Verbesserung der Biokompatibilität von Polyanilin/Polymilchsäure-Nanofasergeweben durch kontrollierte Oberflächenmorphologie via anorganischer Säure-Dotierung

Zusammenfassung

Leitfähige und abbaubare nanofasrige Gerüste haben großes Potenzial, Zellwachstum, Proliferation und Differenzierung unter externem elektrischem Feld zu fördern. Obwohl das Problem inferiorer elektrischer Leitfähigkeit in Körperflüssigkeiten besteht, können polyanilinbasierte (PANI) abbaubare Nanofasern Zelladhäsion, Wachstum und Proliferation fördern. Um zu untersuchen, ob der Effekt durch die PANI-Morphologie verursacht wird, wählten wir drei anorganische Säuren als Dotiermittel im Prozess der in situ oxidativen Polymerisation von PANI: Salzsäure, Schwefelsäure und Perchlorsäure. Die erhaltenen Polyanilin/Polymilchsäure (PANI/PLA) Komposit-Nanofasern wurden mittels SEM, FTIR und XPS charakterisiert, wobei bestätigt wurde, dass PLA-Nanofasern erfolgreich von PANI beschichtet wurden, ohne die poröse Struktur der PLA-Nanofasern zu verändern. In-vitro-Mechanik und Abbaubarkeit zeigten, dass die Oxidationskraft der Säuredotierer berücksichtigt werden muss, da sie wahrscheinlich einen höheren oxidativen Abbau der PLA-Nanofasern bewirken. Der Kontaktwinkeltest demonstrierte, dass PANI/PLA-Komposit-Nanofasern mit unterschiedlichen Oberflächenmorphologien gute Benetzbarkeit aufweisen, was den Anforderungen an Knochengewebe-Engineering-Gerüste entspricht. Oberflächenrauheit und Zelllebensfähigkeit zeigten, dass unterschiedliche PANI-Morphologien an der Oberfläche die Zellproliferation fördern: Je höher die Oberflächenrauheit des PANI, desto besser die Biokompatibilität. Folglich hat die regulierte Oberflächenmorphologie von PANI/PLA-Komposit-Nanofasern durch unterschiedliche Säuredotierung positiven Einfluss auf die Biokompatibilität im Gewebe-Engineering.

Einleitung

Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein makromolekulares Netzwerk, das von Zellen in das extrazelluläre Stroma sezerniert wird. Sie bildet das Fundament von Zellen, Geweben und Organen, begleitet diese und zeichnet sich durch eine komplexe Gitterstruktur aus. Zudem bietet sie einen geeigneten Ort für Überleben und Aktivität von Zellen, bestimmt deren Form, kontrolliert Differenzierung, partizipiert an Migration und Stoffwechsel und beeinflusst letztlich Überleben, Wachstum und Tod. Elektrogesponnene Nanofasern können die Funktion der ECM zur Regulierung des Zellverhaltens simulieren aufgrund ihrer hohen spezifischen Oberfläche, geeigneten mechanischen Eigenschaften und Bioabbaubarkeit. Zudem können sie durch Oberflächenmodifikation unter Erhaltung der porösen Struktur multifunktional gemacht werden. Daher sind elektrogesponnene Nanofasern vielversprechende Kandidaten im Gewebe-Engineering, breit angewendet in Drug Delivery, orthopädischer Regeneration, Nervenregeneration und -reparatur.

Leitfähige Polymere (z. B. Polypyrrol [PPy], Polythiophen [PTH], Polyanilin [PANI]) zeigen gute in-vitro und in-vivo Biokompatibilität, die Zelladhäsion, Proliferation, Differenzierung und Geweberegeneration signifikant beeinflussen können. Unter diesen gilt PANI aufgrund seiner guten Verarbeitbarkeit, exzellenten Leitfähigkeit, guter Redox-Stabilität und Biokompatibilität als potenzielles Material für Gewebe-Engineering und regenerative Medizin. Unter elektrischer Stimulation kann PANI Zelladhäsion, Proliferation, Migration und Differenzierung regulieren. Zahlreiche Berichte bestätigen, dass PANI-basierte leitfähige abbaubare Komposit-Nanofasern Zellverhalten unter elektrischem Feld fördern. Allerdings besteht ein entscheidendes Problem: Die Leitfähigkeit von PANI in physiologischer Umgebung (pH = 7,4) wird durch Dedotierung abgeschwächt, was den Vorteil der elektrischen Aktivität zur Förderung von Zellproliferation und -differenzierung mindert. Während dies eine Limitation PANI-basierter leitfähiger abbaubarer Nanofasern im Knochengewebe-Engineering unter externer elektrischer Stimulation darstellt, können sie dennoch Zellproliferation und -wachstum erheblich fördern. Wir vermuteten, dass die Oberflächenmorphologie von PANI die Rauheit der Komposit-Nanofasern erhöht, was Zelladhäsion, Wachstum und Proliferation begünstigt.

