Doxorubicin-beladene PEG-CdTe-Quantenpunkte als intelligentes Drug Delivery System für die extramedulläre Behandlung des multiplen Myeloms

Einführung

Das Multiple Myelom (MM), der zweitgrößte hämatologische Tumor nach dem Lymphom [1], ist eine bösartige Neubildung von Plasmazellen, die sich im Knochenmark angesammelt haben und zu Knochenzerstörung und Knochenmarkversagen führen. Die Lebenserwartung von Myelompatienten wurde in den letzten 10–20 Jahren dank der Entwicklung wirksamerer Chemotherapeutika und Therapien mit hoher Antitumoraktivität deutlich verlängert [2, 3]. Extramedulläres multiples Myelom (EMM), definiert als das Vorhandensein von Plasmazellen außerhalb des Knochenmarks von Patienten mit multiplem Myelom, kann im gesamten Krankheitsverlauf bis zu 30% des multiplen Myeloms ausmachen [4]. Neben der schlechten Prognose beträgt das mediane Gesamtüberleben von EMM-Patienten mit extramedullärem Rezidiv < 6 Monate [4]. Bezüglich der Anwendung neuartiger Wirkstoffe soll keiner von 11 EMM-Patienten auf Thalidomid als Monotherapie angesprochen haben, während 16 von 27 Patienten ohne extramedulläre Beteiligung ansprachen [5]. Darüber hinaus verbessert auch eine Behandlung mit neuen Medikamenten wie Bortezomib das Überleben von EMM-Patienten nicht [6]. Einige Studien zeigen jedoch, dass eine hochdosierte Chemotherapie die Prognose von EMM-Patienten verbessern kann [7, 8]. Die von den Patienten schlecht vertragene hohe Dosierung des Chemotherapeutikums führt jedoch zu erheblichen Nebenwirkungen in normalen Geweben und Organen.

Doxorubicin (DOX) ist eines der wirksamsten Chemotherapeutika zur Behandlung des multiplen Myeloms [6, 9]. Seine hochdosierten klinischen Anwendungen bei älteren Menschen oder EMM-Patienten sind jedoch durch seine Toxizität und Nebenwirkungen, hauptsächlich einschließlich Kardiotoxizität und Knochenmarksuppression, stark eingeschränkt. Darüber hinaus wird das Myelom am häufigsten bei Menschen im Alter von 65 bis 74 Jahren diagnostiziert, mit einem Median von 69 Jahren [9]. Tatsächlich ist die Chemotherapie immer noch die Hauptbehandlung des multiplen Myeloms, aber Chemotherapeutika verursachen oft irreversible Schäden an normalen Geweben oder Organen, während sie Tumorzellen abtöten und die Immunkapazität des Körpers verringern. Daher kann eine herkömmliche Chemotherapie nicht den gewünschten Effekt erzielen. Die Minimierung der Nebenwirkungen der Chemotherapie ist immer noch eine Herausforderung. Statistiken zeigen, dass die durchschnittliche jährliche Rate neuer Myelome in den letzten zehn Jahren um 0,8% zugenommen hat [9]. Inzwischen gibt es keinen Standardbehandlungsplan für EMM-Patienten. Daher werden dringend neue Behandlungsmethoden für EMM-Patienten benötigt.

