Hemmte MicroRNA-301 hemmt Angiogenese und Zellwachstum bei Plattenepithelkarzinomen der Speiseröhre durch Erhöhung von PTEN

Einführung

Speiseröhrenkrebs (EC), die achthäufigste Krebserkrankung weltweit, ist eine kritische Krebserkrankung mit hoher Mortalität und schlechter Prognose [1]. Das Plattenepithelkarzinom des Ösophagus (ESCC) macht etwa 90 % aller EG-Fälle aus und ist die Hauptform der EG in China [2]. Mehrere Ursachen wie niedriger sozioökonomischer Status, Rauchen, Alkoholkonsum, schlechte Nahrungsaufnahme, nitrosaminreiche oder mykotoxinbelastete Lebensmittel führen zum Auftreten von ESCC [3]. Trotz der geförderten klinischen Ergebnisse sowie der Verabreichung besteht bei den ESCC-Patienten immer noch eine schlechte Prognose mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von 15–25 % [4]. Daher ist es entscheidend, onkogene oder tumorrepressive Gene zu bestätigen, die als Biomarker bei der Entwicklung von ESCC fungieren könnten, um effektivere therapeutische Methoden für ESCC-Patienten bereitzustellen.

MicroRNAs (miRNAs) sind kleine nicht-kodierende RNAs, die eine wesentliche Rolle bei der Modulation der Genexpression spielen [5] und die die Fähigkeit haben, die Tumorprogression durch die Regulierung der mRNA-Stabilität und -Fähigkeit von mRNAs zu beeinflussen [6]. Es wurde festgestellt, dass eine Reihe von miRNAs wie miR-4324 [7], miR-889-3p [8] und miR-9 [9] mit dem ESCC-Prozess in Verbindung stehen. MiR-301 ist ein Mitglied der miRNAs, das von der Transkriptionseinheit fam33a gebildet wird, die sich bei 17q22-23 im menschlichen Genom befindet. Die Überexpression von miR-301 wurde bereits identifiziert, was darauf hindeutet, dass sie an menschlichen Krankheiten beteiligt ist [6, 10]. Die Funktionsmechanismen von miR-301 wurden jedoch in ESCC nicht aufgedeckt. Darüber hinaus wurde bestätigt, dass das Phosphatase- und Tensinhomolog (PTEN) in Tumoren häufig gestört und bei Krebspatienten durch Keimbahnmutationen angegriffen wird, was eine hemmende Rolle für Tumore spielt [11]. Es wurde bestätigt, dass die Dysregulation von PTEN mit der ESCC-Entwicklung korreliert [12]. Interessanterweise hat eine neuere Forschung gezeigt, dass miR-301 auf PTEN bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs abzielt [13]. Diese zielgerichtete Beziehung zwischen miR-301 und PTEN in der ESCC-Entwicklung muss jedoch noch enthüllt werden. Unsere Forschung konzentrierte sich auf die Auswirkungen von miR-301 und PTEN auf die ESCC-Progression, die weitgehend unbekannt und neu sind. Wir schlussfolgerten, dass miR-301 die Angiogenese und das Zellwachstum bei ESCC beeinflussen kann, indem es die PTEN-Expression moduliert.

Materialien und Methoden

Ethikerklärung

Vor der Studie wurden von allen Patienten schriftliche Einverständniserklärungen eingeholt. Die Protokolle dieser Studie wurden von der Ethikkommission des Zweiten Krankenhauses der Universität Jilin genehmigt und basieren auf den ethischen Grundsätzen für die medizinische Forschung am Menschen der Deklaration von Helsinki. Tierversuche entsprachen strikt dem Leitfaden zur Handhabung und Verwendung von Versuchstieren, der von den National Institutes of Health herausgegeben wurde. Das Protokoll der Tierversuche wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee des Zweiten Krankenhauses der Universität Jilin genehmigt.

Studienfächer

Einhundertzehn Proben von ESCC-Gewebe und angrenzendem Normalgewebe (>   5 cm vom Tumor entfernt) wurden von ESCC-Patienten (78 Männer und 32 Frauen) entnommen, die seit Januar eine Ösophagektomie in der Thoraxchirurgie des Zweiten Krankenhauses der Universität Jilin akzeptiert hatten 2015 bis Dezember 2017. Unter den 110 Patienten gab es 84 Fälle> 60 Jahre und 26 Fälle 60 Jahre; Tumorgröße:65 Fälle ≥ 5 cm und 45 Fälle < 5 cm; 71 Fälle ohne Lymphknotenmetastasen (LNM) und 39 Fälle mit LNM; das Tumor-, Knoten- und Metastasen-(TNM)-Stadium:60 Fälle befanden sich im I + II-Stadium und 50 Fälle befanden sich im III-Stadium; Tumorlokalisation:13 Fälle waren obere ESCC und 97 Fälle waren mittlere untere ESCC. Bei allen Patienten wurde ESCC diagnostiziert und sie hatten zuvor keine Strahlen- oder Chemotherapie akzeptiert. Die Tumoren wurden vollständig exzidiert und der negative Operationsrand wurde durch die Pathologie bestätigt. Nach den Staging-Kriterien der ESCC, die 2009 von der Union for International Cancer Control (UICC) [14] vorgeschlagen wurden, wurde das postoperative pathologische Staging der Patienten als pT1-4N1-2(I-IIIb)-Stadium identifiziert. Bei den Patienten nach der Operation traten keine signifikanten Komplikationen auf, und perioperative Todesfälle wurden ausgeschlossen.

