Oberflächenladung steuert die Komplexierung von Pullulan-Nanopartikeln mit humanem Serumalbumin und die kontrollierte Freisetzung von Arzneimitteln

Zusammenfassung

Das Design von Nanopartikeln hängt davon ab, wie die Oberflächenchemie die Proteinadsorption im Blutstrom steuert. Wir synthetisierten drei Pullulan-basierte Polymere: cholesterin-modifiziertes Pullulan (CHP), CH-modifiziertes aminiertes Pullulan (CHAP) und CH-modifiziertes carboxyliertes Pullulan (CHSP) und formten Nanopartikel durch Dialyse. Dynamische Lichtstreuung zeigte, dass die Partikelgröße mit der Anzahl der Ladungsgruppen variiert: CHP (73,1 nm, −0,698 mV), CHAP (116,9 nm, +12,9 mV) und CHSP (156,9 nm, −15,4 mV). Isotherme Titrationskalorimetrie ergab unterschiedliche thermodynamische Profile für die HSA-Bindung: Bindungskonstanten (K_b) von 1,41 × 10⁴, 27,7 × 10⁴ und 412 × 10⁴ M⁻¹ für CHSP, CHP und CHAP, was den Einfluss der Oberflächenladung widerspiegelt. Fluoreszenz- und Zirkulardichroismus-Analysen bestätigten, dass HSA bei der Komplexierung eine α-Helix-Reduktion erfährt, wobei CHP die größte Konformationsänderung induziert. In-vitro-Freisetzungsstudien mit Mitoxantron zeigten, dass HSA-Adsorption die Freisetzung deutlich verlangsamt: nach 48 h gaben CHSP–HSA 35,8 %, CHP–HSA 33,9 % und CHAP–HSA 32,5 % frei, verglichen mit 53,7 %, 58,5 % und 63,2 % für die freien Nanopartikel. Diese Ergebnisse unterstreichen, dass Nanopartikelgröße, Oberflächenladung und Proteinkorona-Bildung die Freisetzungskinetik und damit die therapeutische Wirksamkeit entscheidend bestimmen.

Hintergrund

Gezielte nano-basierte Arzneimittelabgabe hat sich als Eckpfeiler der modernen Onkologie etabliert, da sie eine anhaltende Freisetzung und reduzierte systemische Toxizität bietet (1–3). Damit ein Nanopartikel (NP) Tumorgewebe erreicht, muss er die Blutzirkulation durchlaufen, das vaskuläre Endothel passieren, die extrazelluläre Matrix durchdringen und in Krebszellen eindringen (4–6). Proteinadsorption – insbesondere von hochkonzentrierten Plasmaproteinen wie humanem Serumalbumin (HSA) – bildet eine „Proteinkorona“, die NP-Biodistribution, zelluläre Aufnahme und Arzneimittelfreisetzung verändern kann (10–14). Die Koronazusammensetzung wird durch Proteinkonzentration, NP-Affinität und Oberflächeneigenschaften wie Ladung, Hydrophobie und Größe bestimmt (15–19).

Pullulan, ein neutrales Polysaccharid, kann chemisch modifiziert werden, um hydrophobe Cholesteringruppen einzuführen, was amphiphile Polymere ergibt, die sich zu Kern-Schale-NPs selbstassemblieren. Frühere Arbeiten zeigten, dass cholesterin-modifiziertes Pullulan (CHP) Antikrebsmedikamente einkapseln kann und dass HSA über hydrophobe Wechselwirkungen an CHP bindet (28–31). Aufbauend darauf entwickelten wir zwei weitere Varianten: CH-modifiziertes aminiertes Pullulan (CHAP) mit Aminogruppen und CH-modifiziertes carboxyliertes Pullulan (CHSP) mit Carboxylgruppen. Diese Modifikationen ermöglichen eine systematische Untersuchung, wie die Oberflächenladung Proteinadsorption und Arzneimittelfreisetzung beeinflusst.

