeln und zusammen während 24, 48 und 72 Stunden. Zellüberleben ohne Zugabe von HL oder C₆₀ Fulleren wurde als 100 % erhalten (Kontrollprobe enthielt 0,05 M DMSO).

Cell Viability (MTT) Assay

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch den MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid]-Reduktionsassay bewertet [19]. Zu den angegebenen Zeitpunkten der Inkubation 100 μl-Aliquots (0,5 × 10 ⁴ Zellen) wurden in die 96-Well-Mikrotiterplatten Sarstedt (Nümbrecht, Deutschland) gegeben, 10 µl MTT-Lösung (5 mg/ml in PBS) in jede Vertiefung gegeben und die Platten weitere 2 h bei 37 °C inkubiert. Das Kulturmedium wurde dann durch 100 μl DMSO ersetzt; Die Diformazan-Bildung wurde durch Messung der Absorption bei 570 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät Tecan Infinite M200 Pro (Männedorf, Schweiz) bestimmt.

Tiere

Die Studie wurde an weißen männlichen Ratten der Linie „Wistar“ mit einem Gewicht von 170 ± 5 g durchgeführt. Die Tiere wurden unter Standardbedingungen im Vivarium des ESC „Institute of Biology and Medicine“, Taras Shevchenko National University of Kiew, gehalten. Tiere hatten freien Zugang zu Futter und Wasser. Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit den internationalen Grundsätzen der Europäischen Wirbeltierschutzkonvention unter der Aufsicht des Bio-Ethik-Ausschusses der oben genannten Institution durchgeführt.

Schätzung der Erythrozyten-Hämolyse

Erythrozyten wurden aus heparinisiertem Blut der Ratte "Wistar" gewonnen und in 0,85 % NaCl-Lösung auf 0,700 o.E. verdünnt. bei 630 nm auf dem Scinco-Spektrophotometer (Deutschland). Die Hämolyse von Erythrozyten wurde durch 0,001 N HCl verursacht. Die Kinetik der Hämolyse wurde spektrophotometrisch gemessen (λ = 630 nm) alle 10 s während 2 min. Der Prozentsatz der hämolysierten Erythrozyten wurde wie in [20] dargestellt berechnet. Erythrozyten wurden in 0,85% NaCl-Lösung mit C₆₀ . inkubiert Fulleren (16 μM) oder HL (2,5 und 10 μM) einzeln und zusammen während 1 h. Erythrozyten ohne Zusatz von HL oder C₆₀ Fulleren wurden als 100 % erhalten (die Kontrollprobe enthielt 0,05 M DMSO).

In Silico Studie

Das Doppelhelix-DNA-Molekül wurde als Matrize aus der PDB (Protein Data Bank)-Basis verwendet. Die Wechselwirkung des DNA-Moleküls mit HL getrennt und in Kombination mit C₆₀ Fulleren wurde untersucht. Wir haben die folgenden Strukturen des DNA-Moleküls berücksichtigt:2MIW (CCATCGCTACC - Einlagerung der Verbindung in eine kleine Nut der DNA-Helix), 1XRW (CCTCGTCC - Einlagerung der Verbindung in eine kleine Nut der DNA-Helix) und 2M2C (GCGCATGCTACGCG - Bindung von Verbindung mit großen und kleinen Rillen der DNA-Helix). Wir haben den im QXP-Paket integrierten Algorithmus des systematischen Andockens (SDOCK+) angewendet (diese Methode demonstriert alle möglichen Konformationen der untersuchten Strukturen mit dem minimalen Wert der quadratischen Mittelwertabweichung (RMSD)) [21]. Wir generierten 300 potenziell mögliche Komplexe mit DNA, von denen die zehn besten für die nächste Stufe ausgewählt wurden, mithilfe einer Bewertungsfunktion, die im QXP-Paket integriert ist [22].