Quantitative Reverse Transkription der Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)

Gesamt-RNAs in Geweben und Zellen wurden unter Verwendung von Trizol-Kits (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA) extrahiert. Die RNA-Konzentration und -Qualität wurden gemessen. RNA-Primer (Tabelle 1) wurden von TaKaRa Biotechnology Co., Ltd. (Liaoning China) entworfen und synthetisiert. Die RNA wurde gemäß den Anweisungen des Takara PrimeScript™ RT Reagenz Kits mit g DNA Eraser (Takara) in cDNA revers transkribiert. Wir haben qPCR auf dem Light Cycler 480II (Roche) mit dem Power PCR SYBR green PCR Mastermix (Takara) durchgeführt. U6 wurde als Ladekontrolle von miR-301 verwendet und β-Aktin wurde als interne Referenz von PTEN verwendet. Die Daten wurden mit 2 ^−△△Ct . analysiert Methode [15].

Western Blot-Analyse

RIPA-Lysepuffer (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China) wurde verwendet, um das Gesamtprotein in Zellen und Geweben zu extrahieren, und das Protein wurde mit einem BCA Protein Assay Kit (Beyotime) quantifiziert. Die Proteinkonzentration jeder Probe wurde gemessen und eine 10%ige Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde durchgeführt. Die Proben wurden auf Nitrozellulosemembranen übertragen, die dann über Nacht bei 4 °C mit 5 % Magermilchpulver blockiert wurden. Anschließend wurden die Membranen mit den Primärantikörpern PTEN und β-Actin (beide 1:500 und von Santa Cruz Biotechnology Inc, CA, USA) zur Inkubation über Nacht ergänzt, dann mit den jeweiligen Sekundärantikörpern versetzt und 1 h inkubiert. Nach Eintauchen in das verstärkte Chemilumineszenzreagenz (Pierce Chemical Inc., Dallas, TX, USA) für 1 Minute wurden die Membranen in einer dunklen Umgebung belichtet und unter Verwendung eines LAS4000 Mini-Chemilumineszenz-Imagers entwickelt. Die Grauwerte wurden durch eine Bildgebungssystem-Software mit β-Aktin als Kontrolle bewertet; daher wurde das endgültige relative exprimierte Protein erhalten. Die Proteinbanden wurden mit der Software ImageJ2x analysiert.

Dualer Luciferase-Reporter-Gen-Assay

Es wurde vorhergesagt, dass die Sequenz der 3'-untranslatierten Region (UTR) von PTEN mit miR-301 interagiert, oder eine mutierte Sequenz innerhalb der vorhergesagten Zielstellen wurde synthetisiert und in die XbaI- und FseI-Stellen des pGL3-Kontroll-Luciferase-Reportervektors (Promega, WI, USA). Dann wurden pGL3-PTEN-wt- und pGL3-PTEN-mut-Vektoren hergestellt. Die korrekt identifizierten wt- und mut-Luciferase-Reporterplasmide mit miR-301-Mimetika und Mimetik-NC wurden für 48 h in KYSE30- und Eca109-Zellen cotransfiziert. Anschließend wurden die Zellen lysiert und die Luciferase-Aktivitäten jeweils mit Luciferase-Nachweiskits (Promega) bestimmt.

Zellkultur, Gruppierung und Transfektion

ESCC-Zelllinien (KYSE-150, KYSE-30, Eca109 und KYSE-70) wurden vom Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China) erworben, und die menschlichen Ösophagusepithelzellen (HEECs) wurden erworben von Mingzhou Biotechnology Co., Ltd. (Zhejiang, China). Die Zellen wurden in RPMI 1640-Medium (Invitrogen), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, Life Technologies, USA), 100 Einheiten/ml Penicillin-G-Natrium (Sigma) und 100 &mgr;g/ml Streptomycinsulfat (Sigma) kultiviert. Die MiR-301-Expression und die mRNA-Expression von PTEN in jeder Zelllinie wurden durch RT-qPCR gemessen und die Zelllinie mit der höchsten und niedrigsten relativen Expression wurde für die nachfolgenden Zellexperimente ausgewählt.

KYSE-30-Zellen wurden in 7 Gruppen aufgeteilt und jeweils mit miR-301-Inhibitor, Inhibitor-Negativkontrolle (NC), pcDNA-PTEN (bezeichnet als überexprimiertes (oe)-PTEN), pcDNA-NC (bezeichnet als oe-NC), behandelt. miR-301-Inhibitor + small interfering RNA (si)-PTEN oder miR-301-Inhibitor + si-NC. Eca109-Zellen wurden ebenfalls in 7 Gruppen aufgeteilt und einzeln mit miR-301 mimic, mimic NC, si-PTEN, si-NC, miR-301 mimic + oe-PTEN, miR-301 mimic + oe-NC behandelt. Inhibitor NC, miR-301-Inhibitor, miR-301-Mimic, Mimic NC, si-NC und si-PTEN wurden von GenePharma Ltd., Company (Shanghai, China) bezogen; pcDNA-PTEN NC und pcDNA-PTEN wurden erhalten von (Shanghai Sangon Bio-technology Corporation (Shanghai, China)). Die Zellen wurden durch Lipofectamin 2000 (Invitrogen) vorübergehend in ESCC-Zellen transfiziert, wenn die Zellkonfluenz 60 % erreichte.