Um die Grenzen konventioneller chemotherapeutischer Behandlungen zu überwinden, haben Forscher hauptsächlich liposomale Carfilzomib-Nanopartikel verwendet, die effektiv auf multiple Myelomzellen abzielen könnten [10]. DOX-beladene Thrombozyten können die therapeutische Wirksamkeit bei Lymphomen verstärken [11]. Nanopartikel (z. B. Cadmiumtellurid-Quantenpunkte oder CdTe-QDs) können pH-gesteuert die Zirkulationszeit und Wirkstofffreisetzung verlängern, die Wirksamkeit verbessern und die Arzneimitteltoxizität reduzieren [12,13,14,15,16]. Polyethylenglycol (PEG), das sich durch Hydrophilie, hohe Biokompatibilität, Sicherheit, Ungiftigkeit und geringe Immunogenität auszeichnet, kann mit CdTe-QDs (PEG-CdTe-QDs) konjugiert werden, um einen „immunvernachlässigten“ Effekt zu induzieren, der Plasma reduziert oder sogar vermeidet Opsonisierung und Absorption durch das retikuloendotheliale System [14]. Diese Eigenschaft trägt zur Verlängerung der Blutzirkulationszeit von PEG bei, indem die Adsorption von Plasmaproteinen an diesen Partikeln minimiert oder eliminiert wird [17]. PEG-CdTe-QDs werden durch die Flüssigphasen-Endocytose und die Lipid-Doppelschicht-Affinität auf der Plasmamembranoberfläche effizient von Zellen internalisiert [18]. Als Vehikel für Arzneimittel-Nanopartikel können mit Arzneimitteln beladene CdTe-QDs Arzneimittel in einem pH-kontrollierten und pH-getriggerten Muster freisetzen, und diese Nanopartikel-Komplexe können Arzneimittel bei einem niedrigen pH freisetzen, der der Tumormikroumgebung ähnlich ist [13].

In dieser Studie wurde ein Nanopartikel-Drug-Delivery-System (PEG-CdTe-DOX) synthetisiert, um die chemotherapeutische Wirksamkeit zu verbessern. Dieses System erleichterte die bevorzugte Abgabe von DOX in PRMI 8226-Zellen. Die schematische Karte der Systemsynthese und -funktion ist in Abb. 1 dargestellt. Das Arzneimittelabgabesystem wurde charakterisiert und seine Antitumorwirkung und systematische Toxizität wurden in vitro getestet. Diese Studie könnte neue Ideen für die EMM-Behandlung liefern.

Schematische Darstellung eines möglichen Mechanismus einer verbesserten Antitumoraktivität von PEG-CdTe-DOX in vitro. Hinweise:Durch die hohe Gewebekompatibilität von PEG können sie beim Targeting von Tumorzellen internalisiert werden. DOX induziert die Apoptose von Tumorzellen, indem es die Expression von Apoptose-assoziierten Genen reguliert

Materialien und Methoden

Materialien

PEG-CdTe QDs und Pierce TM Bicinchoninsäure (BCA) Proteinassaykit wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) bezogen. DOX wurde von Dalian Meilun Biology Technology Co. (Dalian, Volksrepublik China) bezogen. PRMI-1640 wurde von Gibco Chemical Co. (Carlsbad, CA, USA) bezogen. Fötales Rinderserum (FBS) wurde von Wisent Inc. (Montreal, Kanada) bezogen. Annexin V-Fluoresceinisothiocyanat (FITC) Apoptose-Nachweiskit und Zellzählungskit-8 (CCK-8) Assay wurden von Beyotime Biotechnology Co., Ltd. (Nantong, Volksrepublik China) bezogen, und monoklonale Antikörper gegen Bax, Caspase- 3, Bcl2, β-Aktin wurden von Cell Signaling Technology, plc erhalten. (Boston, USA). Ein Transmissionselektronenmikroskop (TEM) wurde von einem Japan Electron Optics Laboratory, Ltd. (Tokyo, HT700, Japan) akzeptiert. Die hydrodynamischen Durchmesser und die Größenverteilung von PEG-CdTe und PEG-CdTe-DOX wurden mit dem Zetasizer Sizer NanoZs Size Analyzer (Malvern, Zetasizer Ultra, UK) gemessen. Die Konzentration von DOX wurde durch HPLC (Jasco, LC-2000, Japan) nachgewiesen. Die DOX-Zufuhr wurde durch ein konfokales Laserscanning-Mikroskop (Nikon, C 2, Japan) festgestellt. Apoptose und Fluoreszenzintensität von PRMI 8226-Zellen mittels Durchflusszytometer (BD, Biosciences Accuri C6, USA). Protein-Blots wurden mit dem ECL-Nachweissystem (Tanon, 5200 Multi, China) nachgewiesen.

