Polydopamin-basierte Verbundnanopartikel mit redoxlabilen Polymerhüllen für die kontrollierte Wirkstofffreisetzung und verbesserte chemo-photothermische Therapie

Einführung

Die photothermische Therapie (PTT), eine nicht-invasive lokale Krebsbehandlung, hat aufgrund ihrer hohen Selektivität und minimalen Nebenwirkungen große Aufmerksamkeit in der Krebstherapie auf sich gezogen [1]. Bei der PTT wird die verabreichte Nahinfrarot-(NIR)-Laserbelichtung von den Mitteln der photothermischen Umwandlung (PTC) absorbiert und in eine lokale Hyperthermie umgewandelt, die zur Tumorablation führt [2,3,4]. Bei einer Vielzahl von Nanomaterialien wurde der PTC-Effekt nachgewiesen, wie z. B. Gold-Nanostrukturen [5,6,7], kohlenstoffbasierte Nanomaterialien [8,9,10,11,12], Fe₃ O₄ Nanocluster [13,14,15], CuS-Nanokristalle [16] und natürliches Melanin [17], die alle eine starke optische Absorption im optischen Fenster des NIR-Gewebes aufweisen. Unter diesen PTC-Wirkstoffen zeigt Polydopamin (PDA), eine Nachahmung der in Muscheln vorkommenden Adhäsionsproteine, eine starke NIR-Absorption, eine hohe PTC-Effizienz (40 %), eine ausgezeichnete Biokompatibilität und biologische Abbaubarkeit, die bei der Anwendung von PTT umfassend erforscht wurden [ 18, 19]. Die einmalige Anwendung von PTT zeigt jedoch aufgrund der unzureichenden Wärmeabgabe in der Zielregion eine begrenzte klinische Wirksamkeit, ohne das umgebende normale Gewebe zu schädigen [20]. Um dieses Problem anzugehen, wurde die chemo-photothermische Therapie mit der Kombination von Hyperthermie und Chemotherapeutika von vielen Forschern wegen ihrer synergistischen Wirkung genutzt, die aus der geförderten Wirkstoffabgabe in Tumoren und der erhöhten Wirkstofftoxizität durch Hyperthermie resultiert [21, 22].

Um einen optimierten Behandlungseffekt zu erzielen, widmen sich die aktuellen Arbeiten der Entwicklung eines neuartigen therapeutischen Nanopartikels mit leistungsstarker photothermischer Umwandlung, ausgezeichneter Wirkstoffbeladungsfähigkeit und kontrolliertem Wirkstofffreisetzungsverhalten. In unserem System wurde eine „intelligente“ Polymerschicht eingeführt, die durch einen spaltbaren Linker vernetzt wurde, um Abbaubarkeit und kontrollierte Wirkstofffreisetzung von Trägern in einer getriggerten Weise zu ermöglichen. Disulfidbindungen, die durch freie Thiole gespalten werden können, sind aufgrund ihrer empfindlichen Reaktion auf den Redoxzustand, der hohen Stabilität im Blutkreislauf und der guten Biokompatibilität ein vielversprechender Kandidat als spaltbarer Linker [23]. Wirkstoffträger, die Disulfidbrücken enthalten, können beim Eintritt in Tumorzellen selektiv abgebaut werden, in denen die reduzierende Glutathion (GSH)-Konzentration (ca. 2–10 mM) viel höher ist als die in den extrazellulären Flüssigkeiten [24,25,26]. Hier wurde eine neue Art von Verbundnanopartikeln bestehend aus PDA-Kugeln als Kern und Disulfidbindung vernetzter Poly(methacrylsäure) (PMAA) als Hülle hergestellt, bezeichnet als PDA@PMAA, die die PTC-Wirksamkeit des PDA-Kerns und die redoxlabile Eigenschaft der Polymerhülle. Die Struktur, die Eigenschaften und das Wirkstofffreisetzungsverhalten von PDA@PMAA-Komposit-Nanopartikeln wurden untersucht und die chemo-photothermische therapeutische Wirkung wurde mittels MTT-Assay weiter nachgewiesen.

Methoden/Experimental

Materialien

Dopaminhydrochlorid (DA-HCl) und Methacryloylchlorid und Glutathion (GSH) wurden von Aladdin Reagent Corporation, Shanghai, VR China bezogen. Methacrylsäure (MAA) und N,N’ -Bis(acryloyl)cystamin (BAC) wurde von Sigma-Aldrich bezogen. 2,2-Azobisisobutyronitril (AIBN) wurde von Sinopharm Chemical Reagent Company bezogen und aus Ethanol umkristallisiert. Wässrige Ammoniaklösung (NH₃ .) •H₂ O, 30%), Acetonitril und wasserfreies Ethanol wurden von Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Company bezogen. Doxorubicin (DOX) in Form des Hydrochloridsalzes wurde von der Beijing Huafeng United Technology Company bezogen. MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)-Assay und andere biologische Reagenzien wurden von Invitrogen Corp. bezogen. Calcein-AM wurde von Bojin Biotech, Inc. (Xi'an) bezogen. . Alle chemischen Reagenzien waren von analytischer Qualität oder besser und wurden ohne weitere Reinigung verwendet, außer wie oben erwähnt.