Cell Counting Kit (CCK-8) Assay

Die Zellen wurden in eine 96-Well-Platte ausgesät (1 × 10 ³ Zellen/Well) und für verschiedene Zeiträume inkubiert. Nach einer Inkubation von 24 h, 48 h, 72 h und 96 h wurde jede Vertiefung mit 10 μL CCK-8-Lösung (5 mg/mL) ergänzt, und dann wurden die Zellen jeder Gruppe bei 37 °C ohne Licht inkubiert 2 Std. belichtet. Die Werte der optischen Dichte (OD) bei 450 nm wurden mit einem Mikroplattenlesegerät (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) analysiert.

Kolonie-Bildungs-Assay

Die Zellen wurden nach der Transfektion mit 500 Zellen/Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen ausgesät und für 14 Tage kultiviert. Kolonien wurden mit Methanol fixiert, mit 0,5% Kristallviolett gefärbt und unter dem inversen Mikroskop gezählt.

Transwell-Assay

Zellen (5 × 10 ³ ) in RPMI 1640-Medium inkubiert wurden in apikale Kammern von Transwell-Vorrichtungen mit unbeschichteter oder Matrigel-beschichteter Membran (Corning, NY, USA) ausgesät. Nach 24 h wurden Zellen auf apikalen Kammern entfernt, während auf der Unterseite verbliebene Zellen fixiert und dann mit 0,1% Kristallviolett gefärbt wurden. Ein Mikroskop (Olympus Corporation, Tokio, Japan) wurde zum Zählen auf 3 zufälligen Feldern verwendet, um die Anzahl der Zellen zu berechnen.

Durchflusszytometrie

Zellzyklus und Apoptose wurden durch Durchflusszytometrie ausgewertet. Annexin V-Fluoresceinisothiocyanat (10 µL) und Propidiumiodid (PI; 5 µL, Sigma) wurden mit den Zellen inkubiert (5 × 10 ⁵ Zellen/Well) im Dunkeln bei 4 °C für 30 min. Der Prozentsatz apoptotischer Zellen wurde unter Verwendung eines Durchflusszytometers (BD Biosciences, CA, USA) mit der Software FlowJo Version 10 (FlowJo LLC, OR, USA) berechnet.

Um den Zellzyklus zu beurteilen, Zellen (5 × 10 ⁵ Zellen/Vertiefung) wurden mit 75% Ethanol über Nacht bei 4 °C fixiert und mit 5 μl PI/Ribonuklease A (Sigma) bei 4 °C für 30 min im Dunkeln gefärbt. Die Daten wurden mit einem Durchflusszytometer (BD Biosciences) analysiert. Fluoreszenzsignale (14.000) jeder Probe wurden gesammelt und unter Verwendung der Software ModFit LT Version 3.2 (Verity Software House, Inc., ME, USA) berechnet.

Subkutane Tumorentstehung bei Nacktmäusen

Zweiundvierzig weibliche BALB/c-nu-Nacktmäuse (Alter 4 W, Gewicht 16–24 g) wurden vom Experimental Animal Center Jilin University (Changchun, China) erhalten. Die Nacktmäuse wurden in 14 Gruppen (n = 3). Nackten Mäusen von sieben Gruppen wurden KYSE-30-Zellen entsprechend der Zellgruppierung injiziert, und Nacktmäusen in den restlichen sieben Gruppen wurden Eca109-Zellen basierend auf der Gruppierung separat injiziert. Die Konzentration der transfizierten KYSE-30- und Eca109-Zellen wurde auf 5 × 10 ⁶ . eingestellt Zellen/100 µl. Den Nacktmäusen wurden unter sterilen Bedingungen entsprechende ESCC-Zellen fixiert und subkutan injiziert. Die größte Länge (L) und Breite (W) der Tumore wurden jede Woche gemessen und das Tumorvolumen (V ) = 1/2 × L × W ² . Die Nacktmäuse wurden am 5. ^ten . eingeschläfert Woche der Injektion mit resezierten Tumoren, und die Tumoren wurden gewogen und fotografiert. Die Tumorbildungsrate wurde als Anzahl der Mäuse mit subkutanem Tumor/Gesamtzahl der injizierten Nacktmäuse in der Gruppe ×   100% berechnet. Als Abszisse wurde die Injektionszeit und als Ordinate die Tumorgröße genommen; so wurde die Tumorwachstumskurve grafisch dargestellt.

Immunhistochemische Färbung

Die Tumorgewebe von Nacktmäusen wurden mit 10 % Formaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet und in 4 µm geschnitten. Als nächstes wurden die Schnitte 2 h bei 60 °C getrocknet, mit Xylol entwachst, mit Gradienten-Ethanol dehydratisiert und mit 50 μL 3% H₂ . inkubiert O₂ für 10min. Danach wurden die Schnitte in 0,01 M Zitronensäure-Pufferlösung eingeweicht, 20 min bei 95 °C gekocht, 10 min mit normaler Ziegenserum-Arbeitslösung bei 37 °C blockiert und mit CD₃₄ . angehängt (1:100, Santa Cruz) bei 4 °C über Nacht. Danach wurden die Schnitte mit HRP-markiertem Ziegen-Anti-Kaninchen/Mäuse-IgG-Polymer (ZSGB-Bio, Peking, China) ergänzt, mit Hämatoxylin gegengefärbt, dehydriert und permeabilisiert und dann mit neutralem Balsam versiegelt. PBS wurde verwendet, um die primären Antikörper als NC zu ersetzen. Messung der Mikrogefäßdichte (MVD):Die Schnitte wurden unter einem Mikroskop mit geringer Vergrößerung betrachtet. Eine bräunlich-gelb gefärbte Endothelzelle oder ein Endothelzellcluster, die sich deutlich von den umgebenden Tumorzellen abhebt, und Bindegewebe wurden als Mikrogefäß genommen. Auch die Aststruktur wurde als Gefäß genommen, wenn sie abgetrennt war, während Gefäße mit Lumengröße  >   8 Erythrozyten, Muskelschicht oder dickerem Lumen ausgeschlossen wurden. Die Anzahl der Mikrogefäße von 3 hohen Gesichtsfeldern wurde aufgezeichnet, und die durchschnittliche Anzahl war in jedem Fall MVD.