Polyanilin, dotiert mit anorganischen Säuren, besitzt allgemein gute elektrische Leitfähigkeit. Allerdings beeinflussen die durch verschiedene anorganische Säuredotierer eingeführten Anionen die Leitfähigkeit und Struktur von Polyanilin. In dieser Arbeit wurden drei gängige anorganische Säuren – Salzsäure (HCl, HA), Schwefelsäure (H₂SO₄, SA) und Perchlorsäure (HClO₄, PA) – als Dotiermittel in der in situ oxidativen Polymerisation von PANI ausgewählt. Anschließend wurden mechanische Eigenschaften, Benetzbarkeit, Oberflächenmorphologie, Biokompatibilität und Zelladhäsion von PANI/Polymilchsäure (PLA) Nanofasern unter verschiedenen Säuredotierern untersucht. Die Ergebnisse zeigten: Je höher die Oberflächenrauheit des PANI, desto besser die Zellproliferation und somit die Biokompatibilität.

Methoden/Experimentell

Chemikalien

Anilin (AN) von Sigma, PLA (M_w = 60.000) von Solarbio, Dichlormethan (DCM) von Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd., N,N-Dimethylformamid (DMF) von Macklin. Ammoniumpersulfat (APS) von Aladdin, HCl und H₂SO₄ von Guangzhou Chemical Co., Ltd., HClO₄ von Macklin.

Herstellung von Polyanilin/Polymilchsäure-Nanofasern

Fertigung elektrogesponnener Polymilchsäure-Nanofasern

PLA-Partikel mit spezifischer Masse wurden in einer DCM/DMF-Mischung (Volumenverhältnis 7:3) gelöst, um eine 10 % PLA-Lösung zu erhalten. Diese wurde in eine Spritze gefüllt und mit einer Hochspannungsversorgung verbunden. Die Elektrospinnmaschine (DP-30, Tianjin Yunfan Technology Co., Ltd.) wurde auf 15 kV und 15 cm Abstand eingestellt. Die erhaltenen PLA-Nanofasern wurden über Nacht bei 40 °C vakuumgetrocknet.

Herstellung von PANI/PLA-Nanofasern dotiert mit verschiedenen anorganischen Säuren

PLA-Nanofasern wurden in einer Plasmareinigungsmaschine (PCE-6, MTI Corporation, USA) 2 min bei 30 W RF-Leistung entladen. Drei anorganische Säuren (HCl, H₂SO₄, HClO₄) dienten als Dotiermittel für die in situ oxidative Polymerisation zur Herstellung von PANI/PLA-Nanofasern. Die entsprechenden PANI-Nanofasern wurden als PANI-HA, PANI-SA, PANI-PA bezeichnet; die Komposit-Nanofasern als PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA, PANI/PLA-PA. Der Herstellungsprozess ist in Abb. 1 schematisch dargestellt.

Abb. 1: Schematische Darstellung des Herstellungsprozesses von PLA und PANI/PLA-Komposit-Nanofasern

PANI/PLA-Komposit-Nanofasern wurden unter Eisbadbedingungen hergestellt. APS und AN wurden in 1 M Säurelösung im Molverhältnis 1:1 zugesetzt. Am Beispiel HCl: Unter Eisbad wurde AN (930 mg, 0,01 mol) tropfenweise zu APS (2280 mg, 0,01 mol) in 50 ml 1 M HCl gegeben. Sofort wurde die plasmagebehandelte PLA-Nanofasermembran in die Lösung getaucht und 2 h bei 0 °C gerührt. Nach der Reaktion wurde die Membran mehrmals mit HCl und Ethanol gereinigt, um unbehaftetes PANI zu entfernen, und über Nacht bei 40 °C getrocknet, um PANI/PLA-HA-Nanofasern zu erhalten. PANI/PLA-SA und PANI/PLA-PA wurden analog hergestellt.