Die Wechselwirkungen des DNA-Moleküls mit HL getrennt und in Kombination mit dem C₆₀ Fullerene wurden durch die folgenden Parameter charakterisiert:(1) die Zahl der Wasserstoffbrückenbindungen, (2) die Fläche der Kontaktflächen der DNA und der entsprechenden Struktur, (3) der Abstand zwischen der DNA und der angedockten Struktur und (4) die Gesamtenergie der Bindungsstruktur.

Um die Stabilität der Komplexe der chemischen Verbindung mit C₆₀ . zu beurteilen Fulleren, führten wir die kurze molekulare Dynamik (MD, 100 ps) mit dem Gromacs-Softwaretool [23] gemäß einem Nosé-Poincaré-Anderson-Algorithmus (NPA) [24, 25] basierend auf dem OPLS-AA-Kraftfeld durch [26, 27] .

Die Berechnungen wurden mit den folgenden Parametern durchgeführt:Temperatur (in Kelvin) - 300; Druck (in Kilopascal) - 100; Bindung mit dem Wasserstoffatom oder Liganden wurde durch den Algorithmus begrenzt [25].

Statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittelwert  ± SD von mehr als vier unabhängigen Experimenten dargestellt. Mittelwert (M) und Standardabweichung (SD) wurden für jede Gruppe berechnet. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung einer Zweiwege-ANOVA durchgeführt, gefolgt von Post-Bonferroni-Tests. Ein Wert von p <  0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Datenverarbeitung und das Plotten wurden von IBM PC unter Verwendung der speziellen Anwendungen GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., USA) durchgeführt.

Ergebnisse und Diskussionen

In Silico Studie

Interaktion von HL mit DNA

Es wurde gezeigt, dass HL in die DNA interkalieren und einen stabilen Komplex bilden kann, wenn es über AGC-GCTA-Nukleotide in einer kleinen DNA-Furche gebunden wird (Abb. 3a). In diesem Fall ist die Stapelwechselwirkung zwischen der stickstoffhaltigen Base des A-Nukleotids und der HL-Phenylgruppe sowie die elektrostatische Wechselwirkung zwischen CCl₃ Gruppe und C-Nukleotid wurde gebildet. Nach der MD-Simulation wurden die RMSD-Werte für DNA-Doppelhelix und HL mit 3,3 bzw. 1,62 Å ermittelt. Die Nukleotidumgebung von HL (GCA-CTA) wurde teilweise verändert und die Stapelwechselwirkung ging verloren, während eine Wasserstoffbrücke zwischen dem G-Nukleotid und der CO-Gruppe von HL gebildet wurde.

Wechselwirkung von Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat (HL) mit DNA-Molekül:a , b Einband mit kleinen und großen Rillen; c Einlagerung in eine kleine Furche. Die verwendete DNA-Struktur aus der PDB-Datenbank:a , b —2M2C und c —1XRW

Die Bindung von HL mit einem großen DNA-Groove erfolgte über TCG-AT-Nukleotide (Fig. 3b). In diesem Fall wurde eine Wasserstoffbrücke zwischen der CO-Gruppe von HL und der stickstoffhaltigen Base von A-Nukleotid gebildet und eine Stapelwechselwirkung zwischen sowohl HL-Phenylen als auch stickstoffhaltigen Basen von C- und G-Nukleotiden trat auf. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit einer elektrostatischen Bindung zwischen HL CCl₃ Gruppe und stickstoffhaltige Basen von AT-Nukleotiden erschienen.

Nach der MD-Simulation wurden keine Veränderungen in der Nukleotidumgebung von HL festgestellt. Die RMSD-Werte für DNA und HL betrugen 2,77 bzw. 1,58 Å. Dadurch verschwand die Stapelwechselwirkung zwischen C-Nukleotid und Phenylgruppe.

Im Fall der HL-Interkalation in die DNA bestand seine Umgebung aus CG-CG-Nukleotiden (Abb. 3c). Die Stapelwechselwirkung mit CG-Nukleotiden trat auf:Eine Phenylgruppe wurde zwischen die stickstoffhaltigen Basen geklemmt und die andere bildete eine Stapelwechselwirkung mit dem C-Nukleotid.

