Synthese, Charakterisierung und Bewertung von mit Phycocyanin beschichteten redoxempfindlichen Chitosan-Oligosaccharid-Nanopartikeln zur Wirkstoffabgabe

Hintergrund

Chitosan-Oligosaccharid (COS) mit der Struktur von β-(1-4)-verknüpftem D- Glucosamine ist ein Depolymerisationsprodukt, das hauptsächlich durch Deacetylierung und enzymatische Hydrolyse von Chitosan oder Chitin hergestellt wird und aus Arthropoden-Exoskeletten oder den Zellwänden von Pilzen gewonnen wird [1, 2]. Es ist erwähnenswert, dass Schwermetalle und Farbstoffe durch Chitosan und seine modifizierte Form von Materialien, in denen Chitosan als Adsorptionsmittel wirkt, entfernt werden können [3]. Eine Reihe von Studien hat gezeigt, dass COS mehrere biologische Eigenschaften besitzt, wie z. B. krebshemmend, entzündungshemmend, antioxidativ und immunstimulierend [4]. COS gilt aufgrund seiner Biokompatibilität, hohen Wasserlöslichkeit und chemischen Modifizierbarkeit als ungiftiges Trägermaterial für die Wirkstoffabgabe [5, 6].

Um die Löslichkeit hydrophober Krebsmedikamente zu verbessern und die Toxizität für normales Gewebe zu reduzieren, haben medizinische Forscher Copolymere untersucht, die sich selbst zu Micellen eines bestimmten Partikelgrößenbereichs anordnen können [7, 8]. Diese Copolymer-Anordnungen können die Tumorstelle passiv oder aktiv erreichen und durchdringen. Mizellen bestehen aus zwei einzelnen funktionellen Abschnitten:dem Kern, in dem die hydrophoben Wirkstoffe eingekapselt sind, und der äußeren Hülle oder Korona, die die pharmakokinetischen Eigenschaften in vivo steuert [8]. Wanget al. [9] pfropfte Desoxycholsäure auf COS-Ketten durch eine chemische Modifikation, um amphiphile Blockcopolymere zu bilden, die sich in kostengünstigen anorganischen Lösungsmitteln zu Micellen anordnen konnten. Der hydrophobe Kern der Micellen enthielt Quercetin, das die Wasserlöslichkeit von Krebsmedikamenten und damit die Bioverfügbarkeit von Quercetin stark verbesserte.

Curcumin (CUR) ist einer der chemischen Hauptbestandteile von Kurkuma [10]. In den letzten Jahren haben viele Forscher die krebshemmenden Eigenschaften von CUR untersucht und viele Studien haben bestätigt, dass diese Chemikalie das Wachstum von Tumorzellen über verschiedene Signalwege beeinflussen und das Immunsystem stärken kann [11]. Darüber hinaus ist CUR ein Photosensibilisator mit guten photodynamischen Eigenschaften [12]. Somit ist CUR ein vielversprechendes Medikament für die Krebstherapie. Seine schlechte Löslichkeit, Stabilität und Bioverfügbarkeit schränken jedoch seine klinische Anwendung ein [13]. Um diese Nachteile zu mildern, haben viele Forscher die Bioverfügbarkeit von CUR durch Wirkstoffabgabesysteme verbessert. Chen et al. [14] entwarfen einen neuen Typ eines doppelten pH-empfindlichen Wirkstoffträgers, der die Wasserlöslichkeit von CUR und seine Wirkung auf die Tumorbehandlung verbessert.