Charakterisierung

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Bilder wurden auf einem Tecnai G2 20 TWIN Transmissionselektronenmikroskop (FEI, USA) beobachtet. Die hydrodynamischen Durchmesser und Zeta-Potentiale der Partikel wurden mit einem Partikelgrößenanalysator mit dynamischer Lichtstreuung (DLS) (Malvern Nano-ZS90) bei einem Streuwinkel von 90° gemessen. UV-Vis-Spektren wurden mit einem Perkin-Elmer Lambda 750 Spektrophotometer bei Raumtemperatur durchgeführt. Fourier-Transformations-Infrarot-(FT-IR)-Spektren wurden unter Verwendung von KBr-gepressten Platten auf einer Nicolet 6700 FTIR-Spektroskopie aufgezeichnet. Die NIR-Heizwirkung von PDA- und PDA@PMAA-Nanopartikeln wurde mit einem 808-nm-Dauerstrich-NIR-Laser (Changchun New Industries Optoelectronics Technology, Changchun, China; Spotgröße:6 mm × 7 mm) mit Laserbestrahlung mit einer Leistung charakterisiert Dichte von 5 W cm ⁻² für 300 s. Die Temperatur vor und nach der Beleuchtung wurde mit einem Thermoelement mit einer Genauigkeit von 0,1 ^° . gemessen C. Die Zellbilder wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM, Leica TCS SP8 STED 3X) aufgenommen.

PDA@PMAA Verbund-Nanopartikel

Die Synthese von PDA-Kugeln wurde in einer gemischten Lösung aus entionisiertem Wasser (90 ml), Ethanol (40 ml) und NH₃ . durchgeführt •H₂ O (3 ml), Zugabe von 0,5 g Dopaminhydrochlorid. Die Lösung wurde bei 30 ^° . gerührt C für 24 h, und das Produkt wurde zentrifugiert und gewaschen. Die PMAA-Hülle wurde durch Destillation-Fällungs-Polymerisation gemäß unserer früheren Arbeit synthetisiert. MAA (100 mg), BAC (10 mg) und AIBN (3 mg) wurden in 25 ml Acetonitril gelöst, gefolgt von der Zugabe von 50 mg der wie hergestellten PDA-Kugeln. Dann wurde die Mischung auf 100 ^° . erhitzt C für 2 h gerührt, und das Produkt wurde zentrifugiert und gewaschen. Das Massenverhältnis von PDA und MAA wurde von 0,5 bis 6 variiert, um die Dicke der PMAA-Schale abzustimmen, und Einzelheiten der Rezeptur sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Photothermische Effekte von PDA@PMAA

Die wässrige Dispersion von PDA@PMAA (50 μg mL ⁻¹ ) in einer 96-Well-Zellplatte (100 μl pro Well) wurde mit einem 808-nm-NIR-Laser (5 W cm ⁻² .) beleuchtet ) und die Temperaturen vor und nach der Beleuchtung wurden gemessen.

Laden und Freigeben von Medikamenten

DOX wurde als Modellarzneimittel ausgewählt, um die Wirkstoffbeladung und die kontrollierte Freisetzungsleistung von PDA- oder PDA@PMAA-Nanopartikeln zu untersuchen. Spezifische Schritte bezogen sich auf unsere früheren Arbeiten [27, 28]. Kurz gesagt, 10 mg PDA- oder PDA@PMAA-1-Nanopartikel wurden in 1 ml wässriger DOX-Lösung (1 mg ml ^-1 .) dispergiert ), die zuvor auf pH 8,0 eingestellt wurde. Nach 24 h sanftem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Dispersion zentrifugiert, um die DOX-beladenen PDA@PMAA-Nanopartikel zu sammeln (12.000 U/min, 10 min) und dann zweimal mit entionisiertem Wasser gewaschen, um unbeladenes DOX zu entfernen. Die UV-Absorptionsspektren des Überstands wurden gemessen und die Intensität bei 480 nm wurde verwendet, um die Beladung und Freisetzung von DOX zu analysieren. Der Wirkstoffbeladungsgehalt (LC) und die Einkapselungseffizienz (EE) wurden gemäß den folgenden Formeln ausgedrückt:LC (%) =(Gewicht des beladenen Wirkstoffs)/(Gesamtgewicht der Nanopartikel); EE (%) =(Gewicht des geladenen Arzneimittels)/(Gewicht des anfänglich hinzugefügten Arzneimittels).