Nach der MD-Simulation betrugen die RMSD-Werte für DNA-Doppelhelix und HL 1,71 bzw. 1,89 Å. Die Nukleotidumgebung von HL wurde nicht verändert. Eine der Phenylgruppen bildete eine Ion-π-Wechselwirkung mit der stickstoffhaltigen Base des G-Nukleotids, die um 1,12 Å verschoben zu sein schien.

Die erhaltenen Energieparameter zeigten, dass die Energie sterischer Zusammenstöße zwischen DNA und HL sowie innerhalb von HL selbst unbedeutend war (Tabelle 1).

Wir haben die vergleichende Analyse der Energieparameter der HL-Bindung mit kleinen und großen DNA-Grooves oder seiner Einlagerung in die kleine DNA-Groove durchgeführt. Die Bump-Werte betrugen 6,2 kJ/mol bei der HL-Interkalation in die DNA und 2,5 kJ/mol bei der Bindung mit kleinen und großen DNA-Rillen (Tabelle 1). Die Int-Werte betrugen 8,7 kJ/mol bei der HL-Interkalation in die DNA, 6,3 kJ/mol bei der Bindung mit einer großen DNA-Groove und 3,6 kJ/mol bei der Bindung mit einer kleinen DNA-Groove. Diese Daten zeigten, dass die HL-Bindung mit einer kleinen Furche der DNA am stabilsten war.

Kombinierte Interaktion von HL und C₆₀ Fulleren mit DNA

Zuvor haben wir mithilfe von Computersimulationen gezeigt, dass C₆₀ Molekül könnte mit DNA interagieren und ein stabiles C₆₀ . bilden +DNA-Komplex bei Bindung mit der kleinen DNA-Furche [15]. Wie in Abb. 4 gezeigt, ist C₆₀ Fulleren könnte auch Ionen-π-Bindungen mit CCl₃ . bilden Gruppen von HL-Molekülen.

Kombinierte Wechselwirkung von Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat (HL) und C₆₀ Fulleren mit DNA (HL+C₆₀ oder C₆₀ +HL-Versionen):a , b Einband mit kleinen und großen Rillen, c , d Interkalation in kleine und große Rillen. Die verwendeten DNA-Strukturen der PDB-Datenbank:a , b —2M2C, c —1XRW und d —2MIW

Wir haben zwei Versionen der molekularen Modellierung von HL verwendet, C₆₀ Fulleren- und DNA-Wechselwirkung, die in [16] vorgeschlagen wurden und sich als nützlich für die Interpretation von MD-Simulationsergebnissen erwiesen. Wir haben die 1XRW PDB-Struktur des DNA-Moleküls in der Version verwendet, als zunächst HL und dann C₆₀ Molekül interkaliert in die DNA (HL+C₆₀ ) und 2MIW PDB-Struktur des DNA-Moleküls - in der Version, wenn anfänglich C₆₀ Molekül und dann interkaliert HL in die DNA (C₆₀ +HL).

Die Bindung mit einem kleinen DNA-Groove im Fall von HL+C₆₀ Version erfolgte über GCTA-GCAT-Nukleotide (Fig. 4a). Phenylgruppen füllten eine kleine Furche und gingen in Stapelwechselwirkungen ein:eine Gruppe mit C₆₀ Fulleren und das andere mit der stickstoffhaltigen Base des G-Nukleotids. Die elektrostatischen Wechselwirkungen entstanden zwischen CCl₃ Gruppe von HL und sowohl die stickstoffhaltige Base des G-Nukleotids als auch C₆₀ Fulleren.

Laut MD-Simulationsergebnissen war eine DNA-Doppelhelix in diesem Fall durch eine beträchtliche Mobilität gekennzeichnet (RMSD-Wert beträgt 3,08 Å), der RMSD-Wert für HL betrug 2,04 Å, während C₆₀ Fulleren blieb praktisch unbeweglich. Dadurch wird die Nukleotidumgebung von HL+C₆₀ Struktur wurde durch TGC-GCATG geändert. Außerdem eine Wasserstoffbrücke zwischen der Aminogruppe von HL und DNA und Stapelwechselwirkungen zwischen den Nukleotiden stickstoffhaltiger GC-Basen und C₆₀ Fulleren erschien.