Phycocyanin (PC), das hauptsächlich aus Cyanobakterien gewonnen wird, ist als wasserlösliches und lichtsammelndes Pigmentprotein bekannt, das bei der Photosynthese eine Rolle beim Einfangen und Umwandeln von Licht in chemische Energie spielt [15]. PC übt mehrere biologische Eigenschaften aus, wie z. B. krebshemmend [16], entzündungshemmend und antioxidativ, die in den Bereichen Lebensmittel und Medizin viel Aufmerksamkeit auf sich gezogen haben [15, 17]. Haoet al. [16] entdeckten, dass PC das Wachstum von nicht-kleinzelligen Lungenkrebszellen hemmte, indem es das Toll/Interleukin-1-Rezeptordomänen-enthaltende Adapterprotein (TIRAP) herunterregulierte. Darüber hinaus wird PC auch in der photodynamischen Therapie (PDT) von Tumoren verwendet, da es ein hervorragendes Mittel ohne Nebenwirkungen ist [18, 19, 20]. Die Verwendung von PC als Fluoreszenzsonden muss mit spezifischen Identifizierungselementen wie Biotin, Antikörpern und Streptavidin konjugiert werden [21, 22]. Biotin, ein wasserlösliches Vitamin, ist ein essentieller Mikronährstoff im menschlichen Körper, der tumorgerichtete Eigenschaften besitzt [23]. Die biotinspezifischen Rezeptorproteine ​​wie Avidin, Neutravidin und Streptavidin werden auf der Oberfläche einiger Krebszellen im Vergleich zu normalen Zellen stark überexprimiert [24, 25]. Daher wurden biotinylierte Nanopartikel umfassend als Wirkstoffabgabe über rezeptorvermittelte Endozytose untersucht [24].

In der vorliegenden Studie wurde ein neuartiger PC-funktionalisierter Nanoträger konstruiert, und die Herstellung von CUR-BCSC@PCs ist in Abb. 1 dargestellt. Die Disulfidbrücke zwischen COS und CUR trug zur reduktiven Empfindlichkeit des amphiphilen Trägermaterials bei [26 ]. CUR befand sich im hydrophoben inneren Kern, geschützt durch die COS/PC-Hülle. Die Wechselwirkung zwischen Biotin und PC und die elektrostatische Wechselwirkung, die zwischen positiv geladenem COS und negativ geladenem PC bestand, wurden verwendet, um PC auf der Oberfläche von CUR-BCSCs zu modifizieren. Es wurde erwartet, dass CUR-BCSC@PCs Tumorgewebe aufgrund der verbesserten Permeabilität, der verbesserten Permeabilitäts- und Retentionswirkung (EPR) und der Biotinrezeptor-Targeting-Wirkung erreichen [27]. In der Tumormikroumgebung, die eine höhere Glutathionkonzentration als normale Zellen aufweist, zerfielen CUR-BCSC@PCs durch Thiol‐Disulfid‐Austauschreaktionen und erreichten eine hohe Wirkstoffkonzentration in den Tumorzellen [23, 28, 29]. Das in diesem Artikel beschriebene CUR-BCSC@PC-Nanoabgabesystem verbesserte nicht nur die Bioverfügbarkeit von CUR, sondern hat auch das Potenzial, bei der klinischen Behandlung von Tumoren wirksam zu sein.

Aufbau und schematische Darstellung von CUR-BCSC@PCs

Materialien und Methoden

Materialien

CUR wurde von Zhanyun Chemical Co., Ltd. (Shanghai, China) bezogen. COS wurde von Shandong Weikang Biomedical Science and Technology Co., Ltd. bezogen. PC wurde von Zhejiang Binmei Biotechnology Co., Ltd. bezogen. 3.3-Dithiodipropionsäure wurde von Adamas Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China) bezogen. Karbonisiertes Carbodiimidhydrochlorid (EDCI), Dimethylaminopyridin (DMAP), Tetrahydrofuran (THF), Oxalylchlorid und Biotin wurden von Aladdin Chemistry Co., Ltd. bezogen. L-Glutathione (GSH) und Hoechst 33342 wurden von Sigma-Aldrich (Shanghai) erworben , China). Dialysebeutel (MWCO 300 Da) wurden von Beijing Biotopped Technology Co., Ltd. bezogen. Formamid wurde von Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. hergestellt. Entionisiertes Wasser wurde im Labor selbst hergestellt.