Vorbereitung von PEG-CdTe-DOX

DOX wurde über elektrostatische Wechselwirkung effizient auf PEG-CdTe-QDs absorbiert. Kurz gesagt, 100 μl PEG-CdTe (1 mg/ml) und 100 μl DOX (1 mg/ml) wurden in 800 μl destilliertem Wasser unter Rühren mit 100 U/min für 24 h bei 37 °C im Dunkeln gemischt. PEG-CdTe-DOX wurde gesammelt und für 30 Minuten (4 °C, 30.000 U/min) zentrifugiert. PEG-CdTe-DOX wurde gemischt und zweimal wie oben erwähnt zentrifugiert. Die nicht umgesetzten DOX wurden durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) getestet [19]. Verkapselungseffizienz (EE) und Wirkstoffbeladung (DL) wurden wie folgt berechnet:

Die Morphologie von PEG-CdTe-QDs wurde durch TEM charakterisiert. Die hydrodynamischen Durchmesser von PEG-CdTe und PEG-CdTe-DOX wurden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) in der PBS gemessen. Kurz gesagt, 20 ml PEG-CdTe-DOX (DOX, 1 mg/ml) wurden in Dialysebeutel überführt (Molekulargewichtsgrenzwert 3500 Da), die dann in 180 ml PBS bei pH 5.0, 6.0,7.4 oder eingetaucht wurden 8.0, unter ständigem Drehen (bei 100 U/min) bei 37 °C. Dann wurden alle 2 h 0,1 ml PBS gesammelt und durch ein äquivalentes Volumen an PBS ersetzt. Die DOX-Konzentration wurde durch Spektrophotometrie bei 450 nm quantifiziert und die kumulative Freisetzung von DOX aus dem PEG-CdTe wurde entsprechend dem Freisetzungsverhältnis über die Zeit aufgetragen.

Konfokale Fluoreszenzmikroskopie

Der Eintritt von DOX in PRMI 8226-Zellen (multiple Myelomlinie) wurde visuell unter konfokaler Mikroskopie bestätigt. Die PRMI 8226-Zellen wurden 4 h lang mit PEG-CdTe, DOX oder PEG-CdTe-DOX behandelt. Dann wurden die PRMI 8226-Zellen gesammelt, zentrifugiert und in 70 μl PBS suspendiert. Dann wurden die Zellen auf Glasobjektträger übertragen. Nach 10 min 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) wurden konfokale Fluoreszenzbilder mit einem konfokalen inversen Mikroskop aufgenommen. Die Emissionswellenlänge von DAPI und DOX betrug 450 bzw. 585 nm.

Zellkultur

Die Zelllinien PRMI 8226 (multiple Myelomzellen) und 293 t (humane embryonale Nierenzellen) wurden vom Shanghai Institute of Cells (Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) erworben. PRMI 8226-Zellen wurden in einem Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640-Medium, ergänzt mit 10 % FBS, kultiviert, 293 t Zellen wurden in einem Dulbecco-modifizierten Eagle-Medium (DMEM)-Medium, ergänzt mit 10 % FBS und 100 E/ml Penicillin . kultiviert , und 100 μg/ml Streptomycin bei 37 °C in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid (CO₂ ).

Zelllebensfähigkeitstest

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch den CCK-8-Assay bewertet. Zuerst wurden PRMI 8226-Zellen in 96-Well-Platten ausgesät, die jeweils 100 μl 2 × 10 ⁴ . enthielten Zellen und behandelt mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) (die Kontrollgruppe), PEG-CdTe, DOX oder PEG-CdTe-DOX. Die DOX-Konzentration betrug 1,76 μg/ml nach Inkubation für 24, 48 oder 72 h bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2. 293 t Zellen wurden in 96-Well-Platten ausgesät, die jeweils 100 μl 8 × 10 ⁴ . enthielten Zellen und behandelt mit PEG-CdTe (0, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2, 6,4, 12,8, 25,6 oder 51,2 μg/ml) für 24 h. Dann wurde CCK-8 (10 μl) in 96-Well-Platten gegeben und weitere 3 h inkubiert. Die Zelllebensfähigkeit (%) von PRMI 8226-Zellen und 293 t wurde berechnet als (1 − OD_Behandlung /OD_Kontrolle ) × 100.