Charakterisierung

Einachsige Zugversuche für PLA-Nanofasern und PANI/PLA-Komposit-Nanofasern wurden mittels Spannungs-Dehnungs-Test (Shimadzu AGX-PLUS, Japan) durchgeführt. Proben wurden in Hantelform geschnitten, Zuggeschwindigkeit konstant 3 mm/min. Youngscher Modul wurde aus dem linearen 0-15 % Dehnungsbereich der Spannungs-Dehnungs-Kurve berechnet; Zugfestigkeit und Bruchdehnung aus dem Bruch der Nanofasermembran.

Morphologie der Nanofasergewebe wurde mittels Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie (FE-SEM, Hitachi-SU8220, Japan) charakterisiert, um unterschiedliche Morphologien des mit verschiedenen anorganischen Säuren dotierten PANI zu beobachten. Vor SEM-Beobachtung wurden Proben 60 s mit Gold besprüht. Oberflächenrauheit der PANI/PLA-Komposit-Nanofasern wurde mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM, Bruker Dimension Edge) gemessen. Zur Bestätigung der vollständigen PANI-Aufladung auf PLA-Nanofasern wurde Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR, Thermo Nicolet iS50) im Bereich 2000-500 cm⁻¹ eingesetzt. Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS, Thermo ESCALAB 250) mit Al-Kα-Röntgenquelle bestimmte die Oberflächenzusammensetzung. Benetzbarkeit wurde über Kontaktwinkel von Wassertropfen bei Raumtemperatur (OCA 15 plus, Deutschland) gemessen. Der Abbau der Nanofasern wurde mittels Massenverlustmethode evaluiert. Nanofasermembranen wurden in 16-mm-Scheiben geschnitten, in 20 ml Phosphatpufferlösung (PBS, pH 7,4) gelegt und bei 37 °C für 7, 14 und 21 Tage inkubiert, dann auf Konstantgewicht getrocknet.

Biokompatibilität von PANI/PLA-Komposit-Nanofasergeweben

Biokompatibilität

Die Biokompatibilität wurde durch Human-Osteosarkom (HOS) Zellaktivitätsexperimente charakterisiert. HOS-Zellen stammen von der Zellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, Shanghai. Zellen wurden in niedrig-glukose DMEM mit 10 % fetalem Rinderserum, 100 U/ml Penicillin, 100 U/ml Streptomycin bei 37 °C und 5 % CO₂ kultiviert. Bei 90 % Konfluenz wurden Zellen im Verhältnis 1:3 passagiert.

Vor dem Zellproliferationstest wurden HOS-Zellen auf PANI/PLA-Nanofasern ausgesät. Nanofasern wurden in 96-Well-Platten so platziert, dass sie den Boden vollständig bedeckten, 30 min UV-sterilisiert, 30 min mit 75 % Ethanol behandelt, dann mit PBS gewaschen. Zellen wurden mit 1 × 10⁴ Zellen/Well inkuliert, parallel Blind- und Kontrollgruppe. Inkubation bei 37 °C für 1, 3 und 5 Tage, Medium alle 2 Tage erneuert.

Zelllebensfähigkeit wurde mittels MTT-Test (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromid) evaluiert. Nach Inkubation 1, 3, 5 Tage wurde Medium entfernt, 3× mit PBS gewaschen, 1 ml DMEM mit 10 % 5 mg/ml MTT zugesetzt, 4 h bei 37 °C inkubiert, Medium entfernt, DMSO zur Lösung des Formazans zugesetzt, 10 min vibriert, Absorption gemessen (BioTek Synergy HTX, USA).

Fluoreszenz-Immunfärbung

HOS-Zellen wurden 24 h in PANI/PLA-Nanofaser-Inkubator inkubiert, 3× mit PBS gewaschen, 10 min bei RT mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, 3× gewaschen (je 10 min), 10 μl 100 nM FITC-markiertes Peptid zugegeben, 30 min bei RT inkubiert, 3× gewaschen (je 5 min). Extrazelluläres Aktin der HOS-Zellen wurde gefärbt, Konfokalmikroskopie (Typ A1, Nikon, Japan) bei 20-facher Vergrößerung zur Beobachtung genutzt.