Zur Bewertung der Zytotoxizität des neuartigen Nanocarriers wurde eine A549-Zelllinie (humane Lungenkarzinomzellen) (Bena Culture Collection (Beijing, China)) ausgewählt. A549-Zellen wurden in DMEM (Saiersi Biotechnology Co., Ltd. (Shangdong, Yantai, China)) gezüchtet. Fötales Rinderserum (FBS) wurde von Hyclone (Logan, UT, USA) bezogen. Penicillin und Streptomycin wurden von Sigma-Aldrich (Shanghai, China) bezogen. 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromid (MTT) wurde ebenfalls von Sigma-Aldrich (Shanghai, China) bezogen.

Synthese von CUR-BCSC@PCs

Die Syntheserouten zur Herstellung von CUR-BCSC@PCs sind in Abb. 2 dargestellt. Die detaillierten experimentellen Verfahren sind unten beschrieben.

Syntheseroute von COS-S-S-CUR, BCSC und Biotin-COS

Synthese von COS-S-S-CUR

3.3-Dithiodipropionsäure-funktionalisiertes COS wurde durch Säurechlorid-katalysierte Veresterung in einer zweistufigen Reaktion synthetisiert.

Schritt 1:3,3-Dithiodipropionsäure (42,05 mg, 0,25 mmol) und trockenes THF (4 ml) wurden in einen braunen Rundkolben mit Rührer gegeben, um die Säure aufzulösen. Dann wurde mit THF verdünntes Oxalylchlorid (0,3 mMol) in einen Kolben gegeben und in ein Eisbad gestellt. Die Reaktion wurde bei 35ºC gehalten. Nach 3-stündigem Rühren wurde das nicht umgesetzte Oxalylchlorid durch Rotationsverdampfung entfernt. Produkt 1 wurde durch die obigen Schritte hergestellt. CUR wurde in 3 µl THF gelöst, das 34 µl Triethylamin enthielt, das tropfenweise in den Kolben mit Produkt 1 unter Eisbadbedingungen gegeben und dann 15 Minuten gerührt wurde. Anschließend wurde die Mischung bei 50 °C unter einer Stickstoffatmosphäre 6 h lang gerührt. Das erhaltene Produkt wurde einer Rotationsdestillation unterzogen, um Triethylamin und THF zu entfernen, und wurde dann durch Säulenchromatographie gereinigt, um das reine Produkt HOOC-S-S-CUR zu erhalten

Schritt 2:Das reine Produkt HOOC-S-S-CUR wurde mit EDCI (1,2 eq) und DMAP (1,2 eq) in Formamid für 2 h aktiviert. Anschließend wurde in 4 ml Formamid gelöstes COS zugegeben und 12 h bei 55 °C gerührt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen war, wurde die Lösung mit einem Dialysebeutel (MWCO 300 Da) dialysiert und für 12 h gefriergetrocknet.

Synthese von BCSC und Biotin-COS

Kurz gesagt, Biotin, EDCI und DMAP wurden in 3 ml Formamid gelöst und in einen braunen Rundkolben überführt. Nach 2 h Rühren bei 30 °C wurde COS-S-S-CUR in 3 ml Formamid gelöst und tropfenweise in den Kolben gegeben. Die Reaktion wurde 2 Tage bei 45 °C gehalten. Die Endprodukte wurden in entionisiertem Wasser dialysiert (MWCO 300 Da) und zentrifugiert und lyophilisiert, um redoxsensitive BCSC zu erhalten. Darüber hinaus wurde die Synthese von Biotin-COS nach dem gleichen Verfahren durchgeführt, um Biotin an die COS-Ketten zu binden.

¹ H-NMR von COS-S-S-CUR, BCSC und Biotin-COS wurden mit einer Mischung aus DMSO-D₆ . gemessen und D₂ O als Lösungsmittel.

Vorbereitung von CUR-beladenen BCSC-Mizellen (CUR-BCSCs)

CUR-BCSCs wurden durch die Selbstorganisationsmethode hergestellt. Zehn Milligramm BCSC wurden in 4 µl Formamid gelöst und dann mit 1 µl CUR-Lösung (1 µg/ml) gemischt, die in Formamid gelöst war. Die gemischte Lösung wurde unter Verwendung eines Dialysebeutels (MWCO 300 Da) in entionisiertem Wasser 24 h lang dialysiert und das entionisierte Wasser wurde alle 2 h gewechselt. CUR-BCSCs wurden mit Millipore-Membranen von 800 nm, 450 nm und 220 nm gefiltert.