In-vitro-Freisetzungsstudie wurde bei 37 °C in Phosphatpuffer (pH 7,4 und 5,5) mit oder ohne GSH durchgeführt. Typischerweise wurden DOX-beladene PDA@PMAA-Nanopartikel, die in dem entsprechenden Puffer dispergiert waren, in einen Dialysebeutel (Molekulargewichtsgrenzwert 14.000 Da) gegeben und dann in 100 ml des Freisetzungsmediums eingetaucht. Die Proben wurden bei 37 ^° . gehalten C unter ständigem Schütteln. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden 2 ml externer Puffer für die UV-Vis-Spektrenanalyse entnommen und mit einem gleichen Volumen an frischem Medium aufgefüllt. Alle DOX-Freisetzungsdaten wurden über drei Messungen gemittelt, und der Freisetzungsgehalt wurde nach der Formel berechnet:Freisetzungsgehalt (%) =(Menge des Arzneimittels im Freisetzungsmedium)/(Menge des in Nanopartikel geladenen Arzneimittels) × 100. Die Arzneimittelfreisetzung Das Verhalten von DOX-beladenen PDA@PMAA-Nanopartikeln bei Laserbestrahlung in Phosphatpuffer pH 7,4 wurde nach einem ähnlichen Verfahren durchgeführt. NIR-Licht wurde 5 Minuten pro Stunde angewendet.

In-vitro-Zelltest

HEK-293T-Zellen (humane embryonale Nierenzellen, normale Zellen) und A549-Zellen (humane Lungenadenokarzinom-Epithelzellen, Krebszellen) wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % FBS (fötales Rinderserum), Penicillin (100 U ml ⁻¹ ) und Streptomycin (100 mg ml ⁻¹ ) in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ bei 37 °C.

Um die zelluläre Aufnahme zu beobachten, A549-Zellen (1 × 10 ⁴ Zellen pro Well) wurden in 1,5 ml Medium in 6-Well-Platten ausgesät. Das Medium wurde nach 24 h durch das Medium ersetzt, das DOX-beladene PDA@PMAA-Nanopartikel enthielt. Nach 1 h oder 4 h wurden frisches DMEM und PBS zugegeben, um die nicht von den Zellen internalisierten freien Nanopartikel vor der Fluoreszenzbeobachtung abzuwaschen. Die intrazelluläre Verteilung der Nanopartikel wurde durch CLSM beobachtet. Die Fluoreszenz wurde bei λ . abgebildet _EX (488 nm) für DOX, und die Falschfarbe wurde künstlich auf Rot gesetzt.

Die Zytotoxizität von DOX-beladenen und leeren PDA@PMAA-Nanopartikeln gegen A549-Zellen wurde durch den Standard-MTT-Assay bestimmt. Die Zellen (mit einer Dichte von 10 ⁴ Zellen pro Well) wurden in 96-Well-Platten für 24 h inkubiert, um eine Zellanheftung zu ermöglichen. Dann wurden den Zellen DOX-beladene und leere PDA@PMAA-Nanopartikel bzw. freies DOX in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt. Für die NIR-Lasergruppen ist der Laser (λ =808 nm) wurde angewendet, um die Zellen mit einer Leistungsdichte von 5 W cm ⁻² . zu bestrahlen für 300 s nach 1 h Inkubation. Dann, nach einer Inkubationszeit von 24 h bei 37 ^° C, 20 μl MTT-Lösung (5 mg ml ⁻¹ in Phosphatpuffer) wurde durch frisches DMEM mit MTT (5 mg mL ⁻¹ ) und die Zellen wurden für weitere 4 h inkubiert. Als nächstes wurde der Überstand entfernt und 150 &mgr;l Dimethylsulfoxid (DMSO) wurden in jede Vertiefung gegeben, um das Formazan aufzulösen. Die Extinktion wurde bei 570 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers nach 10 min Inkubation überwacht. Jeder Datenpunkt wurde gesammelt, indem der Durchschnitt von fünf Vertiefungen gebildet wurde, und die unbehandelten Zellen wurden als Kontrollen verwendet. Die prozentuale Lebensfähigkeit der Zellen wurde berechnet, indem die Extinktion der Kontrollzellen mit der der behandelten Zellen verglichen wurde. Der gleiche Prozess der Zytotoxizität von leeren Verbund-Nanopartikeln gegen HEK-293T-Zellen wurde wie oben erwähnt durchgeführt.

Um die Antitumorwirkung der PDA@PMAA-Nanopartikel und DOX-beladenen PDA@PMAA-Nanopartikel mit oder ohne NIR-Laserbestrahlung zu visualisieren, wurden Zellen in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 3 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen pro Vertiefung. Die Zellen wurden den PDA@PMAA-1-Nanopartikeln, DOX-beladenen PDA@PMAA-1-Nanopartikeln oder freiem DOX für 24 h bei einer Nanopartikelkonzentration von 100 μg mL ⁻¹ . ausgesetzt oder äquivalente DOX-Konzentration von 5 μg mL ⁻¹ . Für die NIR-Lasergruppen ist der Laser (λ =808 nm) wurde angewendet, um die Zellen mit einer Leistungsdichte von 5 W cm ⁻² . zu bestrahlen für 300 s nach 1 h Inkubation. Anschließend wurden die Zellen mit Calcein-AM für 30 min inkubiert, dreimal mit PBS gewaschen und mit CLSM bei λ . beobachtet _EX (490 nm).