Statistische Analyse

Alle statistischen Analysen wurden mit der Software SPSS Version SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA) durchgeführt und mit Graphpad Prism Software 6.0 präsentiert. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Unterschiede zwischen zwei unabhängigen Gruppen wurden mit dem Student-t-Test getestet. Für den Vergleich von drei oder mehr Gruppen wurde eine Einweg-ANOVA durchgeführt. P Wert < 0,05 war ein Hinweis auf einen statistisch signifikanten Unterschied.

Ergebnisse

MiR-301 wird stark exprimiert, während PTEN in ESCC-Geweben und -Zellen schlecht exprimiert wird

MiR-301- und PTEN-Expression in ESCC-Geweben und angrenzendem Normalgewebe wurde mittels RT-qPCR und Western-Blot-Analyse bewertet, um ihre Rolle bei ESCC aufzudecken, und es wurde festgestellt, dass (Abb. 1a–c) miR-301 hochreguliert war, während PTEN wurde in ESCC-Geweben herunterreguliert. Die Patienten wurden gemäß dem Medianwert der miR-301- oder PTEN-Expression in die Gruppe mit niedriger und hoher Expression eingeteilt, um die Korrelation zwischen der miR-301- oder PTEN-Expression und den klinisch-pathologischen Merkmalen von ESCC-Patienten zu analysieren. Die Ergebnisse zeigten, dass die miR-301/PTEN-Expression nicht mit Alter, Geschlecht, Tumorgröße, Lokalisation und Differenzierung in Zusammenhang stand, während sie mit dem TNM-Stadium und der LNM von ESCC-Patienten korrelierte (Tabelle 2).

MiR-301 wird stark exprimiert, während PTEN in ESCC-Geweben und -Zellen schwach exprimiert wird. a Expression von miR-301 und mRNA-Expression von PTEN im ESCC-Gewebe, nachgewiesen mittels RT-qPCR; b Proteinexpression von PTEN im ESCC-Gewebe, nachgewiesen mittels Western-Blot-Analyse; c Proteinbanden von PTEN im ESCC-Gewebe in der Western-Blot-Analyse; d Expression von miR-301 und mRNA-Expression von PTEN in der ESCC-Zelllinie, nachgewiesen mittels RT-qPCR; e Proteinexpression von PTEN in der ESCC-Zelllinie, nachgewiesen mittels Western-Blot-Analyse; f Proteinbanden von PTEN in der Western-Blot-Analyse. *P <0,05 gegenüber HEEC. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt, und der t-Test wurde für Vergleiche zwischen zwei Gruppen durchgeführt

Dann wurde die Expression von miR-301 und PTEN in 4 ESCC-Zelllinien und HEECs mittels RT-qPCR und Western-Blot-Analyse bestimmt. Wir fanden, dass (Abb. 1d–f) miR-301 hochreguliert und PTEN in ESCC-Zelllinien herunterreguliert war, unter denen KYSE-30 die höchste miR-301-Expression und die niedrigste PTEN-Expression aufwies, während Eca109 die gegenteilige Tendenz aufwies. So wurde die KYSE-30-Zelllinie mit herunterreguliertem miR-301/überexprimiertem PTEN und die Eca109-Zelllinie mit überexprimiertem miR-301/stummgeschaltetem PTEN in den zellulären Experimenten behandelt.

PTEN wird von miR-301 anvisiert

Eine bioinformatische Software (http://www.microrna.org/) sagte voraus, dass PTEN das Zielgen von miR-301 ist (Abb. 2a). Es wurde ferner durch einen dualen Luciferase-Reportergen-Assay bestätigt, dass die Luciferase-Aktivität in ESCC-Zellen, die mit PTEN-wt-Vektor und miR-301-Nachahmer kotransfiziert wurden, im Vergleich zu denen, die mit PTEN-mut-Vektor und miR-301-Nachahmer kotransfiziert wurden, signifikant verringert war. was darauf hindeutet, dass miR-301 insbesondere an PTEN binden könnte (Abb. 2b, c).