Vorbereitung von CUR-BCSC@PCs

Die präparierten CUR-BCSCs wurden mit einer wässrigen PC-Lösung (1,0 mg/ml) gemischt und 30 min bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurde PC mit einem 100 kDa Zentrifugalfilter entfernt und dreimal mit Wasser gespült. Das Endprodukt (CUR-BCSC@PC) wurde für weitere Untersuchungen bei 4°C im Dunkeln gelagert.

Charakterisierungen

Messungen der dynamischen Laserstreuung (DLS) wurden auf einem Partikelanalysator Delsa Nano C (Beckman Coulter Inc.) durchgeführt, um die Partikelgröße, das Zetapotential und den Polydispersitätsindex (PI) zu beobachten. Die Morphologie von CUR-BCSCs und CUR-BCSC@PCs wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, H-600; Hitachi, Tokio, Japan) bestätigt.

Verkapselungseffizienz (EE) und Wirkstoffladekapazität (DL)

HPLC (Agilent 1260GB12C) wurde verwendet, um EE und DL von Nanopartikeln zu bestimmen. Zuerst wurden 2 µl CUR-BCSCs oder CUR-BCSC@PCs mit 3 µl Acetonitril vermischt und durch Ultraschall demulgiert, in dem dann Acetonitril auf 10 µl zugegeben wurde. Vor der Messung die Säulentemperatur der Phenomenex C18-Säule (250 mm × 4. 6 mm, 5 um) wurde auf 25 °C eingestellt, während die Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase auf 1,0 mL·min ^− 1 . eingestellt wurde . Das Verhältnis von 0,5% Eisessig zu Acetonitril betrug 40:60 (v/v). Bei der Detektion wurden bei einer Detektionswellenlänge von 425 nm 20 µl Proben injiziert [30]. Die folgende Formel wurde verwendet, um EE und DL zu berechnen:

In-vitro-Stabilitätstest

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), die GSH (0, 20 μM, 10 mM) enthielt, wurde hergestellt und mit CUR-BCSC@PCs für 4 Stunden behandelt, um die Veränderungen der Partikelgröße unter verschiedenen Konzentrationen von Glutathion bei 37 °C zu beobachten. Darüber hinaus wurde der hydrodynamische Durchmesser von CUR-BCSC@PCs in PBS-Lösung mit einem Particle Analyzer Delsa Nano C (Beckman Coulter Inc.) bei 37 °C zu verschiedenen Zeitpunkten (4, 8, 12 und 24 h) untersucht.

In-vitro-CUR-Freisetzung aus CUR-BCSC@PCs

Das in vitro-CUR-Freisetzungsverhalten von CUR-BCSC@PCs wurde mit der Dialysemethode untersucht. Glutathionhaltige PBS-Lösungen (GSH:20 µmol/l, 1 µmol/l, 5 µmol/l, 10 µmol/l) wurden hergestellt und 0,5 % Tween 80 wurde zugegeben. PBS-Puffer (45 ml), der verschiedene Konzentrationen von GSH enthielt, wurde zu 50 ml Zentrifugenröhrchen gegeben; dann wurde ein Dialysebeutel mit 1 µl CUR-BCSC@PCs in jedes Zentrifugenröhrchen gegeben, das bei 37 °C geschüttelt wurde. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten (0,2, 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72 &mgr;h) wurden 2 &mgr;l Freisetzungsmedium gesammelt und frisches Freisetzungsmedium des gleichen Typs wurde zugegeben, um sein Volumen unverändert zu halten. HPLC wurde verwendet, um die Konzentration von CUR im gesammelten Freisetzungsmedium zu bestimmen.

Zellkultur

Die menschlichen Lungenkarzinom-A549-Zellen wurden in DMEM, das 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin enthielt, kultiviert und bei 37 °C in 5 % CO₂ . inkubiert Atmosphäre [31, 32].