Die Bindung von HL+C₆₀ mit einem großen DNA-Groove erfolgte über C-ATCC-Nukleotide (Fig. 4b). Wasserstoffbrückenbindungen wurden zwischen der HL CO-Gruppe und der stickstoffhaltigen Base von A-Nukleotid gebildet. Phenylgruppen füllten eine große DNA-Furche und gingen eine Stapelwechselwirkung mit C₆₀ . ein Fulleren.

Laut MD-Simulationsergebnissen ist die Nukleotidumgebung von HL+C₆₀ Struktur wurde nicht verändert:die RMSD-Werte für DNA und HL betrugen 3,14 bzw. 2,24 Å, C₆₀ Fulleren blieb praktisch unbeweglich. In diesem Fall alle Interaktionen zwischen HL und C₆₀ Fulleren verschwand und HL interagierte sterisch nur mit DNA. Es wird angenommen, dass als Ergebnis C₆₀ Fulleren sowie HL würden aus der großen DNA-Groove verdrängt.

Wenn HL+C₆₀ in eine kleine DNA-Groove eingelagert wurden (Fig. 4c), erfolgte die Bindung mit CGT-GAG-Nukleotiden. C₆₀ Fulleren wurde in eine kleine DNA-Furche eingebaut und wechselwirkte mit dieser sterisch. HL-Phenylgruppen bildeten Stapelwechselwirkungen mit den stickstoffhaltigen Basen von CG-CG-Nukleotiden. Laut MD-Simulation betrugen die RMSD-Werte für DNA und HL 2,29 bzw. 2,13 Å, C₆₀ Fulleren blieb praktisch unbeweglich und CC1₃ Gruppe von HL ging eine elektrostatische Wechselwirkung mit der stickstoffhaltigen Base des G-Nukleotids ein.

Im Fall von C₆₀ +HL-Version, die Bindung mit einem kleinen DNA-Groove (Fig. 4d) erfolgte über CGC-GCC-Nukleotide. Eine der HL-Phenylgruppen bildete eine Stapelung mit C₆₀ Fulleren und das andere mit G-Nukleotid. Der CC1₃ Gruppe von HL schien eine elektrostatische Bindung mit der stickstoffhaltigen Base des C-Nukleotids zu bilden. Laut MD-Analyse lagen die RMSD-Werte für DNA und HL in diesem Fall bei 2,35 bzw. 2,75 Å, C₆₀ Fulleren blieb unbeweglich und die Nukleotidumgebung von C₆₀ +HL-Struktur wurde durch CGCT-GC verändert. Außerdem ist der C₆₀ Molekül drang tiefer in die DNA ein und bildete eine Stapelwechselwirkung mit der Stickstoffbase des C-Nukleotids.

Gemäß den berechneten Energieparametern bildet sich der Komplex im Fall von C₆₀ Die +HL-Interkalation in eine kleine DNA-Groove war die starrste (der Bump-Wert 20,0 kJ/mol) (Tabelle 1). Im Gegensatz dazu bei HL+C₆₀ Wechselwirkung mit DNA betrug dieser Parameter nur 6,2 kJ/mol bei HL+C₆₀ wurde in einen kleinen DNA-Groove interkaliert, 7,8 kJ/mol, wenn es mit einem kleinen DNA-Groove gebunden war, und 8,8 kJ/mol, wenn es mit einem großen DNA-Groove gebunden war. Außerdem zeigten die Energieparameter, dass die Bildung starker Wasserstoffbrücken in HL+C₆₀ Der +DNA-Komplex war nur im Fall der Bindung mit einer DNA-Hauptfurche möglich, wenn der Hbnd-Wert − 2,3 kJ/mol betrug, bei anderen Interaktionsarten war er gleich null oder − 1,0 kJ/mol (Tabelle 1). Außerdem ergibt sich laut MD in diesem Fall sowohl C₆₀ Fulleren und HL schienen aus einer großen DNA-Groove verdrängt worden zu sein.

