Curcumin-beladene Nanopartikel mit fokussierter, ultraschallinduzierter Phasentransformation niedriger Intensität als tumorzielende und pH-sensitive theranostische Nanoplattform des Ovarialkarzinoms

Einführung

Eierstockkrebs ist eine stark metastasierende und tödliche Erkrankung mit einer hohen Sterblichkeitsrate [1, 2]. Da die frühen klinischen Symptome nicht auffällig sind, sind Tumorzellen bei der Diagnose der meisten Patienten bereits stark metastasiert [3]. Die am häufigsten verwendeten Behandlungen in der Klinik sind kombinierte zytoreduktive Chirurgie und Chemotherapie, und die 5-Jahres-Überlebensrate von Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung ist sehr gering [4]. Daher ist es dringend erforderlich, neue Strategien für die Behandlung und Diagnose von Eierstockkrebs zu entwickeln, um das Gesamtüberleben der Patientinnen zu verbessern. Kürzlich hat eine Nanoplattform, die zielgerichtete Therapie und bildgebende Diagnosefunktionen kombiniert, eine alternative Behandlungsstrategie für die wirksame Behandlung von Tumoren bereitgestellt [5,6,7].

In den letzten Jahren wurde die Acoustic-Response-Nanoplattform (ARN) häufig in der Tumortherapie und in der diagnostischen Forschung eingesetzt [8, 9]. ARN wird normalerweise als Mikrobläschen (MBs) oder Nanopartikel (NPs) Modelle entworfen [10,11,12]. Im Vergleich zu MBs haben NPs eine kleinere Partikelgröße, eine höhere Permeabilität, einen längeren pharmakokinetischen Zyklus, eine bessere Stabilität und eine einfachere Fähigkeit zur Oberflächenmodifizierung [13]. Verschiedene Arten von phasentransformierbaren flüssigen Fluorkohlenstoffen, wie Perfluorpentan (PFP), Perfluorhexan (PFH) und Perfluoroctylbromid (PFOB), werden häufig verwendet, um ein akustisches Ansprechverhalten zu erreichen [14,15,16,17,18,19]. Diese flüssigen Fluorkohlenwasserstoffe könnten durch akustische Tröpfchenverdampfung (ADV) unter externer fokussierter Ultraschallstimulation Blasen oder sogar Platzen erzeugen. Dieser Prozess bietet dem ARN verbesserte Ultraschallkontrastfähigkeiten. Unter diesen flüssigen Fluorkohlenwasserstoffen hat PFP einen niedrigen Siedepunkt (29,2 °C) und neigt zur Vergasung im Körper, was zu einer Gasembolie führt; PFOB hat einen sehr hohen Siedepunkt (144 °C) und erfordert ultrahochintensiven Ultraschall, um Phasenänderungen zwischen Flüssigkeit und Dampf auszulösen. Daher gilt PFH mit einem Siedepunkt von 56 °C als ideales Phasenumwandlungsmaterial. PFH ist jedoch hydrophob, und es ist eine gute Idee, es in die Nanopartikel einzukapseln, um es wasserlöslich zu machen. Gegenwärtig wurde über verschiedene Materialien wie Liposomen, PLGA, organische mesoporöse, organische Polymere usw. zum Einkapseln flüssiger Fluorkohlenstoffe berichtet [20,21,22,23,24]. Gleichzeitig können diese Träger mit Krebsmedikamenten beladen werden, um ARN chemotherapeutische Funktionen zu ermöglichen und die Fähigkeit zur akustisch kontrollierten Wirkstofffreisetzung zu zeigen [16, 19]. Obwohl berichtet wurde, dass diese akustisch ansprechenden Nanoplattformen gute Tumordiagnose- und Behandlungsintegrationsfähigkeiten aufweisen, gibt die Biokompatibilität von Nanoträgern immer noch Anlass zur Sorge für die klinische Transformation. In den letzten Jahren wurden eisenfreie Ferritin-Nanokäfige häufig als Vehikel zur Wirkstoffabgabe verwendet, da sie endogene Proteine ​​sind und eine signifikante pH-Sensitivität aufweisen [25,26,27]. Sie können sich in sauren Umgebungen zersetzen und in alkalischen Umgebungen wieder zusammensetzen. Dies macht Ferritin hochgradig biokompatibel und verleiht ihm eine kontrollierte Wirkstoffaufnahme- und Freisetzungskapazität.