In-vitro-Hemmung der Zellproliferation

Die In-vitro-Zytotoxizität von CUR, BCSC-Mizellen (BCSCs), CUR-BCSCs und CUR-BCSC@PCs gegen die Zelllinie A549 wurde mit einem Standard-MTT-Assay bewertet [33]. Die A549-Zellen wurden 24 h lang in Platten mit 96 Vertiefungen (5000 Zellen pro Vertiefung) ausgesät, um an der Wand zu haften. Das Originalmedium wurde verworfen und dann 100 µl frisches Medium mit freiem CUR, BCSCs, CUR-BCSCs und CUR-BCSC@PCs (0,1, 1, 5, 10, 15 und 20 µg/ml basierend auf CUR) zugegeben und 24 h kultiviert. Wells ohne Verabreichung wurden als Blindkontrollen verwendet. Die Zellen wurden einem MTT-Assay unterzogen, indem das Medium entfernt und 20 µl MTT-Lösung (5 µl/ml) zugegeben wurden. Nach weiteren 4 h Inkubation bei 37 °C in 5% CO₂ Atmosphäre wurde die MTT-Lösung durch 150 µl DMSO ersetzt, um das violette MTT-Formazan aufzulösen. Anschließend wurde ein Mikroplatten-Lesegerät (Thermo Fisher Scientific Co., Waltham, MA) verwendet, um die Absorption jeder Vertiefung bei 570 nm zu messen

In-vitro-Zellaufnahme und -lokalisierung

Die zelluläre Aufnahmefähigkeit von CUR-BCSCs und CUR-BCSC@PCs wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop (FM, Eclipse E400; Nikon Corporation, Tokio, Japan) untersucht. A549-Zellen wurden in 24-Well-Platten bei 4 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen pro Well und wurden mit CUR-BCSCs und CUR-BCSC@PCs (CUR-Konzentration:20 µg/ml) bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ . co-inkubiert für 1, 2 und 4 h. Die A549-Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen, nachdem die Wirkstoffe enthaltenden Kulturmedien entfernt worden waren. Dann wurde PBS, das 4% Paraformaldehyd enthielt, für 20 Minuten zugegeben und weitere dreimal mit PBS gewaschen. Die Zellkerne wurden mit Hoechst 33342 für 15 min gefärbt und unter Verwendung eines inversen Fluoreszenzmikroskops beobachtet.

Statistische Analyse

Alle Experimente wurden mindestens dreimal durchgeführt und als Mittelwerte ± SD ausgedrückt. Statistische Tests wurden mit dem t . des Schülers analysiert Prüfung. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant festgelegt und P < 0,01 wurde als hochsignifikant angesehen.

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung von COS, COS-S-S-CUR, Biotin-COS und BCSC

Die wichtigsten charakteristischen Resonanzen von CUR und CH₂ -S-S-CH₂ erschien auf der ¹ H-NMR-Spektrum von COS-S-S-CUR, das die erfolgreiche Konjugation von CUR an die COS-Ketten beweist. Verglichen mit den COS-Peaks in Abb. 3(A) wurden die in Abb. 3(B) dargestellten charakteristischen Signale von CUR im Bereich zwischen 6,7 und 7,5 ppm und bei 3,75 ppm (−OCH_{3 ), während die Resonanz von CH2 -S-S-CH2 bei 2,5 ppm war unverändert. Wie in (Abb. 3(C), a, b) gezeigt, sind die Biotin-Peaks auf der ¹ Das H-NMR-Spektrum von Biotin-COS betrug 0,99 ppm (−CH2 –) und 3,39 ppm (−CH–S–). ¹ Das H-NMR-Spektrum von BCSC ist in Abb. 3(D) gezeigt. Die Resonanzen von CUR (Abb. 3(D), a, e) wurden an den entsprechenden Positionen und der charakteristische Peak von CH2 . gesehen -S-S-CH2 (Abb. 3(D), b) wurde erneut bei 2,5 ppm beobachtet. Darüber hinaus bestätigte das Auftreten von Signalen bei den Spitzen von 0,09 ppm und 3,39 ppm (Abb. 3(D), c, d) die Existenz von Biotin, das an die COS-S-S-CUR-Ketten gebunden ist. Die charakteristischen Resonanzen von CUR, CH2 -S-S-CH2 und Biotin, wie in Fig. 3(D) gezeigt, stimmen mit denen in Fig. 3(B) und Fig. 3(C) überein, was darauf hinweist, dass das amphiphile Material BCSC erfolgreich synthetisiert wurde.}