Mobilfunkaufnahme

Die zelluläre Aufnahme wurde quantitativ durch Durchflusszytometrie (FCM) gemessen, um zu bestimmen, ob die intrazelluläre DOX-Konzentration in PEG-CdTe-DOX-behandelten Zellen ansteigt (Abb. 3). Kurz gesagt, PRMI 8226-Zellen wurden mit PEG-CdTe, DOX oder PEG-CdTe-DOX in 24-Well-Platten kultiviert und 24 h inkubiert. Die Zellen wurden zentrifugiert und zweimal bei 1000 U/min für 5 Minuten gewaschen. Der Niederschlag wurde in 200 μl PBS dispergiert und durch FCM analysiert. Die Antofluoreszenz von DOX ist rot und die relative Fluoreszenzintensität (FI) wurde als FI_{behandelte Zellen} . berechnet /FI _{PEG-CdTe-Zellen} .

Zell-Apoptose-Studientest

PRMI 8226-Zellen wurden in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 3 × 10 ⁵ . ausgesät Zellen. Nach Inkubation mit PBS, PEG-CdTe, DOX oder PEG-CdTe-DOX für 24 Stunden wurden diese Zellen durch Zentrifugation bei 1000 U/min gesammelt und dreimal mit PBS gewaschen. Zellen in verschiedenen Gruppen wurden mit Annexin V-FITC (5 μl) in Bindungspuffer (100 μl) für 15 Minuten markiert, gefolgt von der Zugabe von 5 μl PI für 5 Minuten und in der Dunkelkammer. Die Zellapoptoserate wurde durch FCM gemessen.

Western Blotting

PRMI8226-Zellen wurden nach verschiedenen Behandlungen (PBS, PEG-CdTe, DOX oder PEG-CdTe-DOX) geerntet und einem Western-Blotting unterzogen. Die Gesamtproteine ​​wurden von allen Gruppen gesammelt und die Proteinkonzentration wurde durch das Braford-Verfahren bestimmt. Die Gesamtproteine ​​(40 μg) wurden durch 10 % Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS/PAGE) größenfraktioniert und auf Polyvinylidendifluoridmembranen übertragen. Dann wurde 5 % fettfreie Milch als Blockierungsmittel für 1 h bei Raumtemperatur verwendet. Western-Blotting wurde unter Verwendung monoklonaler Antikörper durchgeführt:β-Actin (interne Kontrolle), Bax, Bcl2, Caspase-3. Proteinblots wurden mit dem ECL-Nachweissystem nachgewiesen und die Proteinbande wurde mit Image J quantifiziert.

Statistische Analyse

Alle Werte wurden als Mittelwerte ± ± Standardabweichung angegeben. Unterschiede zwischen zwei Gruppen analysiert von Student’ t Prüfung. Werte von P <  0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Alle Experimente wurden mindestens dreimal wiederholt.

Ergebnisse

Charakterisierung von PEG-CdTe-DOX

PEG-CdTe und PEG-CdTe-DOX zeigten eine Kristallstruktur und dispergierten gut in PBS, wie durch TEM nachgewiesen wurde (Abb. 2a, b). Die Nanopartikelgrößenverteilungen von PEG-CdTe und PEG-CdTe-DOX wurden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) bestimmt (Abb. 2c). Die DL und EE von DOX in PEG-CdTe-DOX wurden durch HPLC bestimmt (Fig. 2e). Die DOX-Freisetzung wurde bei pH 5,0 und 6,0 ​​maximiert, da etwa 92,5% bzw. 88 % des beladenen DOX innerhalb von 24 h in das PBS freigesetzt wurden und die Freisetzungsraten bei pH 7,4 und 8,0 langsamer waren, was auf ein pH-getriggertes Freisetzungsmuster schließen lässt (Abb. 2d). Die pH-sensitive Freisetzungsfähigkeit von DOX ist wirksam, weil in der Tumormikroumgebung eine saure Umgebung gebildet wird, in der DOX schnell aus dem PEG-CdTe-DOX-Komplex freigesetzt wird. Die durchschnittlichen hydrodynamischen Durchmesser betragen 8,20 bzw. 78,31 nm; die EE und DL betragen 77,20 % ± 1,12 % bzw. 42,12 % ± 0,98 %; die Zeta-Potentiale von PEG-CdTe und PEG-CdTe-DOX betragen – 20,12 ± 2,45 bzw. – 10,50 ± 1,26 mV. Diese Ergebnisse weisen auf die günstige Beladung von PEG-CdTe mit DOX und die erfolgreiche Synthese von PEG-CdTe-DOX hin. Daher konnte eine höhere DOX-Konzentration in der Tumormikroumgebung und eine niedrigere DOX-Konzentration in normalem Gewebe erreicht werden.