PTEN ist das Zielgen von miR-301. a Bindungsstellen von miR-301 und PTEN wurden durch Online-Vorhersagesoftware vorhergesagt; b Zielbeziehung zwischen miR-301 und PTEN in KYSE-30-Zellen wurde durch dualen Luciferase-Reportergen-Assay bestimmt; c Zielbeziehung zwischen miR-301 und PTEN in Eca109-Zellen wurde durch dualen Luciferase-Reportergen-Assay bestimmt; d Expression von miR-301- und PTEN-mRNA-Expression in KYSE-30-Zellen, nachgewiesen mittels RT-qPCR nach miR-310-Herunterregulierung oder PTEN-Hochregulierung; e Proteinexpression von PTEN in KYSE-30-Zellen, nachgewiesen mittels Western-Blot-Analyse nach miR-310-Herunterregulierung oder PTEN-Hochregulierung; f Proteinbanden von PTEN in KYSE-30-Zellen in Western-Blot-Analyse nach miR-310-Herunterregulierung oder PTEN-Hochregulierung; g Expression von miR-301 und mRNA-Expression von PTEN in Eca109-Zellen, nachgewiesen mittels RT-qPCR nach miR-310-Hochregulation oder PTEN-Herunterregulation; h Proteinexpression von PTEN in Eca109-Zellen, nachgewiesen mittels Western-Blot-Analyse nach miR-310-Hochregulation oder PTEN-Herunterregulation; ich Proteinbanden von PTEN in Eca109-Zellen in Western-Blot-Analyse nach miR-310-Hochregulation oder PTEN-Herunterregulation. *P < 0,05 gegenüber der Inhibitor-NC-Gruppe, &P < 0,05 im Vergleich zur oe-NC-Gruppe, ^# P < 0,05 im Vergleich zur miR-301-Inhibitor + si-NC-Gruppe, ein P < 0,05 gegenüber der Mimic-NC-Gruppe, b P < 0,05 gegenüber der si-NC-Gruppe, c P < 0,05 gegenüber der miR-301 mimic+ oe-NC-Gruppe; N =3. Die Daten wurden als Mittelwert ± ± Standardabweichung ausgedrückt, und der t-Test wurde für Vergleiche zwischen zwei Gruppen durchgeführt. ANOVA wurde für Vergleiche zwischen mehreren Gruppen verwendet

RT-qPCR- und Western-Blot-Analyse wurden verwendet, um die miR-301- und PTEN-Expression in transfizierten Zellen zu beurteilen, und es wurde festgestellt, dass in KYSE-30-Zellen (Abb. 2d–f) Zellen, die mit miR-301-Inhibitor behandelt wurden, miR-301 . herunterregulierten , während hochreguliertes PTEN; Zellen, die mit pcDNA-PTEN (oe-PTEN) behandelt wurden, erhöhten die PTEN-Expression, und si-PTEN kehrte die Wirkung des miR-301-Inhibitors auf die PTEN-Expression um. In Eca109-Zellen (Abb. 2g–i) imitieren mit miR-301 behandelte Zellen hochreguliertes miR-301, während herunterreguliertes PTEN; mit si-PTEN behandelte Zellen verringerten die PTEN-Expression, und pcDNA-PTEN (oe-PTEN) kehrte die hemmende Rolle der miR-301-Mimik bei der PTEN-Expression um. Diese Daten legten nahe, dass miR-301 auf PTEN abzielte.

Hemmtes miR-301 oder überexprimiertes PTEN schränkt die Lebensfähigkeit von ESCC-Zellen ein; Erhöhter miR-301 oder reduzierter PTEN fördert die Lebensfähigkeit von ESCC-Zellen

Die Lebensfähigkeit der Zellen von ESCC-Zellen wurde unter Verwendung von Koloniebildungs- und CCK-8-Assays bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass in der KYSE-30-Zelllinie (Abb. 3a–c) die Transfektion von miR-301-Inhibitor oder oe-PTEN die Koloniebildungsfähigkeit und Zelllebensfähigkeit unterdrückte; die Transfektion von stummgeschaltetem PTEN beseitigte den Einfluss des miR-301-Inhibitors auf die Lebensfähigkeit der ESCC-Zellen; in der Eca109-Zelllinie (Fig. 3d–f) förderte die Transfektion von miR-301-Mimetika oder si-PTEN die Fähigkeit zur Koloniebildung und Zelllebensfähigkeit; Die PTEN-Überexpression kehrte die fördernde Rolle der miR-301-Erhöhung bei der Koloniebildungsfähigkeit und Lebensfähigkeit von Eca109-Zellen um. Diese Ergebnisse legen nahe, dass miR-301-Knockdown oder PTEN-Überexpression die Lebensfähigkeit von ESCC-Zellen unterdrückt, die durch miR-301-Erhöhung oder PTEN-Hemmung gefördert wurden.

Inhibiertes miR-301 oder überexprimiertes PTEN schränkt die Lebensfähigkeit von ESCC-Zellen ein; erhöhtes miR-301 oder reduziertes PTEN fördert die Lebensfähigkeit von ESCC-Zellen. a Anzahl der Kolonien in KYSE-30-Zellen nach der Transfektion, die mit dem Koloniebildungsassay nach miR-310-Herunterregulierung oder PTEN-Hochregulierung nachgewiesen wurden; b Koloniebildungsfähigkeit von KYSE-30-Zellen nach Transfektion, nachgewiesen unter Verwendung eines Koloniebildungsassays nach miR-310-Herunterregulierung oder PTEN-Hochregulierung; c Lebensfähigkeit von KYSE-30-Zellen nach Transfektion, nachgewiesen unter Verwendung des CCK-8-Assays nach miR-310-Herunterregulierung oder PTEN-Hochregulierung; d Anzahl der Kolonien in Eca109-Zellen nach Transfektion, nachgewiesen mit Koloniebildungsassay nach miR-310-Hochregulierung oder PTEN-Herunterregulierung; e Koloniebildungsfähigkeit von Eca109-Zellen nach Transfektion, nachgewiesen unter Verwendung eines Koloniebildungsassays nach miR-310-Hochregulierung oder PTEN-Herunterregulierung; f Lebensfähigkeit von Eca109-Zellen nach Transfektion, nachgewiesen mit CCK-8-Assay nach miR-310-Hochregulierung oder PTEN-Herunterregulierung; *P <  0,05 gegenüber der Inhibitor-NC-Gruppe; &P < 0,05 gegenüber der oe-NC-Gruppe; ^# P < 0,05 gegenüber der miR-301-Inhibitor + si-NC-Gruppe; ein P <  0,05 gegenüber der Mimic-NC-Gruppe; b P <0,05 gegenüber der si-NC-Gruppe; c P < 0,05 im Vergleich zur miR-301-Mimic + oe-NC-Gruppe, N =3. Die Daten wurden als Mittelwert ± ± Standardabweichung ausgedrückt, und die ANOVA wurde für Vergleiche zwischen mehreren Gruppen verwendet