Daher C₆₀ +HL-Bindung mit einem kleinen DNA-Groove wird als wahrscheinlichste Version von C₆₀ . angesehen Fulleren, HL und DNA kombinierte Interaktion.

In-vitro-Studie zu biologischen Wirkungen von HL

CCRF-CЕM-Zellen-Lebensfähigkeit

In In-vitro-Experimenten wurde der langfristige Einfluss von Diphenyl-N(trichloracetyl)-amidophosphat (HL) im Bereich von 2,5–10 μM auf die Lebensfähigkeit menschlicher leukämischer CCRF-CЕM-Zellen mittels MTT-Test abgeschätzt. Die Zellen wurden 24, 48 und 72 h in RPMI-1640-Medium mit entweder 16 μM C₆₀ . inkubiert Fulleren oder HL allein oder deren Kombination. Lebensfähigkeit von Zellen, die ohne C₆₀ . inkubiert wurden oder HL wurde als 100 % angesehen.

Nach 24 h Inkubation wurde keine Wirkung von HL auf die Lebensfähigkeit von CCRF-CЕM-Zellen beobachtet (Abb. 5). Noch bei längerer Inkubation wurde die zytotoxische Aktivität von HL in einer Konzentration von 5 und 10 μM offensichtlich, die Lebensfähigkeit der Zellen wurde nach 48 h um 25 bzw. 33 % gehemmt und fiel nach 72 h weiter ab.

Lebensfähigkeit von CCRF-CEM-Zellen, die mit Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat (HL) in verschiedenen Konzentrationen inkubiert wurden. (M ± m, n = 8); *p < 0,05 im Vergleich zu Kontrollzellen

Es sollte beachtet werden, dass die Lebensfähigkeit der CCRF-CЕM-Zellen um 50 % (IC₅₀ ) wurde nach 72 h unter Einwirkung von HL in einer Konzentration von 10 μM nachgewiesen (Abb. 5). Kürzlich haben wir gezeigt, dass ein anderes CAPh-Repräsentant Dimorfolido-N-trichloracetylphosphorylamid eine 50%ige Abnahme der Lebensfähigkeit von CCRF-CЕM-Zellen bei 72 h in einer Konzentration von 1 mM verursachte [16]. Die vergleichende Analyse dieser Daten zeigt, dass die Einführung von Phenoxy- anstelle von Morfolido-Gruppen in die Struktur des CAPh-Derivats eine Verringerung seiner wirksamen toxischen Konzentration gegen Leukämiezellen um zwei Größenordnungen ermöglicht. Wir nehmen an, dass die konformative Flexibilität von –P(O)(OC₆ H₅ ) Kern sorgte für eine effektivere Wechselwirkung dieser Verbindung mit der DNA.

Kein Einfluss von C₆₀ allein verwendetes Fulleren auf die Lebensfähigkeit der Zellen während der Inkubationszeit wurde nachgewiesen (Daten nicht dargestellt). Gleichzeitig zeigen die in Abb. 6 gezeigten Ergebnisse, dass C₆₀ Fulleren verstärkte die zytotoxische Aktivität von HL gegen CCRF-CЕM-Zellen. Unter kombinierter Aktion von C₆₀ Fulleren und HL wurde eine 50%ige Abnahme der Zellviabilität bei einer niedrigeren HL-Konzentration (5 μM) und zu einem früheren Zeitraum (48 h) der Inkubation beobachtet als unter der Wirkung von HL allein. Außerdem nach 72 Stunden kombinierter Wirkung von C₆₀ Fulleren und HL wurde die zytotoxische Wirkung von HL in einer niedrigen Konzentration von 2,5 μM nachgewiesen, bei der HL selbst keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen hatte (Abb. 6).