Ergebnisse und Diskussion

Herstellung und Charakterisierung von PDA@PMAA-Nanopartikeln

PDA-Kugel wird unter Grundbedingung via . hergestellt Lösungsoxidationsverfahren. Die chemische Beschichtung der PDA-Kugel mit einer Disulfid-vernetzten Polymerschicht wurde durch ein Destillations-Fällungs-Polymerisationsverfahren erreicht, das MAA und BAC als Monomer bzw. Vernetzer verwendet (Abb. 1). Dieses multifunktionale Verbund-Nanopartikel bietet in drei Aspekten viele Vorteile gegenüber anderen therapeutischen Nanopartikeln. Erstens zeigt der PDA-Kern eine hervorragende photothermische Leistung unter NIR-Bestrahlung. Zweitens bietet der Einbau einer Disulfidbindung einen selektiven Abbau von Polymerhüllen sowie eine kontrollierte Wirkstofffreisetzung beim Eindringen in Krebszellen. Drittens verleiht die PMAA-Hülle den Nanopartikeln eine ausgezeichnete kolloidale Stabilität. Die Dicke der PMAA-Schicht könnte durch Einstellen des Massenverhältnisses von MAA- und PDA-Kugeln gesteuert werden. Abbildung 2 zeigt die TEM-Bilder der erhaltenen PDA-Kugeln und PDA@PMAA-Nanopartikel. Es ist klar, dass sowohl PDA- als auch PDA@PMAA-Nanopartikel monodispers und kugelförmig sind. Die PDA-Kugeln hatten einen durchschnittlichen Durchmesser von ~ 100 nm und die Größe der PDA@PMAA-Hybrid-Nanopartikel lag im Bereich von 120 ± 5 bis 200 ± 10 nm mit dem Massenverhältnis von PDA zu MAA im Bereich von 0,5 bis 6. Die hydrodynamische Größe (D _h ) und die Größenverteilung der PDA- und PDA@PMAA-Nanopartikel wurden auch durch dynamische Lichtstreuung (DLS) charakterisiert, wie in Tabelle 2 gezeigt. Die PDA@PMAA-Nanopartikel hatten eine enge Größenverteilung, typischerweise mit einem PI-Wert von 0.09–0.14. Das D_h der Serie von PDA@PMAA-Nanopartikeln lagen im Bereich von 176 bis 349 nm, indem das Massenverhältnis von PDA zu MAA variiert wurde, was dem Trend des Größenwachstums aus der TEM-Beobachtung entsprach. Insbesondere die D_h der Komposit-Nanopartikel waren größer als die durch TEM bestimmte Größe, was darauf hindeutet, dass die Komposit-Nanopartikel in wässrigem Medium stark gequollen sind [29]. Das ζ-Potential von PDA-Nanopartikeln betrug – 26.8 mV aufgrund der Catechol-Gruppen auf der PDA-Oberfläche. Das ζ-Potential von PDA@PMAA-Nanopartikeln änderte sich von − 30.2 auf 33.2, was darauf hindeutet, dass Carboxylgruppen von der PMAA-Schale stammen.

Schematische Darstellung der Synthese, des photothermischen Effekts, der Wirkstoffbeladung und der stimuli-responsiven Wirkstofffreisetzung von PDA@PMAA-Nanopartikeln

TEM-Bilder von PDA@PMAA-Nanopartikeln (Maßstabsbalken, 200 nm). a PDA. b [email protected]. c PDA@PMAA-1. d PDA@PMAA-2. e PDA@PMAA-4. f PDA@PMAA-6