Hemmtes miR-301 oder überexprimiertes PTEN unterdrückt Migration und Invasion von ESCC-Zellen; Erhöhter miR-301 oder reduzierter PTEN induziert Migration und Invasion von ESCC-Zellen

Migrations- und Invasionsfähigkeiten von ESCC-Zellen wurden unter Verwendung des Transwell-Assays bewertet. Die Ergebnisse legten nahe, dass in der KYSE-30-Zelllinie ( 4a , b) die Zellmigrations- und Invasionsfähigkeiten durch die Hemmung von miR-301 oder die Überexpression von PTEN eingeschränkt wurden; Die unterdrückende Rolle des MiR-301-Inhibitors bei der Zellmigration und den Invasionsfähigkeiten wurde durch si-PTEN umgekehrt. In der Eca109-Zelllinie (Fig. 4c, d) wurden die Zellmigrations- und Invasionsfähigkeiten nach der Transfektion von miR-301-Mimic oder si-PTEN gefördert; überexprimiertes PTEN kehrte den Einfluss der miR-301-Nachahmung auf die Zellmigration und die Invasionsfähigkeiten um. Die obigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Migration und Invasion von ESCC-Zellen durch miR-301-Repression oder PTEN-Erhöhung gehemmt wurden, während sie durch miR-301-Hochregulation oder PTEN-Herunterregulation erleichtert wurden.

Inhibiertes miR-301 oder überexprimiertes PTEN unterdrückt die Migration und Invasion von ESCC-Zellen; erhöhtes miR-301 oder reduziertes PTEN fördert die Migration und Invasion von ESCC-Zellen. a Migrations- und Invasionsfähigkeiten von transfizierten KYSE-30-Zellen, die mit dem Transwell-Assay nach miR-310-Herunterregulierung oder PTEN-Hochregulierung bewertet wurden; b statistische Ergebnisse der Migration und Invasion in KYSE-30-Zellen durch Transwell-Assay nach miR-310-Herunterregulierung oder PTEN-Hochregulierung; c Migrations- und Invasionsfähigkeiten von Eca109-Zellen in den Gruppen, die mit dem Transwell-Assay nach miR-310-Hochregulierung oder PTEN-Herunterregulierung bewertet wurden; d statistische Ergebnisse der Migration und Invasion in Eca109-Zellen durch Transwell-Assay miR-310-Hochregulierung oder PTEN-Herunterregulierung. *P <  0,05 gegenüber der Inhibitor-NC-Gruppe; &P < 0,05 gegenüber der oe-NC-Gruppe; ^# P < 0,05 gegenüber der miR-301-Inhibitor + si-NC-Gruppe; ein P <  0,05 gegenüber der Mimic-NC-Gruppe; b P <0,05 gegenüber der si-NC-Gruppe; c P < 0,05 im Vergleich zur miR-301-Mimic + oe-NC-Gruppe, N =3. Die Daten wurden als Mittelwert ± ± Standardabweichung ausgedrückt, und die ANOVA wurde für Vergleiche zwischen mehreren Gruppen verwendet

Inhibiertes miR-301 oder überexprimiertes PTEN induziert Zellzyklusstillstand und Apoptose von ESCC-Zellen; Erhöhter miR-301 oder reduzierter PTEN unterdrückt die Blockierung des Zellzyklus und die Apoptose von ESCC-Zellen

Durchflusszytometrie wurde verwendet, um den Zellzyklusübergang und die Apoptose von Zellen nach der Transfektion nachzuweisen, und die Ergebnisse zeigten, dass in der KYSE-30-Zelllinie (Abb. 5a–d) die Transfektion des miR-301-Inhibitors oder oe-PTEN die Apoptoserate förderte und erhöhte Zellen in der G0/G1-Phase, während sie die in den S- und G2/M-Phasen verringerten; die durch den miR-301-Inhibitor induzierte Veränderung der Apoptose und des Zellzyklusarrests könnte durch si-PTEN rückgängig gemacht werden.