Zelladhäsion

Adhäsion der HOS-Zellen auf PANI/PLA-Komposit-Nanofasergeweben wurde via SEM beobachtet. Nach 24-h-Kultur Medium entfernt, 3× PBS gewaschen, 4 % PFA zugegeben, über Nacht bei 4 °C fixiert, 3× PBS gewaschen, Dehydrierung mit Ethanol-Gradienten (30 %, 50 %, 70 %, 85 %, 90 %, 100 %; je 20 min), 24 h gefriergetrocknet. Vor SEM-Beobachtung 120 s mit Platin besprüht.

Alkalische Phosphatase-Aktivität (ALP)

ALP ist ein gängiger früher Osteoblasten-Differenzierungsmarker, abhängig von alkalischer Phosphatase-Enzym-Expression. ALP-Aktivität wurde mit ALP Assay Kit (Beyotime Biotechnology, P0321S) durchgeführt. HOS-Zellen wurden 7 Tage auf verschiedenen PANI/PLA-Komposit-Gerüsten kultiviert. Zellen wurden mit 50 μl Tris-HCl (0,1 M, pH 8) mit 0,1 % (v/v) Triton X-100 lysiert. ALP-Aktivität wird durch Quantifizierung der p-Nitrophenol-Konzentration aus p-Nitrophenylphosphat (PNPP) analysiert, geschätzt durch Absorption bei 405 nm. Prozentuale ALP-Aktivität der Zellen auf PANI/PLA-Nanofasern wird durch Vergleich mit Zellen auf reinen PLA-Nanofasern berechnet.

Statistische Analyse

Statistische Signifikanz wurde via Einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) mit GraphPad Prism (Version 8.02) bewertet. Unterschiede in mechanischen Eigenschaften, in-vitro-Bioabbaubarkeit und Zelllebensfähigkeit zwischen verschiedenen PANI/PLA-Komposit-Nanofasergeweben wurden analysiert. Ergebnisse galten als signifikant bei p < 0,05 (*) und sehr signifikant bei p < 0,005 (**).

Ergebnisse und Diskussion

Mechanische Eigenschaften von Gewebe-Engineering-Gerüsten sind wichtige Indikatoren zur Beurteilung, ob Gerüste Fluiddynamik standhalten können. Die Anwesenheit anorganischer Säuren kann physikalisch-chemische Eigenschaften der PLA-Matrix von PANI/PLA-Komposit-Nanofasern im in-situ chemischen Oxidationspolymerisationsprozess von PANI beeinflussen. Daher ist die Untersuchung mechanischer Eigenschaften von PANI/PLA-Komposit-Nanofasern mit anorganischen Säuren notwendig. Hier wurden mechanische Eigenschaften via Zugversuch evaluiert (Abb. 2), einschließlich Spannungs-Dehnung, Youngscher Modul, Zugfestigkeit und Bruchdehnung. Wie in Abb. 2a gezeigt, zeigten PLA-Nanofasern linearelastisches Verhalten, PANI/PLA-HA und PANI/PLA-SA klare Fließverhalten, während PANI/PLA-PA unmittelbar nach elastischer Deformation brach. Der Youngsche Modul (Abb. 2b) der PANI/PLA-Komposit-Nanofasern war höher als der der PLA-Nanofasern. Im Vergleich zu PLA stieg der Elastizitätsmodul von PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA, PANI/PLA-PA um 53,5 ± 9,09, 60,00 ± 9,47 und 28,43 ± 8,34 MPa. Hinsichtlich Zugfestigkeit (Abb. 2c) und Bruchdehnung (Abb. 2d) nahmen diese bei PANI/PLA-HA und PANI/PLA-PA ab, bei PANI/PLA-SA stiegen sie leicht an; PANI/PLA-PA zeigte die niedrigsten Werte. Im Vergleich zu PLA nahm die Zugfestigkeit von PANI/PLA-HA und PANI/PLA-PA um 0,15 ± 0,01 bzw. 0,64 ± 0,03 MPa ab, während PANI/PLA-SA um 0,13 ± 0,05 MPa zunahm. Die Bruchdehnung von PANI/PLA-HA und PANI/PLA-PA nahm um 16,93 ± 1,38 % bzw. 35,42 ± 3,94 % ab, während PANI/PLA-SA um 3,32 ± 0,13 % zunahm.