Eigenschaften von PEG-CdTe und PEG-CdTe-DOX. Hinweise:a , b TEM-Bilder von PEG-CdTe und PEG-CdTe-DOX. c DLS-Analyse von PEG-CdTe und PEG-CdTe-DOX. e Das optimierte PEG-CdTe-DOX-Drug-Delivery-System synthetisiert aus verschiedenen Inkubationskonzentrationen von DOX zu PEG-CdTe. d DOX wird aus PEG-CdTe-DOX in PBS bei pH 5,0, 6,0, 7,4 oder 8,0 bei 37 °C in vitro freigesetzt. f Die Lebensfähigkeit von 293 t Zellen nach Behandlung mit unterschiedlichen Konzentrationen von PEG-CdTe

Konfokalmikroskopische Fluoreszenzbilder zeigen, dass PEG-CdTe-DOX DOX in PRMI 8226-Zellen abgeben könnte. Darüber hinaus ist die rote Fluoreszenz, die deutlich in PRMI 8226-Zellen gespeichert ist, der PEG-CdTe-DOX-Gruppe im Vergleich zu der DOX-Gruppe, was darauf hindeutet, dass PEG-CdTe die zelluläre Aufnahme von PEG-CdTe-DOX und die intrazelluläre Abgabe durch das Targeting von RPMI 8226-Zellen verstärken könnte.

Zelluläre Aufnahme und Zytotoxizität von PEG-CdTe-DOX in vitro

Um zu bestimmen, ob PEG-CdTe-DOX ausschließlich die DOX-Akkumulation in PRMI 8226-Zellen erleichtern kann, haben wir die DOX-Akkumulation durch Durchflusszytometrie (FCM) der intrazellulären Fluoreszenzintensität gemessen. Die intrazelluläre DOX-Konzentration in PRMI8226-Zellen war in der PEG-CdTe-DOX-Gruppe im Vergleich zur DOX-Gruppe signifikant erhöht (P < 0,01, Abb. 4). Die Zytotoxizität von PEG-CdTe-DOX gegenüber PRMI 8226-Zellen hängt positiv mit der Inkubationszeit zusammen, die ebenfalls länger ist als in der DOX-Gruppe (72 h, Abb. 4). Die Lebensfähigkeit der Zellen nach Inkubation für 24, 48 und 72 h wurde mit dem Zellzählkit-8 (CCK-8) untersucht, und die entsprechenden Hemmungsraten von PEG-CdTe-DOX betrugen 58 %, 70 % bzw. 85 %. . Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Lebensfähigkeit der PRMI8226-Zellen in der PEG-CdTe-DOX-Gruppe im Vergleich zur DOX-Gruppe signifikant abgenommen hat (P < 0,05). Darüber hinaus wurde kein signifikanter Unterschied in der Zelllebensfähigkeit zwischen der Kontrollgruppe und der PEG-CdTe-Gruppe beobachtet. Es gibt keinen signifikanten Unterschied in der Zelllebensfähigkeit von 397 t-Zellen mit PBS und PEG-CdTe (die Konzentration von PEG-CdTe ist die gleiche wie im RPMI 8226-Experiment). Diese Ergebnisse stimmen mit den intrazellulären DOX-Konzentrationen überein (Abb. 3 und 4) und weisen darauf hin, dass PEG-CdTe die gezielte Abgabe unterstützt, ohne die therapeutischen Wirkungen zu beeinträchtigen. Somit verstärkte sich die Apoptose von PRMI 8226-Zellen bemerkenswert, was darauf hindeutet, dass PEG-CdTe-DOX als Wirkstoffabgabesystem verwendet werden könnte.