Die ¹ H-NMR-Spektren von COS (A ), COS-S-S-CUR (B ), Biotin-COS (C ) und BCSC (D )

Charakterisierung von CUR-BCSCs und CUR-BCSC@PCs

Die Morphologien von CUR-BCSCs und CUR-BCSC@PCs wurden durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht (Abb. 4(A, B)). CUR-BCSCs zeigten im Elektronenmikroskop eine glatte Kugelform (Abb. 4(A), a), während CUR-BCSC@PCs eine annähernd kugelförmige Form aufwiesen, wobei die Blooming-Schicht die CUR-BCSC@PCs umgab (Abb. 4(B .). ), B). Dies deutete darauf hin, dass PC eine Proteinkoronastruktur bildete, indem es die Oberflächen von CUR-BCSCs bedeckte. Ein deutlicher Tyndall-Effekt von CUR-BCSC@PCs wurde aufgrund des Vorhandenseins großzügiger Nanopartikel beobachtet (Abb. 4(C)). Die Partikelgröße, PI, das Zetapotential, DL (%) und EE (%) von CUR-BCSCs und CUR-BCSC@PCs sind in Tabelle 1 dargestellt. In Abb. 5 ist die durchschnittliche Größe von CUR-BCSCs und CUR- BCSC@PCs betrug 97,8 ± 4,2 nm bzw. 160,3 ± 9,0 nm. In der Zwischenzeit betrugen die PI-Werte von CUR-BCSCs und CUR-BCSC@PCs 0,181 ± 0,014 bzw. 0,114 ± ± 0,024, was kleiner als 0,2 ist, was auf die Einheitlichkeit ihrer Größen hinweist. Die Zetapotentiale von CUR-BCSCs und CUR-BCSC@PCs betrugen 21,57 ± 0,53 bzw. 12,90 ± 1,93 mV. Aufgrund der elektronegativen PC-Beschichtung war das Zetapotential von CUR-BCSCs höher als das von CUR-BCSC@PCs. Der EE von CUR-BCSC@PCs war höher als der von CUR-BCSCs.

A Die TEM-Bilder von CUR-BCSCs und einem einzelnen CUR-BCSC. B Die TEM-Bilder von CUR-BCSC@PCs und einem einzelnen CUR-BCSC@PC. C Tyndall-Effekt und das Foto von CUR-BCSC@PCs in Wasser

a Die Größenverteilung und das Zetapotential von CUR-BCSCs; b Die Größenverteilung und das Zetapotential von CUR-BCSC@PCs

Stabilität von CUR-BCSC@PCs

Wie in Abb. 6a gezeigt, wurde die Bindung aufgrund der reduzierenden Natur der Disulfidbindung in PBS mit 10 mM GSH gespalten, und CUR-BCSC@PCs wurden in Polymerfragmente zerlegt, die agglomerierten, um die Partikelgröße der Nanopartikel zu erhöhen . Bei PBS mit 20 µM GSH waren die Änderungen der Partikelgröße jedoch gering, was ein ähnliches Ergebnis wie bei PBS ohne GSH zeigte. Wie in Abb. 6b dargestellt, wurde die Partikelgröße zu verschiedenen Zeiten gemessen, um die Stabilität von CUR-BCSC@PCs in PBS zu untersuchen, und die Ergebnisse zeigten, dass die Partikelgröße von CUR-BCSC@PCs im Laufe der Zeit langsam zunahm [14].