Da MAA pH-reaktiv ist, kann gefolgert werden, dass PDA@PMAA-Nanokügelchen auch eine pH-Empfindlichkeit aufweisen. Wie in Abb. 3 gezeigt, wurden die PDA@PMAA-1-Nanopartikel als Beispiel genommen, um die pH-Abhängigkeit der hydrodynamischen Größe von PMAA-beschichteten Nanopartikeln zu untersuchen. Es ist ersichtlich, dass die PDA@PMAA-1-Nanopartikel in Phosphatpuffer von pH 8,5 einen hydrodynamischen Durchmesser von etwa 240 nm aufweisen; während in einer sauren Umgebung von pH 3,0 ihre hydrodynamische Größe stark auf ca. 150 nm. Da die PMAA-Polymerketten bei hohen pH-Werten stark ionisiert sind und die starke elektrostatische Abstoßung zwischen Polymerketten zu einer Vergrößerung der hydrodynamischen Größe führte, führt der niedrige Ionisierungsgrad der PMAA-Ketten bei niedrigem pH-Wert zu einer Größenschrumpfung [30]. Die pH-responsiven PDA@PMAA-Nanopartikel weisen ein großes Potenzial für die kontrollierte Wirkstofffreisetzung in Tumorzellen (pH-Wert unter 6,5) auf, da der Zusammenbruch der schwammartigen Polymerschicht die Wirkstofffreisetzung erleichtern könnte. Die chemischen Strukturen von PDA@PMAA-Nanopartikeln wurden durch Fourier-Transform-Infrarot(FTIR)-Spektroskopie charakterisiert (Abb. 4). In den Spektren der BAC- und PDA@PMAA-Nanopartikel erscheinen die Banden bei 1650 und 1550 cm ⁻¹ , die den typischen Amid-I- und -II-Banden von BAC zugeschrieben werden, zeigten, dass der Vernetzer BAC erfolgreich in das Komposit-Nanopartikel eingeführt wurde [25]. Der Peak bei 1706 cm ⁻¹ , die zu der Streckschwingung von C=O-Gruppen in PMAA gehört, kann in anderen PDA@PMAA-Nanopartikeln als PDA-Nanopartikeln deutlich gesehen werden, was auf eine erfolgreiche Beschichtung der PMAA-Schicht hinweist.

Hydrodynamischer Durchmesser von PDA@PMAA-1-Nanopartikeln in Phosphatpuffer bei verschiedenen pH-Werten

FTIR-Spektren von BAC-Vernetzern, PDA-Nanopartikeln und PDA@PMAA-Nanopartikeln (von oben nach unten)

Photothermische Wirkung von PDA@PMAA-Nanopartikeln

Die Absorptionsintensität im NIR-Bereich ist der Hauptfaktor, der die PTC-Fähigkeit eines PTC-Mittels bestimmt. Um die Lichtabsorptionsfähigkeit von PDA@PMAA-Nanopartikeln zu untersuchen, sind ihre UV-Vis-Spektren in Abb. 5a zusammengefasst. Es ist ersichtlich, dass jede Probe eine offensichtliche Absorption im NIR-Bereich von 600 bis 1000 nm aufweist. Im Vergleich zu PDA@PMAA weist PDA die höchste Absorption bei 808 nm bei einer äquivalenten Massenkonzentration auf. Die Absorption von PDA@PMAA-Nanopartikeln nahm mit der Abnahme der PMAA-Schalendicke zu (von PDA@PMAA-6 auf [email protected]). Die starke optische Absorption im NIR-Bereich ermutigte uns, den photothermischen Effekt von PDA@PMAA weiter zu untersuchen. Wie in Abb. 5b gezeigt, wurde die photothermische Wirkung von PDA und wässriger PDA@PMAA-Dispersion bei einer Konzentration von 100 μg mL ⁻¹ . gemessen bestrahlt mit einem 808-nm-Laser bei 5 W cm ⁻² für 300 s. Als Negativkontrolle wurde reines Wasser verwendet. Die Temperatur der PDA-Dispersion wurde um 41 ^° . erhöht C und höher als bei allen PDA@PMAA-Proben, was mit seiner maximalen Absorption bei 808 nm übereinstimmt. Die Temperaturerhöhung durch PDA@PMAA-Dispersionen kann von 17 bis 33 ^° . betragen C mit der Abnahme der PMAA-Schalendicke (von PDA@PMAA-6 auf [email protected]), viel höher als die durch reine Wasserkontrolle verursachte (nur bis 3.5 ^° . erreichen) C). Frühere Studien legten nahe, dass eine Wärmetherapie mit einer Temperatur über 55 ^° C zeigte große Vorteile bei der thermischen Ablation von soliden Tumoren [31]. Vergleicht man den maximalen Temperaturanstieg einer Reihe von PDA@PMAA-Nanopartikeln, nur [email protected] (58 ^° C) und PDA@PMAA-1 (56 ^° C) kann bis zu 55 ^° . erreichen C. Da die PMAA-Hülle eine gewisse Dicke haben sollte, um ihre Wirkstoffbeladungskapazität sicherzustellen, wurde PDA@PMAA-1 als repräsentativ für die folgenden Experimente ausgewählt.

a UV-Vis-Spektren von PDA und wässriger PDA@PMAA-Dispersion bei einer Konzentration von 100 μg mL ⁻¹ . b Photothermische Wirkung von PDA und wässriger PDA@PMAA-Dispersion bei einer Konzentration von 100 μg mL ⁻¹ wurden durch Laserbestrahlung gemessen (λ =808 nm, 5 W cm ⁻² )