Abb. 2: Mechanische Eigenschaften von PLA-Nanofasern und PANI/PLA-Komposit-Nanofasern. a Repräsentative Spannungs-Dehnungs-Kurven, b Youngscher Modul, c Zugfestigkeit bei Bruch, d Bruchdehnung

Wie in Abb. 2 gezeigt, können die gewählten anorganischen Säuren den Elastizitätsmodul von PLA-Nanofasern durch die PANI-Beschichtung erhöhen. Hinsichtlich Zugfestigkeit und Bruchdehnung variierten die mechanischen Eigenschaften von PANI/PLA-HA und PANI/PLA-SA in unterschiedlichem Maße, während PANI/PLA-PA am deutlichsten abnahm und bereits nach < 5 s unter Belastung brach. Dies könnte auf die Oxidation von HClO₄ zurückzuführen sein, die Esterbinde in der PLA-Molekülkette spaltet und Carboxylgruppen oxidativ zersetzt, was zu inferioren mechanischen Eigenschaften führt. Die unterschiedlichen mechanischen Eigenschaften von PANI/PLA-HA und PANI/PLA-SA könnten mit der unterschiedlichen Dichte des durch HCl und H₂SO₄ dotierten PANI zusammenhängen, während die Einführung von APS im Reaktionsprozess auch leicht die PLA-Nanofasern beeinflusst haben könnte; der umfassende Effekt dieser Faktoren zeigt unterschiedliche mechanische Eigenschaften.

Zelladhäsion, Proliferation und Differenzierung werden durch Morphologie beeinflusst; eine raue Oberfläche gilt allgemein als förderlich für Zelladhäsion. Die Hydrophobie von PLA-Nanofasern impliziert, dass die uniforme Polymerisation von PANI eine Barriere darstellt, während die Plasmatherapie der PLA-Nanofasern die Benetzbarkeit signifikant verbessert. Nach PANI-basierter in situ Polymerisation mit verschiedenen anorganischen Säuredotierern wurden PANI/PLA-Komposit-Nanofasern mit uniformer Oberflächenabscheidung erhalten.

Die PANI-Morphologie auf der Oberfläche der verschiedenen PANI/PLA-Fasern wurde via FE-SEM beobachtet (Abb. 3). Die Abbildung zeigt deutlich, dass die PLA-Nanofaseroberfläche von vielen unregelmäßigen Nanopartikeln bedeckt war und die PANI/PLA-Komposit-Nanofasern mit anorganischen Säuren gute Fasermorphologie und poröse Nanofaserstruktur beibehielten. Die Morphologiebeobachtungen bestätigten, dass PANI/PLA-Komposit-Nanofasern erfolgreich mit PANI beladen wurden, was Basis für Zelladhäsion und -proliferation bot. Mittels AFM wurde die Oberflächenrauheit gemessen (Abb. 4). Ra, der Mittelwert der Oberflächenrauheit an drei verschiedenen Positionen jeder Probe, wird allgemein zur Bewertung der Oberflächenrauheit verwendet. Die Ra der PANI/PLA-Komposit-Nanofasern war größer als die der PLA-Nanofasern, wobei PANI/PLA-PA die höchste Ra aufwies. Diese Zunahme der Oberflächenrauheit vergrößerte die Oberfläche und Polarität, was potenziell mehr Wachstumsstellen für Zellen bietet und Zelladhäsion fördert.

Abb. 3: Morphologie von a PLA-Nanofasern, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA und d PANI/PLA-PA Komposit-Nanofasern

Abb. 4: AFM-Bild und Oberflächenrauheit (Ra) von a PLA-Nanofasern, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA und d PANI/PLA-PA Komposit-Nanofasern