In dieser Studie wurde Ferritin als Träger verwendet, um sowohl PFH als auch Curcumin (Cur) zu beladen und das tumorspezifische Targeting-Molekül FA auf der Proteinoberfläche zu modifizieren, um eine multifunktionale Nanoplattform (FA-FCP) zu erhalten. Curcumin ist ein natürliches Polyphenol, das aus Kurkuma gewonnen wird und von dem berichtet wurde, dass es günstige Antikrebswirkungen hat; seine Wasserlöslichkeit ist jedoch schlecht [28,29,30,31]. FA-FCP verbessert die Wasserlöslichkeit von PFH und Cur, besitzt eine hohe physiologische Stabilität in verschiedenen Medien und besitzt eine günstige Biokompatibilität und Biosicherheit in vivo und in vitro. Unter den Bedingungen von LIFU und bei pH =5,0 setzt FA-FCP innerhalb von 24 Stunden eine große Menge an Medikamenten frei (53,2%). Nach 4 min LIFU (7 W) Behandlung liefert FA-FCP bei pH =5,0 eine kontrastverstärkte Ultraschallbildgebung. Aufgrund der FA-Rezeptor-vermittelten Endozytose kann FA-FCP leicht in Zellen eindringen und sich in Lysosomen verlagern. 18 Stunden nach der Injektion von FA-FCP wurde die Tumorstelle mit LIFU stimuliert und der Tumor zeigte eine kontrastverstärkte Ultraschallbildgebung. In-vivo- und in-vitro-Experimente haben gezeigt, dass FA-FCP eine signifikante Wirkung auf die Tumorbehandlung hat. Diese Ergebnisse zeigten, dass der Vorteil des nicht-invasiven, Ligand/Rezeptor-vermittelten Targetings, des LIFU-getriggerten Phasenübergangs oder sogar des Sprengens und der präzisen Wirkstofffreisetzung FA-FCP zu einer vielversprechenden tumortheranostischen Nanoplattform macht.

Materialien und Methoden

Materialien

Ferritin (FRT), Folsäure (FA) und Perfluorhexan (PFH) wurden von Sigma (St. Louis, MO, USA) bezogen. Curcumin (Cur) wurde von Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, China) bezogen. NH₂ -PEG₂₀₀₀ -FA und NH₂ -PEG₂₀₀₀ -COOH wurden von Xi’an Ruixi Biotechnology Co., Ltd (China) geliefert. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) und N -Hydroxysuccinimid (NHS) wurden von Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) gekauft. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) wurde von Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japan) erhalten. Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), Penicillin-Streptomycin, Trypsin-EDTA und fetales Rinderserum (FBS) wurden von Gibco (Grand Island, NY, USA) bezogen.

Vorbereitung des FA-FCP

Zur Herstellung von FA-FCP wurden zunächst 10 mg FRT in 10 ml Wasser gelöst. Insgesamt 10 mg Cur wurden in 0,3 ml DMSO gelöst. Die zwei Arten von Lösungen und 1 &mgr;ml PFH wurden unter pH 5,0-Bedingungen und 30-minütiger Eisbad-Ultraschallbehandlung gemischt. Danach wurde der pH-Wert der Mischung auf 7,4 eingestellt, um mit Cur und PFH beladene FRT (FCP) zu erhalten. Zweitens wurde das Zielmolekül FA durch die Carbodiimid-Methode kovalent mit FCP konjugiert [8]. Kurz gesagt, 5 mg NH₂ -PEG₂₀₀₀ -FA wurde in Gegenwart von EDC (5 mg/ml) und NHS (20 mg/ml) in die obige FCP-Lösung gegeben. Nach 3-stündiger Reaktion bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren wurde die Mischung durch Dialyse gegen destilliertes Wasser (MW-Grenzwert =12 kDa) für 24 h gereinigt, was FA-konjugiertes FCP (FA-FCP) ergab. Das Cur-Beladungsverhältnis wurde mit einem UV-Vis-Spektrophotometer bei 426 nm nachgewiesen und berechnet als (A_a −A_b )/A_c , wobei A_a , A_b und A_c repräsentieren das Gewicht von FA-FCP, FA-FP bzw. FA-FP.