Fluoreszenzmikroskopische Bilder von PRMI 8226-Zellen nach Erhalt von PEG-CdTe, DOX oder PEG-CdTe-DOX. Hinweise:a , d PEG-CdTe; b , e DOX; c , f PEG-CdTe-DOX. Die rote Fluoreszenz zeigt PEG-CdTe-DOX durch Pfeile an (Skalenbalken:50 μm, × 400; Emissionswellenlängen von DAPI und DOX waren 450 bzw. 585 nm)

Mittlere Fluoreszenzintensität in PRMI8226 durch Durchflusszytometrie und Wachstumshemmung von PRMI8266-Zellen mit verschiedenen Behandlungen. Hinweise:a PEG-CdTe; b DOX; c PEG-CdTe-DOX; d die Fluoreszenzintensität von DOX und PEG-CdTe-DOX im Vergleich zu PEG-CdTe (**P < 0,01). e CCK-8-Analyse von PRMI 8226-Zellen, die mit PBS (Kontrolle), PEG-CdTe, DOX und PEG-CdTe-DOX nach 24, 48 und 72 h behandelt wurden (*P < 0.05)

Apoptose von PRMI8226-Zellen

Die durch FCM gemessenen Gesamtapoptoseraten von PRMI8226-Zellen betrugen 4,78 %, 6,95 %, 34,07 % und 66,5 % in den Kontroll-, PEG-CdTe-, DOX- bzw. PEG-CdTe-DOX-Gruppen (Abb. 5). Die Apoptoserate in der PEG-CdTe-DOX-Gruppe stieg im Vergleich zur DOX-Gruppe signifikant an (P < 0,01). Allerdings unterschieden sich die Apoptoseraten zwischen der Kontrollgruppe und der PEG-CdTe-Gruppe nicht signifikant, was darauf hindeutet, dass PEG-CdTe sicher war und die Wirksamkeit von DOX bemerkenswert erhöhen könnte.

Apoptoseraten von PRMI 8226-Zellen mit verschiedenen Behandlungen. Hinweise:a PBS; b PEG-CdTe; c DOX; d PEG-CdTe-DOX. e Vergleichende Apoptoseraten von PRMI8226-Zellen in verschiedenen Gruppen wurden im Balkendiagramm gezeigt (**P <0,01 im Vergleich zur Kontrolle; ^## P < 0.01 im Vergleich zu DOX)

Western Blotting

Western-Blotting wurde durchgeführt, um die Expressionsniveaus der Apoptose-assoziierten Proteine ​​Bax, Caspase-3 und Bcl-1 zu messen (Fig. 6). Bax und Caspase-3 wurden sowohl in der DOX- als auch in der PEG-CdTe-DOX-Gruppe schrittweise hochreguliert. Im Gegensatz dazu änderte sich die Bcl2-Expression umgekehrt. In der PEG-CdTe-DOX-Gruppe wurden Bax und Caspase-3 im Vergleich zur DOX-Gruppe stark exprimiert (P <  0,05), während die Bcl2-Expression am niedrigsten war. Diese Ergebnisse bestätigen, dass die Antitumoraktivität von PEG-CdTe-DOX unter den anderen am effektivsten ist.