Zelladhäsion, Migration und Proliferation werden signifikant durch Benetzbarkeit der Gerüste beeinflusst. Allgemein wird Benetzbarkeit über Kontaktwinkel zwischen Gerüst und Wasser bewertet. Da PLA hydrophob ist, wurde der Kontaktwinkel von Wassertropfen auf der Nanofasermembran innerhalb von 1 s gemessen (Abb. 5). Die Kontaktwinkel der PANI/PLA-Nanofasern nach Behandlung nahmen signifikant ab. Die Kontaktwinkel von PLA, PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA, PANI/PLA-PA betrugen 112°, 61,6°, 36,7° und 37,2°. Die PANI-Morphologie erhöhte die Oberflächenenergie, der Kontaktbereich stieg beim ersten Wasserkontakt, was den Kontaktwinkel verringerte und die Benetzbarkeit verbesserte. Nach 5 s Kontakt mit Wasser änderte sich der Kontaktwinkel der Komposit-Nanofasern auf 0°, was gute Hydrophilie demonstriert. Dieser hydrophile Gerüst bot günstige Bedingungen für Zelladhäsion und -diffusion, da sauerstoffhaltige Funktionsgruppen (z. B. –OH, –COOH) auf der PLA-Oberfläche nach Plasmatherapie stärker an die Nanofaseroberfläche gebunden waren, und PANI-Morphologie sowie sauerstoffhaltige Gruppen gemeinsam sicherstellten, dass PANI/PLA-Komposit-Nanofasern letztendlich vollständig benetzt wurden.

Abb. 5: Kontaktwinkel von a PLA-Nanofasern, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA und d PANI/PLA-PA Komposit-Nanofasern

Die FTIR-Spektren von reinem PANI und PANI/PLA-Komposit-Nanofasern dotiert mit verschiedenen anorganischen Säuren sind in Abb. 6 dargestellt. Im reinen dotierten PANI-Spektrum (Abb. 6a) entsprechen starke charakteristische Peaks bei 1565, 1485, 1298 und 1125 cm⁻¹ der C=C-Streckung der Chinonringe sowie C=C-Streckung, C-N-Streckung und =C-H-Streckung der Benzenoidringe. Im Spektrum der PANI/PLA-Komposit-Nanofasern (Abb. 6b) sind neben PANI-Peaks auch PLA-Peaks sichtbar (C-O-Streckschwingungen bei 1092 und 1184 cm⁻¹, C=O-Streckschwingung bei 1757 cm⁻¹). Dies belegt, dass PANI erfolgreich auf der Oberfläche der mit anorganischen Säuren dotierten PANI/PLA-Nanofasern aufgeladen wurde. Zur weiteren Untersuchung der chemischen Zusammensetzung wurde XPS zur Analyse der Oberflächenzusammensetzung eingesetzt. In den XPS-Spektren (Abb. 7a) waren klare N1s-Peaks bei ~400 eV in PANI/PLA-Komposit-Nanofasern sichtbar. Cl2p-Peaks bei ~200 eV in PANI/PLA-HA und PANI/PLA-PA, wobei die Peakintensität von Cl2p bei PANI/PLA-PA höher war. Ein S2p-Peak erschien bei ~210 eV in PANI/PLA-SA. XPS zeigte, dass Cl⁻, SO₄²⁻ und ClO₄⁻ auf die entsprechenden PANI/PLA-Nanofasern dotiert waren. Zudem waren die Imin-Stickstoffatome von PANI vollständig oder teilweise oxidiert, was eine Reihe von Oxidationszuständen mit unterschiedlichen Protonierungsgraden erzeugte. Änderungen in Oxidationszustand und Protonierungsgrad wurden über N1s-Kernspektren (Abb. 7b-d) gemessen. Jedes N1s-Spektrum ließ sich in vier Hauptkomponenten mit Bindungsenergien ~398,7, 399,6, 400,4 und 401,8 eV dekonvolutieren, zugeordnet zu Chinon-Imin (–N=), Benzenoid-Amin (–NH–), protoniertem Amin (–N⁺) und protoniertem Imin (=N⁺). Nach Kumars Studie wurde der Fitting-Peak des N1s-Spektrums durch die Ladung der an protonierte N-Atome gebundenen Anionen beeinflusst, was Delokalisierung und leichte Verschiebung verursachte.