Charakterisierungen

Die Größen und Zetapotentiale der Nanopartikel wurden mit einem Zeta Sizer (Malvern, NanoZS, UK) getestet. Die Morphologie der Nanopartikel wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, Hitachi, Japan) und Rasterkraftmikroskopie (AFM, Agilent Technologies 5500LS, Chandler, Arizona) beobachtet. Die zelluläre Aufnahme der Nanopartikel wurde durch konfokale Laserscanningmikroskopie (LEXT OLS4100, Olympus, Japan) und Durchflusszytometrie (BD, Franklin Lakes, NJ) nachgewiesen. Absorptionsspektren wurden mit einem UV-Vis-Spektrophotometer (UV1800, Shimadzu, Japan) aufgenommen.

Zellkultur und Tiermodell

Die menschliche Eierstockkrebszelllinie SK-OV-3 wurde vom Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, bereitgestellt. Die Zellen wurden in DMEM-Medien kultiviert, die 10 % fötales Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung in 5 % CO₂ . enthielten bei 37 °C.

Balb/c-Nacktmäuse (weiblich, etwa 5 Wochen) wurden von Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Beijing, China) bereitgestellt. Für das SK-OV-3-Tumormodell 1 × 10 ⁶ Zellen wurden subkutan in die rechte Rückenregion von Mäusen injiziert. Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren der Sichuan Academy of Medical Sciences durchgeführt und wurden von der Ethikkommission der Sichuan Academy of Medical Sciences genehmigt.

pH/LIFU-getriggerte Stromfreigabe

Die wässrige FA-FCP-Lösung wurde in vier Portionen geteilt und in einen Dialysebeutel (MW 5000) geladen. Sie wurden dann gegen 10 ml PBS-Lösung mit einem pH von 5,0 bzw. 7,4 dialysiert. Nach 3 h wurde die wässrige Lösung mit oder ohne LIFU (7 W, 5 min) behandelt (50 % Arbeitszyklus, Pulswellenmodus und das folgende Verfahren wurde konsistent gehalten). Zu einem bestimmten Zeitpunkt wurde 1 ml Dialysat entfernt und ein gleiches Volumen und eine gleiche pH-Leerwertlösung wurde zugegeben. Das Dialysat wurde entnommen und mit einem UV-Vis-Spektrometer gemessen und die Konzentration von Cur berechnet.

ADV-Eigenschaften und US-Bildgebungsfunktion von FA-FCP

FA-FCP im Zustand pH =5,0 und 7,4 wurden mit unterschiedlicher LIFU-Leistung (5, 6, 7 W) und für unterschiedliche Gesamtzeit (3, 4 und 5 min) im Agarosegelmodell bestrahlt, dann wurden US-Bilder beobachtet von US-Geräten (Esaote Mylab 90, Italien) mit einer Frequenz von 5–12 MHz und einem mechanischen Index (MI) von 0,06. Die US-Intensität des interessierenden Bereichs im US-Bild wurde von der ImageJ-Software analysiert.

Targeting-Fähigkeit von FA-FCP

Um die Targeting-Fähigkeit von FA-FCP in vitro zu demonstrieren, wurde FITC verwendet, um die Nanopartikel zu markieren. Kurz gesagt wurde 1 µg FITC in 1 µl DMSO gelöst und dann mit FCP und FA-FCP für 30 Minuten unter leichtem Rühren gemischt. Dann wurde die gemischte Lösung über Nacht in entionisiertem Wasser dialysiert, um freies FITC und DMSO zu entfernen, um FITC-markierte Nanopartikel zu erhalten. Die Zellen wurden 24 h kultiviert, und dann wurden die FITC-markierten Nanopartikel für eine 3-stündige Inkubation in die Kulturplatten gegeben. Danach wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und dann 5 min mit DAPI, 10 min mit Lysotracker rot gefärbt, 15 min mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Schließlich wurden die Zellen mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop beobachtet. Die statistischen Fluoreszenzsignale innerhalb der Zellen wurden gemessen und mittels Durchflusszytometrie analysiert.

Blutzirkulation und Tumorakkumulation von FA-FCP

Freies Cur und FA-FCP (mit derselben Konzentration von Cur) wurden normalen Mäusen intravenös injiziert. Und dann wurde das Mausblut in verschiedenen Gruppen zu verschiedenen Zeitpunkten aus dem Orbitalplexus gesammelt und in Lysepuffer gelöst. Die Cur-Konzentration im Blut dieser behandelten Gruppen wurde durch Cur-Absorptionsspektren jeder solubilisierten Blutprobe unter Verwendung eines UV-Vis-Spektrometers bestimmt und als Prozentsatz der injizierten Dosis pro Gramm Gewebe (ID%/g) definiert.