Proteinexpression von Apoptose-assoziierten Genen von PRMI 8226-Zellen mit verschiedenen Behandlungen. Hinweise:a PBS; b PEG-CdTe; c DOX; d PEG-CdTe-DOX (*P < 0.05)

Diskussion

Die Hauptursache für das Versagen einer Tumorchemotherapie ist die Unverträglichkeit der Patienten. Das PAD-Schema mit Bortezomib, DOX und Dexamethason ist die Erstlinientherapie des multiplen Myeloms [9]. DOX spielt eine wichtige Rolle bei der Behandlung des multiplen Myeloms. DOX hemmt die Proliferation und induziert die Apoptose von Tumorzellen, indem es die DNA zerstört [20]. Zytostatika wie DOX induzieren jedoch verschiedene Nebenwirkungen auf normale Gewebe und Organe, insbesondere Kardiotoxizität [21]. Myelom wird am häufigsten bei Menschen im Alter von 65 bis 74 Jahren diagnostiziert [22], und ältere Patienten mit multiplem Myelom leiden häufig an Organdysfunktionen und können keine hochdosierte Chemotherapie erhalten, um die Ergebnisse zu verbessern. Die Verträglichkeit ist eine Garantie für die weitere Behandlung des Multiplen Myeloms und schränkt damit die klinische Anwendung von DOX ein. Daher haben zahlreiche EMM-Patienten keine Chance auf eine wirksame Behandlung, weil sie eine hochdosierte Chemotherapie nicht aushalten. Daher ist es dringend erforderlich, Verfahren zu entwickeln, die unerwünschte Wirkungen reduzieren und therapeutische Wirkungen verstärken können. In dieser Arbeit entwickelten wir ein DOX-beladenes Abgabesystem unter Verwendung von PEG-CdTe-Nanopartikeln, die in der Lage waren, Medikamente durch den systemischen Kreislauf selektiv im Tumorgewebe zu konzentrieren.

Unsere Studie ergab, dass PEG-CdTe-Nanopartikel DOX mit hohem DL und EE beladen können (Abb. 2e), was mit anderen Studien übereinstimmt [12, 13]. Darüber hinaus konnten die PEG-CdTe-Nanopartikel mit einem Durchmesser von 8,2 nm (< 10 nm) schnell über die Harnwege verstoffwechselt werden [23], und PEG-CdTe-DOX-Nanopartikel mit einer Größe von 78,31 nm (< 200 nm) verlängerten die Durchblutung und reduzierte oder sogar vermiedene Plasmaopsonisierung und -resorption im retikuloendothelialen System [23]. Als Nanopartikel-Träger wurden die Medikamente aus PEG-CdTe in einem pH-getriggerten und pH-kontrollierten Muster freigesetzt und verlängerten die Zirkulationszeit, was für ein praktisches Drug-Delivery-System wichtig war, um unerwünschte Immunreaktionen und Gewebereaktionen gegen den Wirkstoffträger zu verhindern [24]. Die Tumormikroumgebung hatte aufgrund des hypoxischen Zustands einen niedrigeren pH-Wert als normales Gewebe [25] und setzte daher mehr DOX frei. Die Wirkstoffkonzentration in saurer Mikroumgebung (Tumorgewebe) und damit die Wirksamkeit von Chemotherapeutika kann verbessert werden [26]. Daher wurde das Arzneimittel um die Tumorzellen herum massiv freigesetzt, während das Arzneimittel in der normalen physiologischen Umgebung größtenteils im Träger verblieb und weniger in normales Gewebe freigesetzt wurde. Intrazelluläre Experimente bestätigten auch, dass mehr DOX an PRMI 8226-Zellen abgegeben wurde. Daher wurde die chemotherapeutische Wirksamkeit verbessert und die nachteiligen Wirkungen auf normales Gewebe induziert.