Die Stabilität von CUR-BCSC@PCs. a Größenänderungen von CUR-BCSC@PCs bei unterschiedlichen GSH-Konzentrationen. b Größenänderungen von CUR-BCSC@PCs in PBS zu unterschiedlichen Zeiten

Reduktionsreaktion von CUR-BCSC@PCs

Es ist allgemein bekannt, dass Disulfidbindungen in einer tumorreduzierenden Umgebung instabil sind. Forscher haben Disulfidbrücken verwendet, um hydrophile Polymere und hydrophobe Wirkstoffe zu verbinden, um amphiphile Fragmente herzustellen, die sich in Wasser selbst anordnen können, um Nanomizellen zu bilden. Je nach physiologischer Umgebung und Tumorumgebung brechen dann Disulfidbrücken an der Tumorstelle auf, um Medikamente freizusetzen [34]. In der vorliegenden Studie wurde eine In-vitro-Wirkstofffreisetzung durchgeführt, um zu überprüfen, ob CUR-BCSC@PCs eine erwartete Freisetzungseigenschaft aufweisen könnten. Die Reduktionsreaktionsfähigkeit von CUR-BCSC@PCs mit Disulfidbindungen wurde nach der Aktivierung von GSH untersucht. Wie in Abb. 7 gezeigt, war die Freisetzung von CUR aus CUR-BCSC@PCs im Medium mit 20 µM GSH bei pH 7,4, das die extrazelluläre Umgebung simulierte, im Vergleich zu einer Umgebung mit 10 µM GSH bei pH 7,4 extrem langsam. Darüber hinaus zeigten 1, 5 und 10 µM GSH im Vergleich zum 20 µM GSH-Medium signifikante Unterschiede im Freisetzungsverhalten. Mit der Erhöhung der GSH-Konzentration wurde auch die Freisetzung von CUR aus CUR-BCSC@PCs gefördert, was darauf hindeutet, dass die Wirkstofffreisetzung als Reaktion auf die GSH-Konzentration erfolgte.

Kumulative Freisetzung von CUR aus CUR-BCSC@PCs bei unterschiedlichen GSH-Bedingungen

In-vitro-Zytotoxizität

Der MTT-Assay wurde durchgeführt, um die zytotoxischen Wirkungen von freiem CUR, BCSCs, CUR-BCSCs und CUR-BCSC@PCs auf A549-Zelllinien zu untersuchen [35]. Die Daten zur Lebensfähigkeit der Zellen sind in 8 zusammengefasst. Alle CUR-Präparate zeigten eine Dosisabhängigkeit hinsichtlich der Hemmung der Zellproliferation. Wie in 8 gezeigt, hatte freies CUR im Vergleich zu CUR-BCSC@PCs und CUR-BCSCs nach 24 h Inkubation eine etwas geringere Fähigkeit, die Zellproliferation gegen alle A549-Zellen zu hemmen. Für A549-Zellen war die Anti-Krebs-Aktivität von CUR-BCSC@PCs besser als die von BCSCs und CUR-BCSCs, was wahrscheinlich auf eine ausgezeichnete Zellaufnahme zurückzuführen war. Darüber hinaus zeigten CUR-BCSC@PCs eine höhere Zytotoxizität als CUR-BCSCs, was darauf hindeutet, dass PC eine potenziell hemmende Wirkung auf die Proliferation von A549-Zellen hat.