Lebensfähigkeit von CCRF-CEM-Zellen, inkubiert mit Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat (HL) allein oder in Kombination mit 16 μM C₆₀ Fulleren. (M ± m, n = 8); *p <  0,05 im Vergleich zu Kontrollzellen; ^# p < 0,05 im Vergleich zu HL

Also C₆₀ Es wurde gezeigt, dass Fulleren die zytotoxischen Wirkungen von HL verstärkt und die Empfindlichkeit der Leukämiezellen gegenüber seiner Wirkung in einer niedrigen Konzentration signifikant erhöht. Berücksichtigen Sie, dass C₆₀ Fulleren kann sich innerhalb von 24 h in Leukämiezellen anreichern [28] und sich in intrazellulären Kompartimenten [29,30,31], insbesondere im Zellkern, lokalisieren [32, 33], seine Wechselwirkung mit der Kern-DNA von aktiv proliferierten Krebszellen sollte nicht ausgeschlossen werden.

Die in vitro erhaltenen Daten stimmen also mit den Ergebnissen einer In-silico-Studie überein und zeigen, dass die anfängliche Bindung von C₆₀ Molekül und dann von HL mit kleiner DNA-Groove unter Bildung eines stabilen Komplexes könnte einer der möglichen Gründe für ihre synergistische Hemmung der CCRF-CЕM-Zellen-Proliferation sein.

Hämolyseresistenz der Erythrozyten

Zur Einschätzung des Antikrebspotenzials von HL und C₆₀ Fulleren-Kombination ist es wichtig, die möglichen Auswirkungen auf nichtmaligne Zellen, insbesondere auf Blutzellen, zu berücksichtigen.

Die Untersuchung der Resistenz der Erythrozyten gegenüber saurer Hämolyse ermöglicht es, den Einfluss des pharmakologischen Wirkstoffs auf Membranebene aufzuklären. Die Dynamik der Hämolyse spiegelt die Dynamik der Zerstörung der Plasmamembran von Erythrozyten und damit die Stabilität ihrer strukturellen Organisation wider. In Abb. 7 wurde die Abhängigkeit des Prozentsatzes der Hämolyse Erythrozyten für 1 h in NaCl-Lösung ohne Zusätze (Kontrolle) und entweder mit HL oder C₆₀ . inkubiert Fulleren allein oder in Kombination. Kein Einfluss von 16 μM C₆₀ Fulleren bei Erythrozyten-Hämolyse wurde nachgewiesen (nicht gezeigt). HL in einer Konzentration von 2,5 μM allein oder in Kombination mit C₆₀ beeinflusste die Hämolyseresistenz der Erythrozyten (Abb. 7). Währenddessen wurde unter der Wirkung von HL in einer Konzentration von 10 μM eine Beschleunigung der Hämolyse mit einem Maximum bei 20 s festgestellt. Kombinierte Wirkung von 10 μM HL und C₆₀ auf Fulleren folgte eine weitere Intensivierung der Hämolyse mit 60 % der hämolysierten Erythrozyten nach 20 s.

Hämolyseresistenz der Erythrozyten in Gegenwart von Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat (HL) einzeln und in Kombination mit 16 μM C₆₀ Fulleren. (M ± m, n = 8)

Die erhaltenen Daten zeigten, dass die Anwendung von C₆₀ Fulleren in Kombination mit 2,5 μM HL hatte keinen schädlichen Einfluss auf die strukturelle Stabilität der Bluterythrozytenmembran und ermöglichte gleichzeitig eine signifikante Erhöhung der zytotoxischen Aktivität von HL in dieser niedrigen Konzentration gegen Leukämiezellen. Trotz der synergetischen zytotoxischen Wirkung von C₆₀ Fulleren und HL in einer Konzentration von 10 μM gegen Leukämiezellen, schien die Anwendung ihrer Kombination durch die Verstärkung der hämolytischen Wirkung eingeschränkt zu sein.

Schließlich ist im Zusammenhang mit der obigen In-vitro-Studie wichtig zu betonen, dass eine Wasser/Feststoff-Grenzfläche begrenztes Wasser aufweist, was ebenfalls sowohl den Transport, die thermodynamischen Eigenschaften von Nanostrukturen [34, 35] als auch deren Wechselwirkung mit Zellmembranen beeinflussen kann [36].