In-vitro-Experimente zeigten durchweg, dass PEG-CdTe-DOX auf Tumorzellen abzielte und dort die Wirkstoffakkumulation erhöhte (Abb. 3). In ähnlicher Weise wurden die Proliferationshemmung und Apoptose von PRMI 8226-Zellen durch PEG-CdTe-DOX im Vergleich zu DOX allein bei der gleichen Konzentration erhöht (Abb. 4). Daher war ein niedrigerer DOX erforderlich, um die gleiche chemotherapeutische Wirksamkeit zu erreichen. Darüber hinaus können die Hemmung der RPMI 8226-Zellproliferation und die Apoptose-Induktion durch PEG-CdTe-DOX erhöht werden, wodurch die Medikamente hauptsächlich Myelomzellen abtöten (Abb. 5). Darüber hinaus wurde kein signifikanter Unterschied zwischen der PEG-CdTe-Gruppe und der Kontrollgruppe gefunden, die bestätigte, dass PEG-CdTe in vitro keine therapeutische Aktivität aufwies. Zu beachten ist, dass unsere Ergebnisse auf die hohe Sicherheit und geringe Zytotoxizität von PEG-CdTe bei niedriger Konzentration hinweisen, was mit anderen Studien übereinstimmt [12, 27]. Allerdings ist die Apoptoserate von PMIR 8226-Zellen, die von FCM in der PEG-CdTe-DOX-Gruppe bewertet wurden, offensichtlich höher als in der DOX-Gruppe (P < 0,01). Somit könnte PEG-CdTe die Nebenwirkungen von DOX signifikant abschwächen, indem die Medikamente an Tumorzellen abgegeben werden.

Die drei Hauptwege der Apoptose wurden betrachtet:der mitochondriale Weg, der endoplasmatische Retikulum-Weg und der Todesrezeptor-Weg. Beim mitochondrialen Weg werden apoptogene Faktoren (z. B. Cytochrom C) zunächst aus den Mitochondrien in das Zytosol freigesetzt und initiieren dann die durch den Caspase-Weg induzierte Apoptose dieses Weges [28]. Die Bcl2-Familie besteht aus pro-apoptotischen Proteinen (Bax, Bad und Bak) und anti-apotoptischen Proteinen (Bcl-xl und Bcl2) [29]. Bax kann vom Zytosol zur mitochondrialen Membran wandern, wenn es durch Apoptosesignale stimuliert wird, die den Höhepunkt der zellulären Mechanismen „Leben oder Tod“ darstellen. Bcl2 und Bax sind ein Paar positiver und negativer Genregulationen, da Bax Apoptose induziert, während Bcl2 sie hemmt [30]. Caspase-3 kann nicht nur die Apoptose fördern, während das Überleben der stärkste Inhibitor der Apoptose ist, sondern fördert auch die Zellproliferation, die Caspase-3 und Caspase-7 direkt aktivieren und dadurch die Apoptose blockieren kann [31, 32]. Caspase-3, ein Henker in der Caspase-Familie, kann auch die Poly-Adp-Ribose-Polymerase spalten und inaktivieren, wenn sie initiiert wird [12]. In der vorliegenden Studie wurde die Expression verwandter apoptotischer Proteine ​​nachgewiesen, um den molekularen Mechanismus zu erforschen, wie PEG-CdTe-DOX die Antitumoraktivität verstärkt. Es wurde festgestellt, dass PEG-CdTe-DOX die zytotoxischen Wirkungen auf Tumorzellen verstärken kann, indem es Apoptose über den Caspase-vermittelten apoptotischen Weg induziert.

Schlussfolgerungen

Wir haben das PEG-CdTe-DOX für die EMM-Behandlung mit hohem EE und DL hergestellt. Dieses System kann DOX gezielt an RPMI 8226-Zellen abgeben, wodurch die therapeutische Wirkung erhöht und die Nebenwirkungen von DOX verringert werden. Die gezielte Behandlung von PEG-modifiziertem CdTe könnte die chemotherapeutische Wirksamkeit erhöhen und die Nebenwirkungen reduzieren, was den Weg für eine bessere Krebsbehandlung ebnen könnte.

Abkürzungen

DAPI:

4′,6-Diamidino-2-phenylindol

DL:

Beladung mit Medikamenten

DOX:

Doxorubicin

EE:

Verkapselungseffizienz

EMM:

Extramedulläres multiples Myelom

FCM:

Durchflusszytometrie

HPLC:

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

MM:

Multiples Myelom

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

PEG-CdTe-DOX:

Polyethylenglykol-modifizierte Cadmiumtellurid-Quantenpunkte

SDS/PAGE:

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

TEM:

Transmissionselektronenmikroskop