In-vitro-Wirkstofffreisetzung

Doxorubicin (DOX) wurde als Modellarzneimittel ausgewählt, um die potenzielle Fähigkeit von PDA@PMAA-1-Komposit-Nanopartikeln zu bestätigen, das verkapselte Arzneimittel unter reduktiven Bedingungen freizusetzen. Die Beladung der Komposit-Nanopartikel mit DOX wurde bei einem theoretischen Wirkstoffgehalt von 9,1 Gew.-% und einer Polymerkonzentration von 10 mg mL ⁻¹ . durchgeführt , und der endgültige Wirkstoffbeladungsgehalt und die Einkapselungseffizienz betrugen 5,1% bzw. 53,7%. Es zeigte, dass DOX effizient in das Polymernetzwerk geladen werden kann. Zum Vergleich wurden auch DOX-beladene PDA-Nanopartikel hergestellt, deren DOX-Beladungsgehalt 3,7 % betrug. Die höhere Wirkstoffbeladungskapazität von PDA@PMAA-1-Nanopartikeln kann auf die starke elektrostatische Wechselwirkung zwischen der Aminogruppe der DOX-Moleküle und den Carboxylgruppen der PMAA-Ketten zurückgeführt werden [25]. In Anbetracht dessen, dass die PMAA-Schale redox-spaltbare Disulfidbindungen trägt, werden die vorgeladenen Wirkstoffe getriggert, um vorgeladene Wirkstoffe unter reduzierenden Bedingungen effizient freizusetzen. Unter Berücksichtigung der leicht sauren Tumormikroumgebung und des enormen Unterschieds der GSH-Konzentration zwischen intrazellulär (1–10 mM) und Plasma (20–40 μM) wurden die In-vitro-Experimente zur Wirkstofffreisetzung entworfen und unter Verwendung von Phosphatpuffern mit pH 7,4 und 5,5 durchgeführt mit oder ohne 10 mM GSH zur Nachahmung der Tumorzell- und Blutkreislaufumgebung [23, 32, 33]. Wie in 6 gezeigt, beträgt die Freisetzungsmenge des Arzneimittels über einen Zeitraum von 24 h nur 10,8 %, was darauf hindeutet, dass DOX stabil in den PDA@PMAA-1-Nanopartikeln gehalten wurde, wenn sie unter physiologischen Bedingungen dispergiert wurden. In Gegenwart von 10 mM GSH wurde eine bemerkenswert schnelle Freisetzung des Wirkstoffs festgestellt, wobei die kumulative Freisetzung von DOX innerhalb von 24 h etwa 72,8% betrug, aufgrund des Abbaus von disulfidgebundenen PMAA-Schalen in reduzierender Umgebung. Die Struktur des PDA-Kerns behält jedoch die Integrität nach der Redox-responsiven Degradation (zusätzliche Datei 1:Abbildung S2). Darüber hinaus wurde in Phosphatpuffern von pH 5,5 mit 10 mM GSH eine Burst-Freisetzung (ca. 87% innerhalb von 24 h) von DOX beobachtet, da die Carboxylgruppen in PMAA unter sauren Bedingungen protoniert wurden, was weiter zum Kollabieren des Polymers führte Netzwerke. Diese Freisetzungsprofile implizierten die vielversprechende Eigenschaft von PDA@PMAA-Nanopartikeln für die kontrollierte Wirkstofffreisetzung, da die Nanopartikel eine geringe Freisetzung von Wirkstoffen in das Plasma aufweisen, jedoch Wirkstoffe schnell freisetzen, wenn sie in die Tumorzellen eindringen. Darüber hinaus wurde eine langsame Freisetzung des Wirkstoffs (ca. 13% innerhalb von 24 h) für DOX-beladene PDA@PMAA-Nanopartikel mit NIR-Bestrahlung in Phosphatpuffern von pH 7,4 nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass die PDA@PMAA-Nanopartikel bei Bestrahlung ihre strukturelle Integrität beibehalten. Das Freisetzungsverhalten von PDA-Nanopartikeln in Gegenwart von 10 mM GSH zeigte eine bemerkenswert niedrige Wirkstofffreisetzung (ca. 30% in 24 h) im Vergleich zu PDA@PMAA-1-Nanopartikeln (Zusatzdatei 1:Abbildung S1). Der große Unterschied im Freisetzungsverhalten von PDA- und PDA@PMAA-Nanopartikeln deutet darauf hin, dass die Einführung einer abbaubaren Polymerhülle, die durch eine Disulfidbindung vernetzt ist, zur Redox-ausgelösten wirksamen Freisetzung von Wirkstoffen führte.