In-vitro-Zytotoxizität verschiedener Formulierungen bei 24 h in A549-Zellen

In-vitro-Zellaufnahmestudie

Wie in Abb. 8 gezeigt, wurden die Fluoreszenzsignale von CUR in A549-Zellen beobachtet, die mit CUR-BCSCs und CUR-BCSC@PCs (CUR:20 µg/ml) bei 1, 2 und 4 Stunden unter Verwendung des invertierten Fluoreszenzmikroskops behandelt wurden . CUR war als grüne Fluoreszenzsonde auch ein Krebsmedikament, das häufig als hydrophobes Modellarzneimittel zur Entwicklung neuer und effizienter Wirkstoffabgabesysteme verwendet wurde. Wie in 9a dargestellt, wurden sowohl CUR-BCSCs als auch CUR-BCSC@PCs in A549-Zelllinien absorbiert, und die Aufnahmeeffizienz war zeitabhängig. Aufgrund der überexprimierten Biotinrezeptoren auf der Oberfläche von Krebszellen hatten mit Biotin beladene Nanomizellen eine Affinität zu A549-Zellen. Die Fluoreszenzsignale von CUR-BCSC@PCs waren nach 4 h hoch, was auf eine hohe Zellaufnahmerate von CUR-BCSC@PCs hinweist. Die Fluoreszenzsignale von CUR-BCSC@PCs waren nach 4 h höher als nach 1 h oder 2 h; dies bewies, dass die Zellaufnahme zeitabhängig war.

a Fluoreszierende Bildgebung der zellulären Aufnahme von CUR-BCSCs und CUR-BCSC@PCs zu verschiedenen Zeiten. b Die Zellenposition von CUR-BCSC@PCs um 1 h und 4 h

Die Kerne von A549-Zellen wurden mit Hoechst 33342 gefärbt. Wie in Fig. 9b gezeigt, wurden grüne Fluoreszenzsignale im Zytoplasma der 1 h-Gruppe von CUR-BCSC@PCs gesehen, und die Fluoreszenz trat allmählich in den Kernen der 4 h . auf Gruppe von CUR-BCSC@PCs, die eine zelluläre Aufnahme durch Caveolae-vermittelte Endozytose demonstrierten.

Schlussfolgerungen

In dieser Studie wurde eine Art von proteinfunktionalisierten COS-Nanopartikeln durch Kondensationsreaktionen, Selbstorganisationsverhalten und die Wechselwirkung zwischen PC und CUR-BCSCs hergestellt. Nach der Voruntersuchung wurden die amphiphilen Trägermaterialien (BCSCs) mit Redoxsensitivität erfolgreich synthetisiert und mit ¹ . verifiziert H-NMR. Die Oberflächen von CUR-BCSCs wurden mit einer Schicht aus Phycocyanin-Corona modifiziert, die die Zellaufnahmeeffizienz verbessern und CUR-BCSC@PCs vor Plasmaproteinadsorption schützen könnte. Die zelluläre Zytotoxizitäts- und Aufnahmeanalyse zeigte, dass CUR-BCSC@PCs CUR in die A549-Zellen transportieren können und eine ausgezeichnete antiproliferative Eigenschaft aufweisen. In Anbetracht der PDT-Wirkung von PC und CUR werden wir in der nächsten Phase dieser Forschung die photodynamischen Eigenschaften und die Anti-Krebs-Aktivität von CUR-BCSC@PCs unter Phototherapie bewerten. Diese Studie ebnete den Weg für die Verbesserung der Wirksamkeit von Krebsmedikamenten und die Einführung einer funktionellen Proteinkorona. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das nanomedizinische Trägerbiomaterial von CUR-BCSC@PCs basierend auf COS mit mehreren Funktionen eine neue Strategie für die Tumorbehandlung darstellt und große Anwendungsperspektiven aufwies.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die Schlussfolgerungen in diesem Manuskript basieren auf den Daten, die alle in diesem Papier präsentiert und gezeigt werden.

Abkürzungen

BCSC:

Biotin-Chitosan-Oligosaccharid-Dithiodipropionsäure-Curcumin

COS:

Chitosan-Oligosaccharid

COS-S-S-CUR:

Chitosan-Oligosaccharid-Dithiodipropionsäure-Curcumin

CUR:

Kurkumin

CUR-BCSC@PCs:

Phycocyanin-funktionalisierte und Curcumin-beladene Biotin-Chitosan-Oligosaccharid-Dithiodipropionsäure-Curcumin-Mizellen

CUR-BCSCs:

Curcumin-beladene Biotin-Chitosan-Oligosaccharid-Dithiodipropionsäure-Curcumin-Mizellen

EPR:

Verbesserte Durchlässigkeit und Retention

PC:

Phycocyanin

PDT:

Photodynamische Therapie