Es gibt Literaturdaten zur intrazellulären Lokalisation von Carbacylamidophosphat-Derivaten, insbesondere zur Penetration von Phosphoramidaten in die Zellen. So können Phosphoramidat-Derivate die Membran von MDA-231-Brustkrebs- und Lungenkrebs-Zelllinien (H460, H383 und H2009) durchdringen [37]. Es wurde gezeigt, dass Nitrobenzylphosphoramid-Senf durch die Zellmembranen dringen und in Mitochondrien von NTR ⁺ . lokalisiert sind Säugerzellen [10]. Es ist nicht ausgeschlossen, dass C₆₀ Fulleren, das aufgrund passiver Diffusion oder Endozytose in die Membran der Krebszelle eindringen kann [28, 30, 32] mit Anreicherung im Zellkern und in den Mitochondrien [30, 32, 33], könnte ein Transporter für kleine Antitumormoleküle sein [ 38,39,40].

Schlussfolgerungen

Ein neuer Vertreter von Carbacylamidophosphat-Derivaten mit zwei Phenoxy-Substituenen in der Nähe der Phosphorylgruppe Diphenyl-N-(trichloracetyl)-amidophosphat (HL) wurde synthetisiert und als zytotoxischer Wirkstoff selbst und in Kombination mit C₆₀ . getestet Fulleren. Laut molekularen Simulationsergebnissen, wenn C₆₀ Fulleren und dann HL mit einer kleinen DNA-Groove gebunden wurden, wurde ein starrer Komplex gebildet, der durch Stapelwechselwirkungen von HL-Phenylgruppen mit C₆₀ . stabilisiert wurde Fulleren und DNA G Nukleotid, sowie durch Wechselwirkungen von HL CCl₃ Gruppierung durch Ionen-π-Bindungen mit C₆₀ Molekül und durch elektrostatische Bindungen mit dem DNA-G-Nukleotid.

Mit dem MTT-Test haben wir die zytotoxische Aktivität von HL gegen menschliche leukämische CCRF-CM-Zellen mit IC₅₀ . gezeigt value detected at 10 μM concentration at 72 h of cells treatment. The cytotoxic effect of HL was facilitated by C₆₀ fullerene. Under combined action of 16 μM C₆₀ fullerene and HL, the value of IC₅₀ was detected at lower 5 μM HL concentration and at earlier 48 h period of incubation and besides the cytotoxic effect of HL was observed at a low 2.5 μM concentration at which HL by itself had no influence on cell viability.

Previously, we have shown a significant toxic effect of dimorfolido-N-trichloroacetylphosphoramide against human leukemic cells of different origin, but its effective concentration was high and no enhancement of toxicity after combined action with C₆₀ fullerene was observed [16]. We assume that introduction of flexible of –P(O)(OC₆ H₅ ) groups instead of morfolido groups into CAPh derivative contributed to lowering of its toxic concentration against human leukemic cells ensuring its effective interaction with C₆₀ molecule and DNA. Binding of C₆₀ fullerene and HL with minor DNA groove with formation of a stable complex is assumed to be one of the possible reasons of their synergistic inhibition of CCRF-CЕM cells proliferation.

We have revealed that application of C₆₀ fullerene in combination with 2.5 μM HL had no harmful effect on structural stability of blood erythrocytes membrane, while combination of C₆₀ fullerene with 10 μM HL appeared to be limited by intensification of hemolytic effect.

Thus, C₆₀ fullerene was shown to potentiate cytotoxic effect of HL and to increase significantly human leukemic cells sensitivity to its action in a low concentration. A combination of C₆₀ fullerene with HL in a low concentration 2.5 μM may be promising for further biomedical studies.

Abkürzungen

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

DNA:

Deoxyribonucleic acid

FBS:

Fötales Rinderserum

HL:

Diphenyl-N-(trichloroacetyl)-amidophosphate

IR:

Infrared spectroscopy

MD:

Molecular dynamics

MTT:

3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide

NMR:

Nuclear magnetic resonance

RPMI - 1640 medium:

Roswell Park Memorial Institute medium