DOX-Freisetzungsprofile von PDA@PMAA-1-Nanopartikeln bei 37 ^° C in 7,4 Phosphatpuffer (○), in 7,4 Phosphatpuffer mit NIR-Laserbestrahlung (□, in 7,4 Phosphatpuffer mit 10 mM GSH (roter Kreis) oder in 5,5 Phosphatpuffer mit 10 mM GSH (grüner Kreis)

Zelltests

Die Untersuchung der zellulären Aufnahme und intrazellulären Wirkstofffreisetzung von DOX-beladenen PDA@PMAA-Nanopartikeln wurde weiter gegen die Zelllinie A549 durchgeführt. Wie in Abb. 7 gezeigt, kann eine rote Fluoreszenz für DOX im Zellzytoplasma nach 1 h Inkubation beobachtet werden, was auf eine schnelle Internalisierung von Nanopartikeln gegen Tumorzellen hinweist. Nach 4 h Inkubation wurde im gesamten Zytoplasma und im Zellkern eine starke rote Fluoreszenz beobachtet. Es deutete darauf hin, dass mehr Nanopartikel von Zellen endocytiert werden und DOX durch den Abbau von Polymerhüllen in der reduzierenden Umgebung von Tumorzellen effizient freigesetzt werden.

CLSM-Bilder von A549-Zellen, kultiviert mit DOX-beladenen PDA@PMAA-Nanopartikeln für (a ) 1 Stunde und (b ) 4 Std. In jeder Reihe wurden von links nach rechts differenzielle Interferenzkontrast-Mikroskopiebilder, Fluoreszenzbilder und Überlagerungsbilder gezeigt. (Maßstab, 50 μm)

Um die Biokompatibilität von PDA@PMAA zu bewerten, wurde eine typische normale Zelle (HEK-293T-Zellen) für den Zelllebensfähigkeitstest durch MTT-Assay ausgewählt. Wie in Abb. 8 gezeigt, wurde keine offensichtliche Zytotoxizität von leeren PDA@PMAA-1-Nanopartikeln in einem weiten Konzentrationsbereich von 0,1–100 μg mL ⁻¹ . nachgewiesen , was auf die gute Biokompatibilität von PDA@PMAA-1-Nanopartikeln hinweist, die ihre Anwendung im biomedizinischen Bereich sicherstellt. Als nächstes wurde die Zelllebensfähigkeit gegen A549-Zellen (Tumorzellen) als Funktion der Inkubationskonzentration von leeren oder DOX-beladenen PDA@PMAA-1-Nanopartikeln gemessen und jede Gruppe wurde in Gruppen mit oder ohne NIR-Laser-Exposition unterteilt (Abb. 9 .). ). Für die leere PDA@PMAA-1-Gruppe ohne Laser wurde fast keine Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen beobachtet, was darauf hindeutet, dass die leeren zusammengesetzten Nanopartikel keine Zytotoxizität aufweisen. Nach 5 W cm ⁻² NIR-Laserbestrahlung für 300 s, die Lebensfähigkeit der Zellen für die leere PDA@PMAA-1-Gruppe nahm offensichtlich ab und ~ 54,3% der Zellen wurden bei einer Konzentration von 100 μg mL ⁻¹ . abgetötet . Die Ergebnisse implizierten, dass diese PDA@PMAA-1-Nanopartikel zytotoxisch gegen A549-Zellen durch NIR-Bestrahlung waren, die Hyperthermie induzierte. Wie bei DOX-beladenen Gruppen zeigen DOX-beladene PDA@PMAA-1-Nanopartikel eine dosisabhängige Abnahme der Zelllebensfähigkeit, die eine ähnliche Wirksamkeit wie das freie DOX aufweisen, was auf eine vollständige Freisetzung von Wirkstoffen aus disulfidgebundenen vernetzten PMAA . hinweist Muscheln. Bei Zellen, die mit DOX-beladenen PDA@PMAA-1-Nanopartikeln mit NIR-Laserbelichtung behandelt wurden, zeigt die Zelllebensfähigkeit eine stärkere Abnahme im Vergleich zur Gruppe ohne Bestrahlung, insbesondere bei einer hohen Arzneimitteldosis. Zum Beispiel, wenn die Zellen mit 100 μg mL ⁻¹ . behandelt wurden DOX-beladenes PDA@PMAA-1 (mit 5 μg mL ⁻¹ DOX) wurde die Zelllebensfähigkeit auf etwa 15,7 % reduziert, was viel niedriger war als bei einer alleinigen photothermischen (~ 54,3 %) oder Chemotherapie (~ 38,1 %) Behandlung mit der gleichen Dosis an Nanopartikeln. Insbesondere die 50 %ige Zellhemmung (IC₅₀ ) Wert von DOX-beladenem PDA@PMAA-1 mit einer kurzzeitigen NIR-Laser-Exposition wurde zu 2 μg mL ⁻¹ . bestimmt , die viel niedriger war als die von freiem DOX (6,3 μg mL ⁻¹ ). Es deutet darauf hin, dass die chemo-photothermische Therapie von DOX-beladenen PDA@PMAA-Nanopartikeln einen synergistischen Effekt zeigte, der der erhöhten Zytotoxizität von DOX bei höheren Temperaturen zugeschrieben werden kann [34, 35]. Im Gegensatz dazu zeigt das freie DOX mit der NIR-Lasergruppe keinen ähnlichen synergistischen Effekt, da keine lokale Hyperthermie durch NIR-Laserbestrahlung auftritt. Fluoreszenzbilder von Calcein-AM (grün, lebende Zellen)-gefärbten Zellen nach der Behandlung zeigen, dass die Anzahl der lebenden Zellen, die mit DOX-beladenen PDA@PMAA-Nanopartikeln nach NIR-Laserbestrahlung behandelt wurden, signifikant geringer war als bei anderen Gruppen, was die synergistische Antitumorwirkung weiter bestätigte Wirkung von DOX-beladenen PDA@PMAA-Nanopartikeln mit NIR-Lichtbestrahlung (Abb. 10). Es profitiert von der positiven synergistischen Wirkung der chemo-photothermischen Kombinationsbehandlung und ermöglicht eine niedrigere Dosierung des zytotoxischen Arzneimittels, um die gleiche tumortötende Wirkung zu erzielen, wodurch die schweren Nebenwirkungen auf normales Gewebe bei hoher Arzneimitteldosis vermieden werden. Zusammengenommen deuten die obigen Daten darauf hin, dass diese PDA@PMAA-Nanopartikel unter intrazellulären Reduktionsbedingungen wirksam Medikamente freisetzen und eine synergistische tumorzelltötende Wirkung für die kombinierte chemo-photothermische Therapie zeigen können, was ihr großes Potenzial für die Krebsbehandlung demonstrierte.