Der Gehalt an FA-FCP im Tumor wurde an tumortragenden Mäusen bestimmt. Nach 0, 1, 6, 12, 18 und 24 h intravenöser Injektion des FA-FCP wurden die Tumorgewebe gesammelt, gewogen und 24 h lang mit Königswasserlösung verdaut. Die Cur-Konzentration im Blut dieser behandelten Gruppen wurde durch Cur-Absorptionsspektren jedes solubilisierten Tumorgewebes mit einem UV-Vis-Spektrometer bestimmt und als Prozentsatz der injizierten Dosis pro Gramm Gewebe (ID%/g) definiert.

In-vitro- und In-vivo-Antikrebswirkung

Zur In-vitro-Wirksamkeit gegen Krebs wurden die Zellen 3 Stunden lang mit PBS, Cur, FA-FCP, FCP + LIFU und FA-FCP + LIFU (bei der gleichen Cur-Dosis von 5 mg/kg) behandelt und dann mit LIFU bestrahlt ( 5 min, 7 W). Die behandelten Zellen wurden weitere 21 h inkubiert. Danach wurde die Lebensfähigkeit der behandelten Zellen durch den CCK-8-Assay nachgewiesen.

Für die In-vivo-Antikrebswirksamkeit wurden tumortragende Mäuse nach dem Zufallsprinzip in fünf Gruppen (n =6) und wurden dann mit Kochsalzlösung (Kontrolle), freiem Cur, FA-FCP, FCP + LIFU bzw. FA-FCP + LIFU intravenös injiziert. Während der 24-tägigen Behandlung wurden das Tumorvolumen und das Körpergewicht der Mäuse alle 3 Tage überwacht. Die Größe des Tumors wurde mit einem Messschieber ermittelt. Das Tumorvolumen =Länge × Breite ² /2. Die Veränderung des Tumorwachstums wurde durch relative Tumorvolumina angezeigt, die als V/V₀ . berechnet wurden , wobei V₀ stellt das anfängliche Tumorvolumen dar.

Biosicherheitsbewertung

SK-OV-3-Zellen wurden in einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 1 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen/Vertiefung und für 24 h anhaften gelassen. Verschiedene Konzentrationen (0, 20, 40, 100, 200 und 500 µg/ml) von FA-FRT-PFH wurden mit SK-OV-3-Zellen kultiviert. Nach 24-stündiger Behandlung wurden die Zellen mit DMEM-Medien, die 10 % CCK-8 enthielten, 20 min lang in einem Inkubator behandelt. Die Extinktion der Zellen bei einer Wellenlänge von 450  nm wurde mit einem Multimode-Plattenlesegerät (Thermo Scientific) nachgewiesen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu charakterisieren. Darüber hinaus wurden die Hauptorgane einschließlich Herz, Leber, Milz, Lunge und Niere von gesunden Mäusen 25 Tage nach der Injektion von FA-FCP gesammelt und durch Hämatoxylin- und Eosin-Färbung analysiert. Die HE-Färbungsbilder wurden unter Verwendung eines optischen Mikroskops beobachtet.

Statistische Analyse

Alle Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Die statistischen Daten wurden mit der Software SPSS 22.0 verarbeitet. Das t . des Schülers Es wurde ein Test durchgeführt, um die statistische Signifikanz zwischen den beiden Gruppen zu bestimmen. P <0,05 stellt einen signifikanten Unterschied dar.

Ergebnisse und Diskussion

Vorbereitung und Charakterisierung von FA-FCP

Schema 1 veranschaulicht die Synthese von FA-FCP und seine Anwendung in der Tumor-Ultraschall-(US)-Bildgebung und der kombinatorischen US-Chemotherapie in vitro und in vivo Das multifunktionelle Theranostikum FA-FCP wurde durch eine einfache und biokompatible Selbstorganisationsmethode hergestellt. Die TEM- und AFM-Bilder von FA-FCP zeigen eine kugelförmige Struktur (Abb. 1a, Einschub und Zusatzdatei 1:Abbildung S1). Die DLS-Analyse zeigte, dass FA-FCP einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa 47 nm und ein durchschnittliches Zetapotential von –37 mV in Wasser aufwies (Abb. 1a und b). Nach 4 Wochen in Wasser, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), Kochsalzlösung und FBS zeigte FA-FCP Stabilität in der Größe (Abb. 1c), was darauf hindeutet, dass das hergestellte FA-FCP eine günstige physiologische Stabilität aufwies, wahrscheinlich aufgrund der PEG-Beschichtung und die Natur der FRT [32]. Das UV-vis-NIR-Spektrum von FA-FCP zeigte den Absorptionspeak von Cur, was die Existenz von Cur in FA-FCP belegt. Das Cur-Beladungsverhältnis betrug 125,8 ± 2,1 %.

Schematische Darstellung der Montagemethode, des Syntheseprozesses und der theranostischen Anwendung des FA-FCP.

Die Charakterisierung von FA-FCP. a Größenverteilung von FA-FCP. Einschub ist das TEM-Bild von FA-FCP. b Zetapotential von FA-FCP. c Größenänderung von FA-FCP in Wasser, Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS), Kochsalzlösung und fötalem Rinderserum (FBS) in 28 Tagen. d Die UV-Vis-NIR-Absorptionskurve von freiem Cur (50 µg/ml) und FA-FCP (40 µg/ml).

Abbildung 2 zeigt das Cur-Freisetzungsprofil von FA-FCP unter verschiedenen pH-Bedingungen mit oder ohne LIFU. Ohne LIFU-Bestrahlung betrug die bei pH =5,0 freigesetzte Cur etwa 30 % über 24 h, was signifikant höher war als bei pH =7,4 (5,3 %). Unter LIFU (7 W, 4 min) zeigte das freigesetzte Cur jedoch sowohl bei pH =5,0 als auch bei pH =7,4 einen scharfen Anstieg. Verglichen mit dem bei pH =7,4 freigesetzten Cur war jedoch das bei pH =5,0 (50%) freigesetzte Cur über 24 Stunden offensichtlich höher. Diese Eigenschaft macht FA-FCP in der Tumormikroumgebung sehr nützlich. Die ausgezeichnete Wirkstofffreisetzung wird zugeschrieben (1) FRT unter sauren Bedingungen konnte den Nanokäfig zerlegen und öffnen, um das beladene Cur freizusetzen; (2) LIFU induzierte den sofortigen Phasenübergang, der es Cur ermöglichte, stetig aus der expandierten porösen Hülle zu entweichen.

Kumulative Wirkstofffreisetzung von FA-FCP in PBS (pH =5,0/7,4) bei 37 °C mit oder ohne LIFU nach 3 h. **p <0,01, verglichen mit den anderen Gruppen

In-vitro-ADV-Wirkung von FA-FCP

Der FA-FCP wurde LIFU mit einer Leistung von 5, 6 bzw. 7 W und einer Dauer von 3–5 min bei pH =7,4 oder 5,0 ausgesetzt, um den besten Zustand der Leistung und Dauer von LIFU und pH-Wert zu bewerten . Die US-Intensität repräsentiert den ADV-Effekt. Gemäß US-Bildern (Abb. 3a und b) und durchschnittlichen Graustufenwerten in US-Bildern (Abb. 3c und d) zeigte der ADV-Effekt einen zeit-/leistungsabhängigen Trend bei pH =7,4, der seinen Höhepunkt bei einem Parameter von 7 W . erreichte für 5 min. Bei pH =5,0 erreichte der ADV-Effekt jedoch bei einem Parameter von 7 W für 4 min seinen Höhepunkt. Wenn der Parameter 3 Minuten lang niedriger als 5 W war, gab es nicht genügend ausgelöste Blasen, um US-Bilder zu optimieren; sobald der Parameter jedoch 7 W für 4 min überschritten hatte, kollabierten die meisten der erzeugten Blasen und verschwanden allmählich. Die obigen Ergebnisse zeigten, dass eine bestimmte Stimulation wesentlich war, um die ADV-Wirkung von FA-FCP zu wecken, die eine Leistung von 7 W und eine Dauer von 4 Minuten bei pH =5,0 betrug.

a und b US-Bilder von FA-FCP gemischt mit Agarosegel bei unterschiedlicher Dauer und Stärke von LIFU bei pH  5,0/7,4. c und d Die entsprechenden statistischen Daten des US-Signals in Abb. 3a und b

Die Targeting-Fähigkeit von FA-FCP

Zur Markierung der Nanopartikel wurde ein klassischer niedermolekularer Farbstoff, FITC, verwendet. Wie in Zusatzdatei 1:Abbildung S2 gezeigt, zeigte die Fluoreszenzintensität von FITC-markiertem FCP und FA-FCP bei derselben Konzentration keinen signifikanten Unterschied, was darauf hindeutet, dass der Unterschied der markierten FITC-Mengen bei FCP und FA-FCP nicht in die Zelle einfließen konnte Aufnahme-Experiment. Fluoreszenzbilder und FCM-Analyse zeigten, dass einige FCP mit einem Aufnahmeverhältnis von 19,5% in Zellen eindringen können (Abb. 4a und b), möglicherweise weil die Zelloberfläche einige Ferritinrezeptoren aufweist, die die Internalisierung von FCP fördern. Nach Konjugation mit FA zeigte FA-FCP ein hohes Fluoreszenzsignal in Zellen mit 44,3% des Aufnahmeverhältnisses und einen Zusammenbruch des Aufnahmeverhältnisses (13,8%), wenn die Zellen mit freiem FA vorbehandelt wurden ( 4a und b). Die obigen Ergebnisse zeigten, dass die FA-Konjugation das Aufnahmeverhältnis von FA-FCP durch den FA-Rezeptor-vermittelten Endocytose-Effekt stark erhöhte.

a Die konfokalen Fluoreszenzbilder von Zellen, die mit freiem FITC und FITC-markiertem FCP, FA-FCP + FA und FA-FCP behandelt wurden. Grüne und blaue Farben repräsentierten die FITC- bzw. DAPI-Fluoreszenz. Maßstabsbalken =60 um. b Die FITC-Fluoreszenzsignal-Statistikdaten innerhalb von Zellen, die mit freiem FITC und FITC-markiertem FCP, FA-FCP + FA und FA-FCP durch FCM behandelt wurden. **p <0,01, verglichen mit den anderen Gruppen. c Die konfokalen Fluoreszenzbilder von Zellen, die mit FITC-markiertem FA-FCP und Lyso-Tracker-Rot behandelt wurden. Grüne, blaue und gelbe Farben repräsentierten FITC, DAPI bzw. Grün/Blau verschmolzene Fluoreszenz. Maßstabsbalken =60 um

Weiterhin wurde die Organellenlokalisation von FA-FCP mit einem lysosomspezifischen Färbefarbstoff (Lyso-Tracker Red) untersucht. Wie in 4c gezeigt, zeigten FA-FCP- und Lyso-Tracker-Rot-behandelte Zellen eine starke grüne bzw. rote Fluoreszenz im Zytoplasma. Nach der Verschmelzung von Grün und Rot war im Zytoplasma eine intensive gelbe Fluoreszenz sichtbar, was darauf hindeutet, dass FA-FCP in Lysosomen (pH ≈ 5,0) umlagern konnte, was für die Auslösung der Wirkstofffreisetzung in den Zellen von Vorteil war.

Blutzirkulation und Tumorakkumulation von FA-FCP

Wie in Fig. 5a gezeigt, betrug die Halbwertszeit von FA-FCP etwa 7,31 h (eine 8-fache Zunahme), verglichen mit der von freiem Cur, wahrscheinlich aufgrund der PEG-Beschichtung und der FRT-Einkapselung. Diese verlängerte Halbwertszeit von FA-FCP im Blutkreislauf trägt zur Verbesserung der Wirkstoffretention im systemischen Kreislauf bei und erleichtert die Akkumulation von Wirkstoffen an Tumorstellen [32, 33]. Darüber hinaus ist die dynamische Akkumulation von freiem Cur und FA-FCP im Tumor von 0 h bis 24 h nach Injektion des Nanopartikels in Fig. 5b gezeigt. Wie zu sehen ist, zeigte FA-FCP die höchste Akkumulation von 18 h und freies Cur zeigte die höchste Akkumulation von etwa 1 h nach der Injektion. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass FA-FCP im Vergleich zu freiem Cur eine signifikant höhere Akkumulationsleistung im Tumorgewebe aufwies, möglicherweise aufgrund der verbesserten Permeabilität und Retention (EPR) und des FA-Rezeptor-vermittelten aktiven Targeting-Effekts [34, 35].

a Die Blutzirkulation von freiem Cur und FA-FCP nach Injektion in Mäuse. b Der Gehalt an freiem Cur und FA-FCP in Tumorgewebe nach Injektion in tumortragende Mäuse. **p <0,01, verglichen mit den anderen Gruppen

In-vivo-US-Bildgebung

Der Tumor von Nacktmäusen, die in vier Gruppen (Blindkontrolle + LIFU, FCP + LIFU, FA-FCP + LIFU, FA-FCP ohne LIFU) behandelt wurden, wurde mit oder ohne LIFU-Exposition (7 W, 4 min) zur weiteren Untersuchung beobachtet das ADV-Potenzial von FA-FCP in vivo. Wie in Fig. 6a gezeigt, wurde bei der Kontrollgruppe unter LIFU-Bestrahlung kein offensichtliches US-Signal innerhalb des Tumors beobachtet. 18 h nach den Injektionen wurde ein signifikant stärkeres US-Signal innerhalb des Tumors in der FA-FCP + LIFU-Gruppe im Vergleich zu den Gruppen mit FCP + LIFU und FA-FCP ohne LIFU gesehen (Fig. 6a und b). Die Ergebnisse zeigten, dass FA-FCP + LIFU den US-Bildgebungskontrast des Tumors verbessern könnte.

a US-Bilder des Tumors in Kontrolle + LIFU, FCP + LIFU, FA-FCP + LIFU bzw. FA-FCP ohne LIFU-Gruppen. b Die quantitativen mittleren Graustufenwerte von US-Bildern der Tumorstelle in verschiedenen Gruppen. **p <0,01, verglichen mit den anderen Gruppen

In-vitro- und In-vivo-Antikrebstherapie

Die In-vitro-Zytotoxizität von FA-FCP wurde durch den CCK-8-Assay untersucht. Wie in 7a gezeigt, zeigte die Zelllebensfähigkeit aller Gruppen ein Cur-konzentrationsabhängiges Muster. Ohne LIFU zeigte FA-FCP im Vergleich zu freiem Cur bei allen Konzentrationen eine höhere Hemmung der Zelllebensfähigkeit, möglicherweise aufgrund des FA-Targeting-Effekts. Die Hemmung der Zelllebensfähigkeit von FA-FCP + LIFU war jedoch signifikant höher als die von FP + LIFU, FCP + LIFU und FA-FCP ohne LIFU, was darauf hindeutet, dass FA-FCP in Kombination mit LIFU-Bestrahlung eine bessere Antitumoreffizienz bot. Dieses Ergebnis war hauptsächlich auf das Vorhandensein von LIFU und die saure Umgebung des Lysosoms zurückzuführen, die beide die Wirkstofffreisetzung und den Kavitationseffekt induzieren könnten, sowie auf den FA-vermittelten Zieleffekt auf Tumorzellen [36,37,38].

a Zelllebensfähigkeit von SK-OV-3-Zellen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Cur, FP + LIFU, FA-FCP, FCP + LIFU und FA-FCP + LIFU inkubiert wurden. b Relatives Tumorvolumen von tumortragenden Nacktmäusen in den Kontroll-, Cur-, FP + LIFU-, FA-FCP-, FCP + LIFU- bzw. FA-FCP + LIFU-Gruppen. **p <0,01, verglichen mit den anderen Gruppen. c Tumorgewicht nach der Behandlung von tumortragenden Nacktmäusen in den Kontroll-, Cur-, FP + LIFU-, FA-FCP-, FCP + LIFU- bzw. FA-FCP + LIFU-Gruppen. **p <0,01, verglichen mit den anderen Gruppen. d Körpergewicht von tumortragenden Nacktmäusen in den Kontrollgruppen Cur, FP + LIFU, FA-FCP, FCP + LIFU bzw. FA-FCP + LIFU.

Die in-vivo-Antikrebswirkung des FA-FCP wurde weiter mit tumortragenden Nacktmäusen untersucht. Gemäß dem Tumorakkumulationsergebnis von FA-FCP wurde LIFU 18 Stunden nach intravenöser Injektion von Proben alle 2 Tage insgesamt dreimal vom ersten Tag an durchgeführt. Wie in 7b und c gezeigt, nahm das relative Tumorvolumen in der FA-FCP + LIFU-Gruppe im Vergleich zu den Kontroll-, Cur-, FA-FCP-, FP + LIFU- und FCP + LIFU-Gruppen nach 24 Tagen Behandlung signifikant ab. Das Tumorgewicht in den FA-FCP- und FCP + LIFU-Gruppen war signifikant geringer als in den Kontroll- und Cur-Gruppen, während es in der FA-FCP + LIFU-Gruppe noch stärker gehemmt war. Während der Behandlung hatte es in diesen Gruppen keinen signifikanten Verlust des Körpergewichts gegeben (Abb. 7d). Die brillante Antitumorwirkung von FA-FCP in Kombination mit LIFU war hauptsächlich auf die gezielte Aggregation von FA-FCP in der Tumor- und Akustik/pH-abhängigen Wirkstofffreisetzungsfähigkeit zurückzuführen [39,40,41]. Darüber hinaus könnte diese verbesserte anti-tumortherapeutische Wirksamkeit von FA-FCP + LIFU durch die verzögerte Clearance der Nanopartikel an der Tumorstelle aufgrund der verlängerten Halbwertszeit von FA-FCP im Blutkreislauf erklärt werden [42].

In-vitro- und In-vivo-Biokompatibilität

Die In-vitro- und In-vivo-Biokompatibilität von FA-FCP wurde durch den CCK-8-Assay und die H&E-Färbungsanalyse bewertet. Wie in 8a und b gezeigt, waren die Zelllebensfähigkeit des wirkstofftragenden FA-FP und die Kraft von LIFU von 0 bis 8 W alle> 90 %, was auf keine signifikante Zytotoxizität des FA-FP und die Kraft des verwendeten LIFU hindeutet in dieser Arbeit in vitro. 8c zeigt die H&E-Färbungsbilder der Hauptorgane der mit FA-FCP + LIFU behandelten Mäuse, die keine histologischen Veränderungen im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigen. Diese Ergebnisse zeigten die hohe Biokompatibilität von FA-FCP in vitro und in vivo.

a Zelllebensfähigkeit von SK-OV-3-Zellen nach Inkubation mit FA-FP für 24 h. b Zelllebensfähigkeit von SK-OV-3-Zellen nach Behandlung mit unterschiedlicher Stärke von LIFU. c H&E-Färbung der Hauptorgane der Kontrollgruppe und der FA-FCP-Gruppe 24  Tage nach der intravenösen Injektion von Nanopartikeln (×200)

Schlussfolgerung

Zusammenfassend haben wir ein multifunktionales FA-FCP hergestellt, das mit dem Krebsmedikament Cur und dem tumorgerichteten Molekül FA unter Verwendung von Ferritin-Nanokäfigen beladen ist, was zu einer kontrastverstärkten US-Bildgebungsfähigkeit und einem präzisen Targeting bei Chemotherapieverfahren führte. Das neu synthetisierte FA-FCP zeigte eine hohe in vitro- und in vivo-Biokompatibilität. Darüber hinaus zeigte FA-FCP eine hervorragende Tumor-Targeting-Fähigkeit, eine akustische/pH-getriggerte Cur-Freisetzung und einen akustisch ansprechenden Phasenübergang durch LIFU für die Ultraschallbildgebung. Angesichts dieser einzigartigen Eigenschaften von FA-FCP kann es als signifikanter Tumorinhibitionsfaktor ohne systemische Toxizität angewendet werden. Es wird erwartet, dass eine solche neuartige und biokompatible theranostische Nanoplattform die Ultraschallbildgebung mit einer verbesserten therapeutischen Wirksamkeit integrieren wird, um ein vielversprechendes Paradigma für die Behandlung von Krebs bereitzustellen.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die Schlussfolgerungen in diesem Manuskript basieren auf den Daten (Haupttext und Abbildungen), die in diesem Papier präsentiert und gezeigt werden

Abkürzungen

USA:

Ultraschall

FA:

Folsäure

FRT:

Ferritin

PFH:

Perfluorhexan

LIFU:

Fokussierter Ultraschall mit niedriger Intensität

ADV:

Akustische Tröpfchenverdampfung

FITC:

Fluoresceinisothiocyanat

CCK-8:

Zellzähl-Kit-8

FBS:

Fötales Rinderserum

EDC:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid

NHS:

N -Hydroxysuccinimid

Kurs:

Kurkumin