Abb. 6: FTIR-Spektren von a PANI, b PLA und PANI/PLA-Komposit-Nanofasern

Abb. 7: XPS-Spektren (a) der hergestellten PANI/PLA-Komposit-Nanofasergewebe und N1s-Kernspektren von PANI/PLA-HA (b), PANI/PLA-SA (c), PANI/PLA-PA (d)

Als Template für Gewebereparatur und -regeneration werden bioaktive Gerüste nach induzierter Zell- und Gewebereparatur abgebaut und ausgeschieden. In dieser Arbeit wurden Abbaueigenschaften der Nanofasergewebe mittels Massenverlustmethode evaluiert (Abb. 8). Der Massenverlust aller Proben nahm an Tag 7, 14 und 21 zu. Massenverlustraten der PLA-Nanofasern betrugen 4,34 ± 0,41 %, 7,84 ± 1,57 %, 12,65 ± 0,83 %. PANI/PLA-PA-Komposit-Nanofasern zeigten nach in situ oxidativer Polymerisation allmählich steigenden Massenverlust mit Raten von 31 ± 2,15 %, 34 ± 1,86 %, 40 ± 2,54 % an Tag 7, 14, 21 – signifikant höher als PANI/PLA-HA und PANI/PLA-SA. Im PANI-in-situ-oxidativen Polymerisationsprozess könnte das Oxidationsmittel APS die Esterbinde in PLA zerstört und Hydrolyse induziert haben, was Mikrorisse in PLA-Nanofasern verursachte. Mit längerer PBS-Eintauchzeit akkumulierten sich Mikrorisse, die PLA-Matrix begann abzubauen. Oberflächenbeladenes PANI fiel ab, was zu Qualitätsverlust der Nanofasern führte. Mit Zeit wurde das Massenverlustverhältnis deutlicher. Die starke Oxidation von HClO₄ verschlimmerte den PLA-Abbau und beschleunigte den Massenverlust der PANI/PLA-PA-Nanofasern, konsistent mit den mechanischen Eigenschaften in Abb. 2.

Abb. 8: Abbaueigenschaften von PLA und PANI/PLA-Nanofasern

Die Biokompatibilität bioaktiver Gerüste ist Grundlage für Förderung von Zelladhäsion, Wachstum und Proliferation. Hier untersuchten wir Zellproliferation von HOS auf PLA und PANI/PLA-Komposit-Nanofasern zur Illustration von Adhäsion und Biokompatibilität. Während chemischer Behandlung und Funktionalisierung können diverse Einflussfaktoren bei der Herstellung bioaktiver Gerüste eine Rolle spielen. Daher ist die Untersuchung ihrer Biokompatibilität entscheidend für die Bewertung praktischer Anwendung.

Zur Untersuchung der Biokompatibilität von PANI/PLA-Komposit-Nanofasern wurde Zelllebensfähigkeit mittels MTT-Methode evaluiert. Abb. 9 zeigt Zellaktivität nach 1, 3, 5 Tagen Inkubation auf PLA und PANI/PLA-Komposit-Nanofasern. Mit verlängerter Inkubationszeit stieg die Zellaktivität allmählich an; PANI/PLA-PA-Zellen zeigten die beste Aktivität, die nach 5-tägiger Kultur am höchsten war.

Abb. 9: Zelllebensfähigkeit von HOS nach 1, 3, 5 Tagen Kultur auf PLA-Nanofasern und PANI/PLA-Komposit-Nanofasern (*p < 0,05; **p < 0,005)

PLA ist bioabbaubar, aber hydrophob, was Zelladhäsion, Wachstum und Proliferation nicht begünstigt. Nach Plasmatherapie war die Oberfläche der PANI/PLA-Komposit-Nanofasern mit sauerstoffhaltigen Gruppen beladen, und die funktionale Oberfläche zeigte gute Hydrophilie. Die Morphologie- und AFM-Ergebnisse zeigen, dass PANI, dotiert mit verschiedenen anorganischen Säuren, unterschiedliche Morphologien und Rauheitsgrade auf der PLA-Nanofaseroberfläche aufwies. Gleichzeitig wiesen PANI/PLA-Komposit-Nanofasern exzellente Benetzbarkeit auf. Daher vermuteten wir, dass die unterschiedlichen Morphologien von PANI, dotiert mit anorganischen Säuren, zu einer Erhöhung der Oberflächenenergie und Polarität der PANI/PLA-Komposit-Nanofasern führten, was folglich Zellwachstum, Migration und Proliferation beeinflusste und zu verbesserter Zellaktivität führte.