Inhibiertes miR-301 oder überexprimiertes PTEN induziert den Zellzyklusarrest und die Apoptose von ESCC-Zellen; erhöhtes miR-301 oder reduziertes PTEN unterdrückt den Zellzyklusarrest und die Apoptose von ESCC-Zellen. a Die Zellzyklusverteilung von KYSE-30-Zellen in jeder Gruppe wurde durch Durchflusszytometrie nach miR-310-Herunterregulierung oder PTEN-Hochregulierung nachgewiesen; b statistische Ergebnisse des Prozentsatzes in G0/G1-, S- und G2/GM-Phasen von KYSE-30-Zellen in der Durchflusszytometrie nach miR-310-Herunterregulierung oder PTEN-Hochregulierung; c Apoptose von KYSE-30-Zellen wurde durch Durchflusszytometrie nach miR-310-Herunterregulierung oder PTEN-Hochregulierung nachgewiesen; d Apoptoserate transfizierter KYSE-30-Zellen, nachgewiesen mittels Durchflusszytometrie nach miR-310-Herunterregulierung oder PTEN-Hochregulierung; e Die Zellzyklusverteilung von Eca109-Zellen in jeder Gruppe wurde durch Durchflusszytometrie miR-310-Hochregulation oder PTEN-Herunterregulation nachgewiesen; f statistische Ergebnisse des Prozentsatzes in G0/G1-, S- und G2/GM-Phasen von Eca109-Zellen in der Durchflusszytometrie nach miR-310-Hochregulierung oder PTEN-Herunterregulierung; g Apoptose von Eca109-Zellen wurde durch Durchflusszytometrie nach miR-310-Hochregulation oder PTEN-Herunterregulation nachgewiesen; h Apoptoserate transfizierter Eca109-Zellen, die mittels Durchflusszytometrie nach miR-310-Hochregulation oder PTEN-Herunterregulation nachgewiesen wurde. *P <  0,05 gegenüber der Inhibitor-NC-Gruppe; &P < 0,05 gegenüber der oe-NC-Gruppe; ^# P < 0,05 gegenüber der miR-301-Inhibitor + si-NC-Gruppe; ein P <  0,05 gegenüber der Mimic-NC-Gruppe; b P <0,05 gegenüber der si-NC-Gruppe; c P < 0,05 im Vergleich zur miR-301-Mimic + oe-NC-Gruppe, N =3. Die Daten wurden als Mittelwert ± ± Standardabweichung ausgedrückt, und die ANOVA wurde für Vergleiche zwischen mehreren Gruppen verwendet

Gemäß den Ergebnissen der Durchflusszytometrie haben wir festgestellt, dass in der Eca109-Zelllinie (Abb. 5e–h) die Transfektion von miR-301-Mimetika oder si-PTEN die Apoptoserate hemmte, die Zellen in der G0/G1-Phase verringerte und die der S-Phase und G2/M-Phasen; Die PTEN-Überexpression kehrte die Wirkung der miR-301-Nachahmung auf die Apoptoserate und den Zellzyklusarrest von Eca109-Zellen um. Aus diesen Ergebnissen schlossen wir, dass herunterreguliertes miR-301 oder hochreguliertes PTEN den Zellzyklusübergang und die Apoptose in ESCC-Zellen förderte, während gehemmtes miR-301 oder stummgeschaltetes PTEN entgegengesetzte Wirkungen ausübten.

Hemmtes miR-301 oder überexprimiertes PTEN hemmt Tumorwachstum und Angiogenese in vivo bei ESCC; Erhöhter miR-301 oder reduzierter PTEN erhöht das Tumorwachstum und die Angiogenese in vivo bei ESCC

Das Wachstum und die Veränderungen von ESCC-Tumoren bei Nacktmäusen wurden in jeder Gruppe beobachtet. Das Tumorwachstum wurde bewertet und die Ergebnisse implizierten, dass bei der KYSE-30-Zelllinie (Fig. 6a-e) Nacktmäuse, denen miR-301-Inhibitor oder oe-PTEN injiziert wurde, das Tumorvolumen und -gewicht reduzierten; Die repressive Rolle des MiR-301-Inhibitors beim Tumorwachstum wurde durch si-PTEN aufgehoben. In der Eca109-Zelllinie (Abb. 6f–j) wurden das Tumorvolumen und das Tumorgewicht in Nacktmäusen erhöht, denen miR-301-Mimic oder si-PTEN injiziert wurde; Überexpression von PTEN kehrte die Wirkung von miR-301-Mimetika auf das Tumorwachstum um. In der Zwischenzeit wurde die Expression von CD34 in Xenotransplantaten von Nacktmäusen mittels immunhistochemischer Färbung bewertet und die Ergebnisse zeigten, dass (Abb. 7a–d) in KYSE-30-Xenotransplantaten MVD nach miR-301-Herunterregulation oder PTEN-Hochregulation zurückgehalten wurde; stummgeschaltetes PTEN kehrte die Wirkung der miR-301-Hemmung auf MVD um. Bei Eca109-Xenotransplantaten war die MVD nach miR-301-Hochregulation oder PTEN-Herunterregulation erhöht; die durch hochregulierte miR-301 induzierte Verstärkung von MVD könnte durch überexprimiertes PTEN aufgehoben werden. Diese Daten zeigten, dass die miR-301-Hemmung oder PTEN-Überexpression das Tumorwachstum und die Angiogenese bei ESCC unterdrückte, während eine miR-301-Erhöhung oder die PTEN-Stummschaltung umgekehrte Wirkungen hatte.

Inhibited miR-301 or overexpressed PTEN restrains tumor growth in ESCC; elevated miR-301 or reduced PTEN increases tumor growth in ESCC. a Representative figures for the tumor growth observed by subcutaneous tumorigenesis in nude mice after KYSE-30 cells were transfected; b–d changes of tumor volume of each group after KYSE-30 cells were transfected; e changes of tumor weight of each group after KYSE-30 cells were transfected; f representative figures for the tumor growth observed by subcutaneous tumorigenesis in nude mice after Eca109 cells were transfected; g–i changes of tumor volume of each group after Eca109 cells were transfected; j changes of tumor weight of each group after Eca109 cells were transfected. *P < 0.05 versus the inhibitor-NC group; &P < 0.05 versus the oe-NC group; ^# P  < 0.05 versus the miR-301 inhibitors + si-NC group; a P  < 0.05 versus the mimic-NC group; b P  < 0.05 versus the si-NC group; c P  < 0.05 versus the miR-301 mimic + oe-NC group, n  = 3 mice. Data were expressed as mean ± standard deviation, and ANOVA was used for comparisons among multiple groups