Zelllebensfähigkeit von HEK-293-Zellen, die 24 Stunden lang leeren PDA@PMAA-1-Nanopartikeln ausgesetzt wurden

Zelllebensfähigkeit von A549-Zellen, die mit freiem DOX, PDA@PMAA-1-Nanopartikeln und DOX-beladenen PDA@PMAA-1-Nanopartikeln in verschiedenen Konzentrationen ohne oder mit NIR-Laserbestrahlung behandelt wurden (λ =808 nm, 5 W cm ⁻² ) für 300 s

Konfokale Fluoreszenzbilder von lebenden A549-Zellen, die mit PBS, PDA@PMAA-1-Nanopartikeln, DOX-beladenen PDA@PMAA-1-Nanopartikeln und freiem DOX mit oder ohne NIR-Laserbestrahlung behandelt wurden (λ =808 nm, 5 W cm ⁻² ) für 300 s. Lebende Zellen wurden mit Calcein-AM (grün) gefärbt. Der Maßstabsbalken beträgt 50 μm

Schlussfolgerung

Die multifunktionalen Kern-Schale-PDA@PMAA-Komposit-Nanopartikel wurden durch Auftragen einer Disulfid-vernetzten PMAA-Schicht auf PDA-Nanopartikel mittels Destillations-Fällungs-Polymerisation synthetisiert. Die Verbundnanopartikel zeigten einen ausgezeichneten photothermischen Umwandlungseffekt und einen redoxlabilen Abbau der PMAA-Schicht. Für eine typische Probe PDA@PDA@PMAA-1 wurde die Temperatur der PDA@PMAA-Dispersionen um 31 ^° . erhöht C bei einer Konzentration von 100 μg mL ⁻¹ bestrahlt mit einem 808-nm-Laser bei 5 W cm ^–2 für 300 s. The DOX-loaded PDA@PMAA-1 nanoparticles were stable under the physiological environment with low leakage of DOX (10.8% in 24 h), while a rapid and full release of DOX was triggered in the reducing and weakening acidic condition (pH5.5 + 10 mM GSH). The cell viability of A549 cells treated with PDA@PMAA-1 nanoparticles under NIR irradiation was reduced significantly to about 15.7% at relatively low equivalent drug concentration (5 μg mL ⁻¹ ), which was much lower than photothermal (~ 54.3%) or chemotherapy (~ 38.1%) treatment alone under the same dose of nanoparticles and drugs. So the DOX-loaded composite nanoparticles realized a synergistic inhibition effect against cancer cells by the combination of photothermal therapy and traditional chemotherapy. This work demonstrated the feasibility of such composite nanoparticles to be a powerful platform for controlled drug delivery and could be exploited as combined chemo-photothermal therapy with improved therapeutic efficacy.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

The datasets generated during and/or analyzed during the current study are available from the corresponding author on request.

Abkürzungen

AIBN:

2,2-Azobisisobutyronitrile

BAC:

N,N' -bis(acryloyl)cystamine

DA-HCl:

Dopamine hydrochloride

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

DMEM:

Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium

DMSO:

Dimethylsulfoxid

DOX:

Doxorubicin

FBS:

Fötales Rinderserum

FT-IR:

Fourier-Transformations-Infrarot

GSH:

Glutathione

MAA:

Methacrylic acid

NIR:

Near-infrared

PDA:

Polydopamin

PMAA:

Poly(methacrylic acid)

PTC:

Photothermal conversion agents

PTT:

Photothermische Therapie

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie