Einfacher Ansatz zur Herstellung von rGO@Fe3O4-Mikrosphären für die magnetisch gezielte und NIR-responsive chemo-photothermale Kombinationstherapie

Einführung

Krebs ist eine der bösartigsten Erkrankungen der Welt und eine der häufigsten Todesursachen beim Menschen [1, 2]. Obwohl die Chemotherapie häufig in der klinischen Krebsbehandlung eingesetzt wird, schränken mehrere Schlüsselprobleme, darunter eine geringe therapeutische Effizienz und umfangreiche Nebenwirkungen, ihre Anwendung stark ein [3]. Drug-Delivery-Systeme (DDS) haben große Vorteile bei der Verbesserung der Wirkstofflöslichkeit, Bioverfügbarkeit und Tumorakkumulation gezeigt, von denen erwartet wird, dass sie ihre Antitumoreffizienz deutlich verbessern [4]. In letzter Zeit haben hohle Mikrokügelchen, die als Wirkstoffabgabesysteme eingesetzt werden, aufgrund ihrer großen Oberfläche und reichlich porösen Strukturen zunehmende Aufmerksamkeit erlangt [5,6,7,8] und mehrere hohle Mikrokügelchen-Materialien wurden mit innovativen Technologien entwickelt [9,10,11 ,12,13].

Graphenoxid (GO), eine neue Art von anorganischem freimetallischem Material, wurde aufgrund seiner einzigartigen Eigenschaften, wie guter Biokompatibilität, geringer Kosten und einfacher Herstellung, in der Wirkstoffabgabe umfassend untersucht [14,15,16,17]. Bemerkenswert ist, dass Graphenoxid Licht effektiv in Wärme umwandeln kann, wenn es durch NIR-Bestrahlung ausgelöst wird [18, 19, 20], was zu einer vielversprechenden Strategie zur Verbesserung der photothermischen Therapiewirkung von Krebs wird. Die Chen-Gruppe hat berichtet, dass GO die Krebsmedikamente durch nicht-kovalente Interaktionen wie -π-Stapelung, Wasserstoffbrückenbindung und elektrostatische Adsorption freisetzen könnte [21]. Die 2D-Graphenoxid-Nanoschicht neigt jedoch aufgrund der großen spezifischen Oberfläche sowie der Van-der-Waals-Bindungen zwischen den Graphenschichten zur Agglomeration [17, 22], was zu einer schlechten Löslichkeit in Wasser und einer verringerten Wirkstoffbeladungsfähigkeit führt. Es wurden einige Strategien untersucht, um diese Mängel zu überwinden. Die Tsukruk-Gruppe hat mit Hilfe der Schicht-für-Schicht-Montagetechnologie eine Graphen-Hohlkapsel entwickelt [23], die im Vergleich zu anderen GO-Materialien eine extrem hohe Wirkstoffbeladung zeigte. Dies könnte auf die hohe spezifische Oberfläche und das große Porenvolumen der durch GO stabilisierten Hohlkapsel zurückzuführen sein. Allerdings haben sich nur wenige Berichte auf die Untersuchung von GO mit einer dreidimensional verbundenen Porenstruktur zur Wirkstoffabgabe bezogen.

Obwohl viele berichtete Wirkstoffabgabesysteme eine überlegene Wirkstoffbeladungsfähigkeit und ein kontrolliertes Wirkstofffreisetzungsverhalten gezeigt haben, sind ihre präklinische Forschung und Anwendungen auch aufgrund einer unzureichenden Spezifität für das Zieltumorgewebe begrenzt [24]. Unter den verschiedenen Wirkstoff-Target-Delivery-Systemen ist Fe₃ O₄ , ein magnetisches Targetmaterial wird in der Krebstherapie wegen seiner hohen magnetischen Reaktionen, stabilen Qualität und einfachen Erreichbarkeit häufig verwendet [25,26,27,28,29]. Die Ni-Gruppe hat ein Fe₃ . entwickelt O₄ @SiO₂ Kern-Schale-Struktur-Nanopartikel mit superparamagnetischer Eigenschaft zum magnetischen Targeting von Tumoren [30]. Darüber hinaus ist Fe₃ O₄ verankerte GO-Nanopartikel wurden in Kombination mit magnetischer Targetabgabe und photothermischer Therapie gut untersucht [31,32,33,34].

In der vorliegenden Studie berichten wir über eine fortschrittliche Strategie zur Entwicklung einer DDS-Plattform, die mit Eisenoxid dekorierte rGO-Mikrohohlkugeln (rGO@Fe₃ O₄ ) für die magnetisch zielgerichtete und NIR-getriggerte photothermische Therapie (PTT). Wie in Schema 1 dargestellt, rGO@Fe₃ O₄ Mikrohohlkugeln wurden durch drei Schritte hergestellt. Erstens rGO-SiO₂ wird durch Sprühtrocknungsverfahren unter Verwendung von SiO₂ . synthetisiert als Templat und dann wurden rGO-Mikrohohlkugeln durch Entfernen von SiO₂ . erhalten mit HF-Ätzung. Danach Fe₃ O₄ Nanopartikel wurden auf rGO-Mikrohohlkugeln verankert, um rGO@Fe₃ . zu konstruieren O₄ Mikrokugeln. In diesem System dient rGO als NIR-getriggerter PTT-Agent und Fe₃ O₄ kann der Hela-Zelle die magnetische Targeting-Eigenschaft bieten. Doxorubicin (DOX), verkapselte Mikrokügelchen (rGO@Fe₃ O₄ /DOX) basierend auf Porenadsorption und π-π-Stapelung, soll eine ultrahohe Wirkstoffbeladungskapazität und ein pH-abhängiges Wirkstofffreisetzungsverhalten aufweisen und die Antikrebswirkung für die Kombination aus photothermischer Chemotherapie signifikant verstärken.

Schematische Darstellung von rGO@Fe₃ O₄ /DOX-Mikrosphären und die kombinierte photothermische Chemotherapie zur Tumorhemmung

Materialien und Methoden

Materialien

Eisenchlorid-Hexahydrat (FeCl₃ .) ·H₂ O), Natriumhydroxid (NaOH) und Eisensulfat-Heptahydrat (FeSO₄ .) ·7H₂ O) wurden von Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. bezogen. Hela-Zellen stammen vom Tianjin Cancer Hospital. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)_, Doxorubicinhydrochlorid (DOX·HCl), Dulbeccos minimales essentielles Medium (DMEM), 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) und das Zellzählkit-8 (CCK-8) wurden von Solarbio Science and Technology Co. , Ltd. SiO₂ (~ 300 nm) wurde von der Shanghai Yuanjiang Chemical Company gekauft. Graphenoxid-Deionwasserlösung (2 mg/ml) war ein im Handel erhältliches Produkt von Nanjing Xianfeng Company

Vorbereitungen von rGO@Fe₃ O₄ Mikrosphären

Hohle Graphen-Mikrokügelchen wurden durch ein Sprühtrocknungsverfahren unter Verwendung von SiO₂ . hergestellt (300 nm) als Vorlage. Kurz gesagt, 100 mL SiO₂ Suspensionsflüssigkeit (50 mg mL ⁻¹ ) wurde langsam in eine wässrige 300 mL GO-Lösung getropft (2 mg mL ⁻¹ ) unter starkem Rühren wurde die gemischte Lösung bei 200°C in einer Sprühtrocknereinheit sprühgetrocknet. Anschließend wurde das Produkt bei 300 °C unter Ar-Schutz für 2 h und rGO-SiO₂ . gehalten wurde erhalten. So entfernen Sie SiO₂ , rGO-SiO₂ wurde für 48 h bei 60 °C in HF-Lösung (10 %) gegeben. Das feste Produkt wurde mehrmals gewaschen und in einem Vakuumtrockenschrank bei 60 °C für 12 Stunden getrocknet, schließlich wurde rGO mit einer Ausbeute von 75 % erhalten.

Das rGO@Fe₃ O₄ Nanopartikel wurden über die Copräzipitationsmethode hergestellt. In einem typischen Verfahren zur Synthese von rGO@Fe₃ O₄ Nanopartikel, 0,27 g FeCl₃ ·H₂ O, 0,28 g FeSO₄ ·7H₂ O und 0,1 µg rGO hohle Mikrokügelchen wurden in 10 ml entionisiertem Wasser gelöst und 30 min bei 50 °C gerührt. Dann 60 mL NaOH (0,15 mol L ⁻¹ ) wurde langsam unter kontinuierlichem Rühren bei 50 °C für 12 h zugegeben. Die Produkte wurden schließlich magnetisch getrennt und mehrmals mit entionisiertem Wasser und Ethanol gewaschen, gefolgt von einem Trocknen bei 60 °C unter Vakuum für 12 Stunden.

Strukturelle Charakterisierung

Die Größe und Morphologie der Probe wurden unter Verwendung eines Feldemissions-Rasterelektronenmikroskops (FE-SEM, Hitachi, S-4800) und eines Transmissionselektronenmikroskops (TEM, JEM2100F, JEOL) analysiert. Die Zusammensetzung der Produkte wurde mit einem Röntgenbeugungssystem (XRD, D8 Focus, Cu Ka-Strahlung, Bruker, Deutschland) bei einer Scanrate von 12°/min im Bereich von 10 bis 80° analysiert. Außerdem wurde eine Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) auf einem XPS-Spektrometer (Thermo Fisher Scientific, ESCALAB 250Xi, Amerika) durchgeführt. Die FTIR (FT-IR, AVATAR360, Nicolet) wurden von 500 bis 4000 cm ⁻¹ . aufgezeichnet bei einer Auflösung von 4 cm ⁻¹ . Magnetische Messungen wurden unter Verwendung eines supraleitenden Quanteninterferenzgeräts (SQUID, Quantum Design MPMS) Magnetometer bei Raumtemperatur (300 K) durchgeführt. Die Raman-Spektren wurden unter Verwendung eines Raman-Spektroskops (Renishaw, inVia Reflex, England) mit einem 532 nm Wellenlängenlaser gesammelt. Der Gehalt an rGO wurde unter Verwendung eines thermogravimetrischen Analysators (TGA, TA Instruments-water LLC, SDTQ-600) bewertet. Die spezifische Oberfläche wurde unter Verwendung der Brunauer-Emmett-Teller (BET)-Technik gemessen. UV-Vis-Spektren wurden unter Verwendung eines Beckman DU 800 Nukleinsäure/Protein-Analysators (Beck-man Instruments, Inc., Rosemead, CA) aufgezeichnet.

DOX-Laden und -Freigeben

DOX, ein chemotherapeutisches Modellwirkstoff Doxorubicin, wurde in die Kerne von rGO@Fe₃ . eingekapselt O₄ das Beladungs- und Freisetzungsverhalten von Krebsmedikamenten in vitro zu bewerten. rGO@Fe₃ O₄ /DOX wurde gemäß der vorherigen Referenz hergestellt. Kurz gesagt, 10 mL (0,2 mg mL ⁻¹ ) einer wässrigen DOX-Lösung wurde zu 10 mg rGO@Fe₃ . gegeben O₄ Lösung wurde die Mischung mit Ultraschall homogenisiert, um keine signifikante Ausfällung zu gewährleisten. Dann wurde die Mischung auf einem hin- und hergehenden Schüttler (SK-O180-Pro) bei einer Geschwindigkeit von 150 U/min für 24 Stunden äquilibriert. Nach Zentrifugation bei 6000 rpm für 10 min wurde unbeladenes DOX entfernt, der Überstand von rGO@Fe₃ O₄ /DOX wurde mit einem UV-Vis-Spektrophotometer gemessen, um die Menge an geladenem DOX zu bestimmen. Die OD von DOX wurde bei 490 nm aufgezeichnet, die folgenden Gleichungen wurden verwendet, um die Beladungseffizienz (LE) und Beladungskapazität (LC) von DOX zu berechnen:

Die in vitro-Freisetzungsstudien von DOX wurden durchgeführt, indem rGO@Fe₃ O₄ /DOX (10 mg) in einem Dialysebeutel (MWCO =1000) mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 30 ml) bei pH 5,4, 6,5 oder 7,4, in ein 37 °C warmes Wasserbad stellen und bei 80 U/min schütteln. In vorbestimmten Intervallen wurden 3 ml des Freisetzungsmediums gesammelt und die Menge an freigesetztem DOX wurde durch Messen der UV-Vis bei 480 nm berechnet

NIR-getriggerter photothermischer Effekt von rGO@Fe₃ O₄ Mikrosphären

Um den Einfluss von rGO@Fe₃ zu überwachen O₄ Dosis auf dem NIR-ausgelösten photothermischen Effekt, dem rGO@Fe₃ O₄ Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen (0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 und 1 mg mL ⁻¹ ) wurden mit einem NIR-Laser bei 2 W cm ⁻² . bestrahlt für jeweils 5 min. Darüber hinaus wurde der Einfluss der NIR-Energie auf den photothermischen Effekt durch Bestrahlung mit rGO@Fe₃ . bewertet O₄ (0,25 mg mL ⁻¹ ) mit unterschiedlichen Leistungen (1 W cm ⁻² , 1,5 W cm ⁻² , 2 W cm ⁻² ) für 5 min. Die Echtzeittemperatur wurde mit einer FLIR I5 Infrarot-Wärmebildkamera gemessen.

In-vitro-Aufnahme

Hela-Zellen wurden in 35 mm ² . ausgesät konfokale Gerichte mit einer Dichte von 1 × 10 ⁵ Zellen/Well. Nach 24 h Inkubation im Brutschrank (5% CO₂ , 37 °C), wurde das Medium entfernt und das frische Medium mit rGO@Fe₃ O₄ /DOX-Mikrosphären und rGO@Fe₃ O₄ /DOX mit Magnet wurden zugegeben und weitere 5 h kultiviert. Das rGO@Fe₃ O₄ /DOX-Konzentration betrug 0,1 mg mL ⁻¹ . Die Zellen wurden dann dreimal mit kaltem PBS (pH =7,4) gewaschen und mit 4% Paraformaldehydlösung für 20 min fixiert (CLSM, TCSSP5II, Leica, Ernst-Leitz-Straße, Deutschland).

Zelllebensfähigkeitstests

Die Zytotoxizität dieser Mikrokügelchen wurde durch einen CCK-8-Assay nach NIR-Behandlung bewertet. HeLa-Zellen wurden auf 96-Well-Platten ausgesät (5 × 10 ³ Zellen/Well) in 100 μL des Mediums und kultiviert in 5% CO₂ bei 37 °C für 24 Stunden. Für die Biokompatibilitätsbewertung rGO@Fe₃ O₄ wurden mit einem Konzentrationsbereich von 0,01 bis 0,2 mg mL ⁻¹ . in die Vertiefung gegeben; für die einzelne photothermische Therapiegruppe, rGO@Fe₃ O₄ wurde mit einem Konzentrationsbereich von 0,01 bis 0,2 mg mL ⁻¹ . zugegeben , und Anwenden von NIR-Lichtbestrahlung für 10 min (2 W cm ^–2 , 808 nm); für die kombinierte photothermische Chemotherapie-Gruppe rGO@Fe₃ O₄ /DOX wurde mit einem Konzentrationsbereich von rGO@Fe₃ . hinzugefügt O₄ /DOX von 0,01 bis 0,2 mg mL ⁻¹ , und Anwenden von NIR-Lichtbeleuchtung für 10 min (2 W cm ^–2 ,808 nm). Die Zellen wurden 24 Stunden oder 48 Stunden lang inkubiert. Danach wurden die Zellen mit PBS gewaschen und in 100 µl DMEM-Medium, das 10 µl CCK-8-Lösung enthielt, für weitere 40 Minuten inkubiert. Die Lebensfähigkeit wurde unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts bei einer Wellenlänge von 450  nm nachgewiesen. Alle Experimente wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt.

Ergebnisse und Diskussionen

Synthese und morphologische Charakterisierung

Die Herstellung von rGO@Fe₃ O₄ Mikrokügelchen wurde in drei Schritten durchgeführt. Erstens rGO-SiO₂ Mikrokügelchen wurden durch Sprühtrocknung unter Verwendung von SiO₂ . synthetisiert als Vorlage. Die Morphologie von rGO-SiO₂ Mikrosphären wurde durch SEM und TEM charakterisiert. Wie in Abb. 1a gezeigt, ist das rGO-SiO₂ Mikrokügelchen mit Durchmessern von 3 μm wiesen eine einheitliche Kugelform auf und bestanden aus vielen dicht gedrängten SiO₂ Nanopartikel (~ 300 nm). Auch die TEM-Daten und der durch dynamische Lichtstreuung gemessene hydrodynamische Durchmesser bestätigten die Ergebnisse. (Abb. 1d, g). Dann wurden hohle rGO-Mikrokügelchen durch Entfernen von SiO₂ . erhalten aus rGO-SiO₂ mit Erhitzen auf 300°C und HF-Ätzen. Offensichtliche Poren mit einer Porengröße von etwa 300 nm konnten aufgrund von SiO₂ . beobachtet werden Auflösung (Abb. 1b, e). Schließlich Fe₃ O₄ aufgrund der magnetischen zielgerichteten Fähigkeit wurde auf dem porösen rGO durch das Copräzipitationsverfahren dekoriert. Die Beobachtung von SEM und TEM zeigte, dass die bemerkenswerte Abnahme der Porengröße nach Fe₃ O₄ Beladung wurde erhalten (Fig. 1c, f), was die Durchführbarkeit der Arzneimittelabgabe und der kontrollierten Arzneimittelfreisetzung liefert. Insbesondere die Partikelgröße und hydrodynamische Größenverteilung von rGO-SiO₂ , rGO, rGO@Fe₃ O₄ haben während dieser Behandlungen keine sichtbaren Veränderungen mehr (Abb. 1g, h, i).

Morphologische Charakterisierung von Mikrosphären. REM-Bilder von (a ) rGO-SiO₂ , (b ) rGO, (c ) rGO@Fe₃ O₄; TEM-Bilder von (d ) rGO-SiO₂ , (e ) rGO, (f ) rGO@Fe₃ O₄; hydrodynamische Größenverteilung der entsprechenden Proben (g ) rGO-SiO₂ , (h ) rGO, (i ) rGO@Fe₃ O₄

Struktur- und Zusammensetzungscharakterisierung

Zur weiteren Bestätigung der erfolgreichen Vorbereitung von rGO@Fe₃ O₄ , SEM mit EDS wurde verwendet, um die Struktur und Zusammensetzung der Mikrokügelchen zu untersuchen. Die EDS-Bilder von rGO@Fe₃ O₄ wurden durch die Visualisierung der inelastisch gestreuten Elektronen in den Energieverlustfenstern für elementares O, Fe und C charakterisiert, und die verschiedenen Farbbereiche repräsentieren O-, Fe- bzw. C-angereicherte Orte in realen Strukturen. Wie in Abb. 2a und b gezeigt, waren Fe und O in rGO@Fe₃ . weit verteilt O₄ Mikrosphären mit hoher Beladungsdichte. Abbildung 2d bestätigt, dass das Fe₃ O₄ Nanopartikel mit einem Durchmesser von etwa 18 nm gleichmäßig im rGO dispergiert, was zu einer starken Abnahme der Porengröße in rGO@Fe₃ . führt O₄ Mikrokugeln. Das ausgewählte Flächenelektronenbeugungsmuster (SAED) bestätigte weiter das Vorhandensein von Fe₃ O₄ in rGO (Abb. 2e), die charakteristische Resonanz in 2,98 nm, 2,53 nm, 2,09 nm, 1,62 nm und 1,49 nm Flächenabstand, die den 220, 311, 400, 511 und 440 Ebenen der flächenzentrierten Kubik zugeordnet sind Phase von Fe₃ O₄ , bzw. Die Peaks erschienen bei 220, 311, 400, 511 und 440 entsprechend Fe₃ O₄ wurden auch in den XRD-Spektren nachgewiesen, was mit den SAED-Ergebnissen übereinstimmt (Abb. 2c). Es wird jedoch berichtet, dass Fe₃ O₄ und γ-Fe₂ O₃ konnten durch das XRD-Muster nicht unabhängig für dieselbe Position charakteristischer Peaks unterschieden werden [35]. Das XPS-Ergebnis zeigte, dass die vorherrschenden Peaks bei 725,9/724,5 eV und 714,1/711,0 eV, entsprechend Fe2p_1/2 und Fe 2p_3/2 des rGO@Fe₃ O₄ (Abb. 2g bzw. h), was die Koexistenz von Fe ³⁺ . anzeigt und Fe ²⁺ in Fe₃ O₄ [36]. Zur Überwachung des thermischen Abbauverhaltens von rGO in rGO@Fe₃ . wurde eine thermogravimetrische (TGA) Analyse durchgeführt O₄ Mikrokügelchen durch Erhitzen der Probe auf 800 °C und Abkühlen auf 100 °C in einer Luftatmosphäre (Abb. 2f). Die Massenverlustkurve zeigte zwei unterschiedliche Massenverlustbereiche, einschließlich des Dehydratisierungsbereichs (40-300 °C) und des Entgasungsbereichs (300-800 °C) von rGO in rGO@Fe₃ O₄ , der aus der Probe berechnete Kohlenstoffgehalt betrug 25,6 Gew.-%.

Struktur- und Zusammensetzungscharakterisierung von rGO@Fe3O4. (a , b ) SEM mit EDS-Mapping-Bildern von rGO@Fe₃ O₄ Mikrokügelchen:C-, Fe- und O-Elemente; (c ) XRD-Muster von rGO-SiO₂ , rGO und rGO@Fe₃ O₄ Mikrokugeln; (d , e ) SEAD-Bilder von rGO@Fe₃ O₄ Mikrokugeln; (f ) TG-Kurven von rGO@Fe₃ O₄ Mikrokugeln; (g , h ) XPS-Spektren von rGO@Fe₃ O₄ Mikrokugeln; (ich ) Magnetische Hystereseschleifen des Fe₃ O₄ und rGO@Fe₃ O₄ Mikrokugeln (der obere Einschub zeigt die Koerzitivfeldwerte (Hc) der Proben, und der untere Einschub zeigt ihre Suspensionen vor und nach der magnetischen Trennung durch einen externen Magneten)

Die magnetischen Eigenschaften von rGO@Fe₃ O₄ Mikrokügelchen wurden mit einem supraleitenden Quanteninterferenzgerät untersucht. Das Magnetfeld wurde mit einem Scanbereich von –20.000 bis 20.000 Oe bei Raumtemperatur durchgeführt. Abbildung 2i zeigt den Sättigungsmagnetisierungswert (Ms) und den Koerzitivfeldwert (Hc) von Fe₃ O₄ sind 66,6 emu g ⁻¹ und 9,3 Oe. Nach dem Laden von Fe₃ O₄ auf rGO, den Ms-Wert und Hc-Wert von rGO@Fe₃ O₄ Mikrokügelchen sank auf 33,9 emu g ⁻¹ und 7,44 Oe. Die bemerkenswerte Abnahme der magnetischen Sättigung kann zu den diamagnetischen Eigenschaften von rGO in rGO@Fe₃ . beigetragen werden O₄ Mikrokugeln. Darüber hinaus ist die selektive Agglomerationsfähigkeit von rGO@Fe₃ O₄ Mikrosphären wurde intuitiv durch magnetisches Trennexperiment durchgeführt. Die Suspensionen des Fe₃ O₄ und rGO@Fe₃ O₄ Mikrokügelchen wurden mit einem externen Magneten für 2 min in das Fläschchen gegeben, die Suspensionen können auf die Magnetseite konzentriert werden und die wässrige Lösung wurde transparent. Als der Magnet entfernt wurde, wurde rGO@Fe₃ O₄ Mikrokügelchen wurden nach langsamem Schütteln wieder gleichmäßig dispergiert, was darauf hindeutet, dass rGO@Fe₃ O₄ Mikrokügelchen, die den Vorteil einer guten Wasserdispergierfähigkeit aufweisen. Die ausgezeichnete Wasserdispergierfähigkeit und magnetische Ansprecheigenschaft ebnete den Weg für die gezielte magnetische Anwendung von rGO@Fe₃ O₄ als Medikament bei der Krebsbehandlung eingesetzt wird.