Inhibited miR-301 or overexpressed PTEN restrains angiogenesis in ESCC; elevated miR-301 or reduced PTEN increases angiogenesis in ESCC. a Representative images of tumor tissues observed by immunohistochemical staining in nude mice after KYSE-30 cells were transfected; b comparisons of MVD of KYSE-30 in tumor tissues among the groups; c representative images of tumor tissues observed by immunohistochemical staining in nude mice after Eca109 cells were transfected; d comparisons of MVD of Eca109 in tumor tissues among the groups *P < 0.05 versus the inhibitor-NC group; &P < 0.05 versus the oe-NC group; ^# P  < 0.05 versus the miR-301 inhibitors + si-NC group; a P  < 0.05 versus the mimic-NC group; b P  < 0.05 versus the si-NC group; c P  < 0.05 versus the miR-301 mimic + oe-NC group, n  = 3 mice. Data were expressed as mean ± standard deviation, and ANOVA was used for comparisons among multiple groups

Diskussion

EC is a kind of invasive malignancy in the gastrointestinal tract [16]. As the major type of EC, ESCC is a malignant tumor occurring in esophageal epithelial cells [17]. The miRNAs, known as small non-coding RNAs, have been demonstrated to function as a significant roles in leading molecules in the silencing of RNA [18]. Our research was designed to explore the effects of miR-301 and its target gene PTEN on ESCC progression, and we have found that the inhibited miR-301 could suppress angiogenesis and cell growth in ESCC by elevating PTEN.

MiR-301 expression was assessed, and we found that miR-301 was highly expressed in ESCC cells in comparison with HEEC, and the higher expression of miR-301 has also been found in ESCC tissues in contrast to the adjacent normal tissues. Similar to this result, Li et al. have identified that miR-301 presented high expression in myocardial infarction tissues [19]. In addition, we have elucidated that PTEN was targeted by miR-301, and the target relation has been pointed out by an extant literature [20]. We have also discovered that PTEN, which has been affirmed to be targeted by miR-301, was downregulated in both ESCC tissues and cells. Similarly, a previous research has unearthed that PTEN was poorly expressed in ESCC compared with non-tumor esophageal epithelial tissue [21]. Furthermore, Ma et al. have illuminated that PTEN expression was degraded in Eca109 cell line [22], which has also been selected for a series of experiments in this research. These studies provide evidence for the high expression of miR-301 and low expression of PTEN in ESCC.

Another important outcome in this research indicated that the inhibited miR-301 could repress the colony formation ability as well as the cell proliferation of ESCC cells via enhancing the PTEN expression, and elevated miR-301 or reduced PTEN had contrary effects. Similarly, Han et al. have elucidated that the downregulation of miR-301 mediated by luteolin has the ability to restrain the cell proliferation in prostate cancer [6]. A recent literature has revealed that the overexpression of PTEN suppresses the proliferation of pancreatic cancer cells [23], and a same result has been summarized in a study focusing on prostate cancer [24]. Besides, we have also unearthed that the downregulation of miR-301 or the elevation of PTEN could inhibit migration and invasion of ESCC cells, and elevated miR-301 or reduced PTEN exhibited the opposite trends. In accordance with this outcome, Shi et al. have supported that inhibited miR-301 attenuated migration and invasion of breast cancer cells [10], and it has been reported that the migration and invasion of ESCC cells could be repressed by the inhibition of miR-130b and the elevation of PTEN [25]. These publications helped verifying the oncogenic role of miR-301 and tumor-repressive effect of PTEN in diverse human cancers. Another result in our research was that inhibited miR-301 overexpressed PTEN to promote cell apoptosis and induce cell cycle arrest at the G0/G1 phase in ESCC cells, and elevated miR-301 or reduced PTEN had the inverse results. Similarly, it has been uncovered by a recent literature that activated PTEN induces cell cycle arrest and apoptosis in ESCC [26]. Consistently, Tian et al. have found in their study that the elevation of PTEN inhibited the angiogenesis by reducing the expression of vascular endothelial growth factor in hepatocellular carcinoma [27]. Based on the above data, the roles of miR-301 and PTEN in cell apoptosis and angiogenesis in diverse diseases were further confirmed. Consequently, we concluded that the downregulation of miR-301 could restrain the tumor growth in ESCC through the high expression of PTEN, and the similar conclusion has also been unveiled in breast cancer [10] and prostate cancer [28]. On the contrary, miR-301 elevation or PTEN reduction induced the tumor growth in ESCC. It could be concluded that miR-301 and PTEN participated in the in vivo cancer cell growth.

Conclusion

In this study, we have shown that the repression of miR-301 prohibits angiogenesis, cell proliferation, migration and invasion but promotes apoptosis in ESCC cells by upregulating PTEN. This research may further the understanding on potential molecular mechanisms of ESCC and provide novel targets for ESCC treatment.

Abkürzungen

ESCC:

Esophageal squamous cell carcinoma

PTEN:

Phosphatase and tensin homologue

MVD:

Mikrogefäßdichte

EC:

Esophageal cancer

miRNAs:

MicroRNAs

LNM:

Lymph node metastasis

UICC:

Union for International Cancer Control

RT-qPCR:

Reverse Transkription quantitative Polymerase-Kettenreaktion

3′UTR:

3′-Untranslated region

WT:

Wild type

MUT:

Mutant type

HRP:

Meerrettichperoxidase

FBS:

Fötales Rinderserum

OE:

Overexpressed

NC:

Negativkontrolle

CCK-8:

Cell counting kit

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle medium

PI:

Propidiumjodid

FITC:

Fluorescein isothiocyanate

MVD:

Mikrogefäßdichte

ANOVA:

Analysis of variance