Zur weiteren Untersuchung des Zellverhaltens an PANI/PLA-Komposit-Nanofasern wurden Wachstum und Adhäsion via Fluoreszenz-Immunfärbung (Abb. 10) und SEM (Abb. 11) beobachtet. Hierbei verglichen wir Aktin und Zellmorphologie auf verschiedenen Nanofasern. Auf PLA-Fasern und PANI/PLA-Nanofasern zeigten Aktinbündel guten Streckungszustand. Zelldichte der PANI/PLA-Komposit-Nanofasern war höher als bei PLA-Nanofasern der Kontrollgruppe, mit der Reihenfolge PANI/PLA-PA > PANI/PLA-SA > PANI/PLA-HA. HOS-Zellen wuchsen auf PANI/PLA-Nanofasern und hefteten sich in flacher multipolaren Form an. Deutlich waren viele Zellen in die Poren der PANI/PLA-Fasern eingebettet, waren auf PLA-Nanofasern jedoch schlecht gestreckt und konnten sich nicht vollständig ausdehnen. Dies zeigt, dass PANI/PLA-Komposit-Nanofasern Adhäsion und Proliferation von HOS-Zellen fördern können.

Abb. 10: Fluoreszenzmikroskopische Bilder auf a PLA-Nanofasern, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, d PANI/PLA-PA Komposit-Nanofasern nach 24 h Inkubation

Abb. 11: SEM-Mikrographien von HOS auf a PLA-Nanofasern, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, d PANI/PLA-PA Komposit-Nanofasern nach 24 h

Zell-Immunfluoreszenzfärbung und Zelladhäsionsergebnisse zeigten, dass unterschiedliche PANI-Morphologien auf der Oberfläche der PANI/PLA-Komposit-Nanofasern Wachstum, Adhäsion und Proliferation der HOS-Zellen beeinflussten, konsistent mit den obigen Ergebnissen.

Als früher osteogener Marker wurde ALP-Test an PLA und PANI/PLA-Komposit-Nanofasergeweben für 7 Tage durchgeführt. Im Vergleich zu reinen PLA-Nanofasern zeigte das Ergebnis (Abb. 12), dass ALP-Aktivität in PANI/PLA-Komposit-Nanofasern signifikant verbessert war. Offensichtlich war die ALP-Aktivität von PANI/PLA-PA-Komposit-Nanofasern am besten. Dies bewies, dass PANI/PLA-Komposit-Nanofasern bessere Biokompatibilität aufwiesen, konsistent mit den obigen Ergebnissen zu Zelladhäsion, Wachstum und Proliferation.

Abb. 12: Alkalische Phosphatase-Aktivität auf PANI/PLA-Komposit-Nanofasergeweben (ns = keine Signifikanz)

Fazit

In dieser Arbeit wurden PANI/PLA-Komposit-Nanofasern mit unterschiedlichen Oberflächenmorphologien durch drei Arten anorganischer Säuren als Dotiermittel in der in situ Polymerisation hergestellt. Wir bestätigten, dass PANI erfolgreich auf der Oberfläche von PLA aufgeladen werden konnte, ohne die poröse Struktur der Nanofasern zu verändern. Mechanische Eigenschaften und In-vitro-Abbauversuche zeigten, dass oxidierende Säuren die mechanischen Eigenschaften signifikant schwächen und den Abbau von Polyester-Nanofasern beschleunigen können. Gleichzeitig führte raue Oberfläche zu besserer Benetzbarkeit und förderte Zelladhäsion, Wachstum und Proliferation, was auf bessere Biokompatibilität hindeutete. Zusammenfassend hat die regulierte PANI-Morphologie durch unterschiedliche Säuredotierung positiven Einfluss auf die Biokompatibilität im Gewebe-Engineering.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die Autoren erklären, dass Materialien und Daten Lesern ohne unangemessene Qualifikationen für Materialtransfervereinbarungen umgehend zur Verfügung stehen. Alle im Rahmen dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem Artikel enthalten.

Abkürzungen

PANI:

Polyanilin

PLA:

Polymilchsäure

ECM:

Extrazelluläre Matrix

PPy:

Polypyrrol

PTH:

Polythiophen

AN:

Anilin

DCM:

Dichlormethan

DMF:

N,N-Dimethylformamid

APS:

Ammoniumpersulfat

HOS:

Human-Osteosarkom-Zellen

DMEM:

Dulbecco's Modified Eagle Medium

PBS:

Phosphatpufferlösung

MTT:

3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromid

FITC:

Fluorescein-Isothiocyanat

FTIR:

Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie

FE-SEM:

Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie

XPS:

Röntgenphotoelektronenspektroskopie

ALP:

Alkalische Phosphatase