Photothermische Effektanalyse

In Anbetracht des tieferen Eindringens in das Gewebe und der geringeren Schädigung des umgebenden Gewebes durch NIR wurde häufig eine auf NIR ansprechende photothermische Therapie zur Tumorbehandlung eingesetzt. Daher ist das photothermische Transformationsverhalten von rGO@Fe₃ O₄ wässrige Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen und unterschiedlichen Leistungsdichten wurden unter NIR-Laserbestrahlung bei 808 nm für 5 min aufgezeichnet. Abbildung 3a, b zeigten, dass die Temperaturerhöhung von rGO@Fe₃ O₄ war stark von der Konzentration und der Laserleistungsdichte abhängig. Wenn die Konzentration der Mikrokügelchen bis zu 1 mg mL ⁻¹ . betrug , erhöhte sich die Temperatur von 27,9 auf 70,3 °C unter NIR-Laserbestrahlung für 5 min bei 2 W cm ⁻² , während die Temperatur für die PBS-Gruppe gerade von 31,7 auf 36,2 °C gestiegen ist. Die hohe photothermische Umwandlungseffizienz von rGO@Fe₃ O₄ haben ein großes Potenzial für die photothermische Tumortherapie nach einem früheren Bericht, dass Proteindegeneration und DNA-Schäden in Zellen auftreten (passieren), wenn sie 4 bis 6 Minuten lang 50 °C ausgesetzt werden [21, 37]. Zur intuitiven Anzeige des photothermischen Transformationsverhaltens von rGO@Fe₃ O₄ , IR-Thermografie wurde durchgeführt und die Ergebnisse sind in Fig. 4c gezeigt. Das rGO@Fe₃ O₄ Lösung mit einer Konzentration von 1 mg mL ⁻¹ wurde nach einer NIR-Bestrahlung für 5 Minuten schnell auf 70,3 °C erhöht, während die Wassergruppe keine offensichtlichen Veränderungen aufwies, was mit den thermometrischen Ergebnissen übereinstimmte. Darüber hinaus ist die photothermische Stabilität von rGO@Fe₃ O₄ wurde untersucht, indem ein Laser-Ein/Aus-Verfahren mit einem 808 nm-Laser bei 2 W cm ⁻² . durchgeführt wurde für sechs Zyklen (Abb. 3d). Die identische Temperaturerhöhung wurde erhalten, was die perfekte photothermische NIR-Stabilität von rGO@Fe₃ . anzeigt O₄ Verbundstoffe. Diese Ergebnisse zeigten, dass rGO@Fe₃ O₄ Mikrosphären, die als photothermisches Mittel für die photothermische Therapie bei Krebs vielversprechend sind.

Photothermische Effekte von rGO@Fe3O4. a Konzentrationsabhängige Temperaturänderung von rGO@Fe₃ O₄ Lösungen in verschiedenen Konzentrationen (0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 und 1 mg mL ⁻¹ ) unter 808 nm Bestrahlung bei 2 W cm ⁻² für 5 min. b Leistungsabhängige Temperaturantwort von 0,25 mg mL ⁻¹ rGO@Fe₃ O₄ Lösung unter Bestrahlung mit einem 808 nm NIR-Laser für 5 min (1 W cm ⁻² , 1,5 W cm ⁻² , 2 W cm ⁻² ). c Infrarot-Wärmebilder von rGO@Fe₃ O₄ Lösung in Intervallen von 0, 1, 2, 3, 4 und 5 min, stimuliert bei 808 nm (2 W cm ⁻² ). d Temperaturanstieg von rGO@Fe₃ O₄ (0,25 mg mL ⁻¹ ) Lösung während 6 aufeinanderfolgenden Zyklen Laser ein/aus unter 808 nm Bestrahlung bei 2 W cm ⁻²

Oberfläche und Porengröße von rGO@Fe3O4-Mikrokügelchen, DOX-Beladung und -Freisetzungsverhalten. a Stickstoffadsorptions-Desorptions-Isothermen von rGO@Fe₃ O₄ . b Porengrößenverteilung von rGO@Fe₃ O₄ . c FTIR-Spektren von rGO@Fe₃ O₄ und rGO@Fe₃ O₄ /DOX. d , e SEM- und Mapping-Bilder von N, Fe und O von rGO@Fe₃ O₄ /DOX-Mikrosphären. f Kinetische Kurven der Wirkstofffreisetzung bei verschiedenen pH-Werten von rGO@Fe₃ O₄ Mikrokugeln. g NIR-responsive kinetische Kurven der DOX-Freisetzung

Laden und Freigeben von Medikamenten

Oberfläche und Porengröße von rGO@Fe₃ O₄ wurden durch BET- und BJH-Analysen ausgewertet (Abb. 2a, b). N₂ Der Adsorptions-Desorptions-Kurventyp war der isotherme IV-Typ und die Oberfläche und Porengröße betrugen 120,7 m ² g ⁻¹ , 2-8 nm und 1.012 cm ³ g ⁻¹ , bzw. Die Ergebnisse zeigten, dass rGO@Fe₃ O₄ besaßen mesoporöse Kanäle und eine durchschnittliche Porengrößenverteilung, was ein großes Potenzial für die Beladung mit Antitumor-Medikamenten aufwies. Dann das rGO@Fe₃ O₄ Mikrokügelchen mit poröser Struktur wurden dazu verwendet, ein chemotherapeutisches Modellarzneimittel Doxorubicin durch einfaches Mischen und leichte Beschallung zu beladen. Die ATR-FTIR-Analyse bestätigte weiter den stabilen Einbau von DOX in rGO@Fe₃ O₄ aufgrund der charakteristischen Resonanz von -COOH und Benzolgruppen von DOX bei 1726 cm ⁻¹ und 1618 cm ⁻¹ (Abb. 4c). Die Beobachtung durch Rasterelektronenmikroskopie (REM) zeigte, dass die neuen Signale von N Elementen, die DOX zugeordnet wurden, nach der DOX-Beladung gleichmäßig in den Mikrokügelchen verteilt waren (Abb. 4d, e). Darüber hinaus sind die DOX-Beladungseffizienz (LE) und die Beladungskapazität (LC) von rGO@Fe₃ O₄ /DOX betrug 92,15% bzw. 18,43%. Die bemerkenswert höheren LCs von rGO@Fe₃ O₄ /DOX als viele Wirkstoffträger kann zu extrem großen Oberflächen und Porengrößen beigetragen werden [19]. Der hohe LE von rGO@Fe₃ O₄ /DOX kann auf zwei Aspekte zurückgeführt werden, einer ist, dass rGO@Fe₃ O₄ kann mit DOX durch starke π-π-Stapelung zwischen sp2-hybridisierten π-Bindungen von rGO@Fe₃ . wechselwirken O₄ und dem Chininanteil von DOX [21], und ein anderer könnte sein, dass sie Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Carbonsäure- (–COOH) und Hydroxylgruppen (–OH) von rGO@Fe₃ . bilden können O₄ und das Amin (–NH₂ ), Hydroxylgruppen (–OH) von DOX. Dann überwachten wir das DOX-Freisetzungsverhalten in PBS bei pH 7,4, 6,5 und 5,4, um die extrazelluläre Umgebung von Tumoren und normalem Gewebe nachzuahmen. Wie in 4f gezeigt, wurde die Freisetzungsrate von DOX beschleunigt, wenn der pH von 7,4 auf 5,4 eingestellt wurde, und die anhaltende DOX-Freisetzung bei pH 5,4 kann bis zu 73% nach einer Behandlung von 98 Stunden betragen. Daher ist das kumulative Freisetzungsprofil von DOX aus rGO@Fe₃ O₄ zeigte eine pH-abhängige Weise. Diese beschleunigte Freisetzung unter sauren Bedingungen könnte auf die teilweise Protonierung der Hydroxyl- und Amingruppen von DOX zurückzuführen sein, was zu einer höheren Wirkstofflöslichkeit und einer Schwächung der Wasserstoffbrücken zwischen DOX und Graphen führt [38]. Darüber hinaus haben wir auch das NIR-responsive DOX-Freisetzungsverhalten in vitro untersucht. Wie in 4g angegeben, wurde die DOX-Freisetzung durch NIR-Strahlung beschleunigt und die Freisetzungsrate von DOX betrug bis zu 85%. Dieses auf pH- und NIR-Stimuli ansprechende Verhalten spielt eine wichtige Rolle bei der effektiven Wirkstoffabgabe an die Tumorstelle.

In-vitro-Zellaufnahme

Um die magnetische Targeting-Fähigkeit von Fe₃ . zu überprüfen O₄ in rGO@Fe₃ O₄ microsphere wurden die zellulären Aufnahmeexperimente mit oder ohne Magnetfeldbehandlung qualitativ durch konfokale Laserscanningmikroskopie (CLSM) untersucht. Hela-Zellen wurden mit rGO@Fe₃ . inkubiert O₄ /DOX für 4 h und die Kerne von Hela wurden durch DAPI gefärbt. Die Ergebnisse in Abb. 5 zeigten, dass der schwarze Fleck, der rGO@Fe₃ . entspricht, O₄ Mikrosphäre und offensichtliche intrazelluläre rote Fluoreszenzsignale, die DOX zugeordnet werden, wurden in rGO@Fe₃ . beobachtet O₄ Gruppe mit einer Magnetfeldbehandlung. Im Gegensatz dazu gab es weniger schwarze Flecken und eine schwächere DOX-Fluoreszenz kann gefunden werden, wenn rGO@Fe₃ O₄ Gruppe ohne Magnetfeldbelastung. Die Erklärung könnte sein, dass der rGO@Fe₃ . zugeschriebene schwarze Fleck In die Zelle internalisiertes O4 könnte durch einen Magneten gefördert werden. Die Ergebnisse zeigen, dass Fe3O4 in rGO@Fe₃ O4/DOX könnte Hela-Zellen effizient gezielt angreifen und die Zellinternalisierung von Mikrokügelchen signifikant verbessern, was die günstige magnetische Targeting-Fähigkeit des Wirkstoffabgabesystems in der Krebstherapie demonstriert.

Magnetische Target-Evaluierung von rGO@Fe3O4-DOX-Mikrosphären. CLSM-Bilder von rGO@Fe₃ O₄ /DOX-inkubierte HeLa-Zellen mit und ohne Magnet (Einschübe zeigen das Bild bei starker Vergrößerung)

In-vitro-Zytotoxizitätsanalysen

Die Biokompatibilität von rGO@Fe₃ O₄ wurde unter Verwendung des CCK-8-Assays für Hela-Zellen bewertet. Wie in Abb. 6a gezeigt, nach Inkubation mit rGO@Fe₃ O₄ bei einem breiten Konzentrationsbereich war die Zelllebensfähigkeit auch bei hohen Konzentrationen von bis zu 200 μg mL ⁻¹ . über 90% , zeigten die Ergebnisse, dass rGO@Fe₃ O₄ weist eine hohe Biokompatibilität auf und könnte als effiziente Plattform für die Wirkstoffabgabe dienen. Die Wirksamkeit der photothermischen Therapie von rGO@Fe₃ O₄ wurde nach Inkubation mit Hela-Zellen für 24 h und 48 h unter NIR-Lichtbestrahlung (808 nm NIR-Laser, 10 min) weiter untersucht. Wie in Abb. 6b gezeigt, war die Phototoxizität eindeutig dosisabhängig von der NIR-Stimulation, und die Lebensfähigkeit der Zellen nahm von 90,37 auf 35,52 % nach 24 Stunden und von 93,77 auf 31,75 % nach 48 Stunden ab, was darauf hindeutet, dass rGO@Fe₃ O₄ hatten eine ausgezeichnete Phototoxizität und sind vielversprechend in der photothermischen Therapie. Um die synergetische therapeutische Wirksamkeit der photothermischen Chemotherapie abzuschätzen, wurde die Zytotoxizität von rGO@Fe₃ O₄ /DOX gegenüber Hela-Zellen mit und ohne NIR-Bestrahlung wurden untersucht. Wie in Fig. 6c, d gezeigt, zeigte sich die Zelllebensfähigkeit konzentrationsabhängig und zeitgesteuert. Ungefähr 65 % und 80 % der Hela-Zellen wurden durch rGO@Fe₃ . abgetötet O₄ /DOX ohne NIR-Bestrahlung und DOX bei 24 h, die verminderte Fähigkeit von rGO@Fe₃ . zur Abtötung von Tumoren O₄ /DOX im Vergleich zu freiem DOX kann auf das verzögerte DOX-Freisetzungsverhalten von rGO@Fe₃ . zurückzuführen sein O₄ /DOX-Mikrosphären. Nach NIR-Laserbestrahlung (808 nm NIR-Laser, 10 min), rGO@Fe₃ O₄ /DOX mit Lasergruppe tötete mehr als 86% der Zellen bei einer DOX-Äquivalentdosis (30 μg mL ⁻¹ ). Ähnliche Ergebnisse konnten nach 48 Stunden der gleichen Behandlung der Zellen beobachtet werden, die Abnahme der Zelllebensfähigkeit von DOX, rGO@Fe₃ O₄ /DOX, rGO@Fe₃ O₄ /DOX with NIR irradiation group was 80%, 76%, and 90%, respectively, indicating a synergistic effect of the combined photothermal therapy and chemotherapy.

The biocompatibility and the therapeutic efficacy of single photothermal therapy or combined photothermal-chemotherapy. a Cell viability of Hela cells cultured with rGO@Fe₃ O₄ for 24 h and 48 h. b Cell viability of Hela cells cultured with or without NIR irradiation at different concentrations of rGO@Fe₃ O₄ for 24 h and 48 h. (c , d ) Cell viability of Hela cells cultured with free DOX, rGO@Fe₃ O₄ /DOX microspheres for 24 h and 48 h with and without NIR irradiation (808 nm, 2 W cm ⁻² ) (*p <0,05, **p <0.01, ***p <0.001)

Schlussfolgerungen

In summary, we explored a facile strategy to construct rGO-based drug delivery platform rGO@Fe₃ O₄ /DOX for synergistic photothermal-chemotherapy. rGO@Fe₃ O₄ /DOX microsphere exhibited excellent NIR-triggered PTT effect and perfect NIR photothermal stability. Das Fe₃ O₄ on the microspheres ensured excellent tumor cells targeting ability. DOX could be encapsulated into rGO@Fe₃ O₄ with an ultrahigh drug-loading capacity and a pH-responsive drug release behavior could be simultaneously achieved. In addition, an enhanced antitumor efficiency was achieved when a combination of chemotherapy and photothermal therapy. Therefore, this multifunctional drug delivery platform could be a promising candidate for tumor targeting and combinatorial cancer therapy in the future.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

The data and the analysis in the current work are available from the corresponding authors on reasonable request.

Abkürzungen

DDS:

Drug delivery system

NIR:

Nahinfrarot

GO:

Graphenoxid

DOX:

Doxorubicin

DMEM:

Dulbecco’s minimum essential medium

DAPI:

4',6-diamidino-2-phenylindole

CCK-8:

Cell counting kit-8

SEM:

Rasterelektronenmikroskopie

TEM:

Transmissionselektronenmikroskop

XRD:

X-ray diffraction system

XPS:

Röntgenphotoelektronenspektroskopie

FTIR:

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie

TGA:

Thermogravimetric analyzer

LE:

Loading efficiency

LC:

Loading capacity