Methoden

Materialien

HSA (Sigma-Aldrich), N,N-Imidazol, Ethylendiamin, Succinsäureanhydrid und andere Reagenzien waren analytischer Qualität.

Synthese von CHP, CHSP und CHAP

CHP wurde durch Veresterung von Pullulan mit Cholesterinsuccinat (CHS) in DMSO hergestellt, gefolgt von Reinigung (Abb. 1). CHAP erhielt man durch Reaktion von CHP mit N,N-Diimidazol und Ethylendiamin; CHSP wurde über Succinsäureanhydrid-Kupplung synthetisiert. Die strukturelle Bestätigung erfolgte mittels FTIR und ¹H-NMR, wobei Cholesterin-Substitutionsgrade von 4,5 % (CHP), 7,8 % (CHSP) und 14,1 % (CHAP) ermittelt wurden (Abb. 2–3).

Herstellung und Charakterisierung der NPs

Nanopartikel entstanden durch Dialyse der Polymere in DMSO gegen Wasser, gefolgt von Filtration (0,45 µm). Größe und Zeta-Potenzial wurden per dynamischer Lichtstreuung (DLS) gemessen. CHP-, CHAP- und CHSP-NPs wiesen mittlere Durchmesser von 73,1 nm, 116,9 nm und 156,9 nm sowie Zeta-Potenziale von −0,698 mV, +12,9 mV und −15,4 mV auf (Abb. 4).

ITC

Isotherme Titrationskalorimetrie quantifizierte die Thermodynamik der HSA-Bindung an jeden NP-Typ bei 25 °C (Abb. 5). Exotherme Bindung wurde für CHP und CHSP beobachtet, während CHAP eine initiale exotherme Phase gefolgt von endothermer Bindung zeigte, was das Zusammenspiel hydrophober und elektrostatischer Kräfte widerspiegelt.

Fluoreszenzspektroskopie

HSA-Fluoreszenz (Anregung 280 nm, Emission 290–450 nm) wurde nach Mischen mit jedem NP-Typ überwacht. Quenching-Analyse mit einer modifizierten Stern-Volmer-Gleichung ergab Bindungskonstanten von 2,02, 2,99 und 4,72 × 10⁵ M⁻¹ für CHSP, CHP und CHAP, was die stärkste Wechselwirkung für das positiv geladene CHAP anzeigt.

Zirkulardichroismus-Analyse

CD-Spektren (200–250 nm) bewerteten Änderungen der HSA-Sekundärstruktur bei NP-Bindung. Der α-Helix-Gehalt sank von 55 % (freies HSA) auf 48–52 % für die Komplexe, mit der stärksten Reduktion für CHP–HSA (Abb. 8).

In-vitro-Arzneimittelfreisetzung

Mitoxantron (MTO) wurde in jedes NP über Dialyse eingekapselt. Freisetzungsprofile wurden in PBS bei 37 °C mit und ohne HSA (0,1 mg/mL) gemessen. Das freie Medikament setzte 99,8 % innerhalb von 4 h frei. Für NPs allein betrugen die 48-h-Freisetzungsraten 53,7 % (CHP), 58,5 % (CHAP) und 63,2 % (CHSP). Die Anwesenheit von HSA reduzierte diese Raten auf 33,9 % (CHP–HSA), 32,5 % (CHAP–HSA) und 35,8 % (CHSP–HSA) (Abb. 9).

Ergebnisse

Charakterisierung der CHP-, CHSP- und CHAP-Polymere

FTIR-Spektren bestätigten die erfolgreiche Funktionalisierung: Ester-Carbonyl-Peaks bei 1731 cm⁻¹ für CHP, Amid-Peaks bei 1648 cm⁻¹ für CHAP und Carboxyl-Peaks bei 1710 cm⁻¹ für CHSP (Abb. 2). NMR-Analyse quantifizierte die Substitutionsgrade (Tabelle 1).

Eigenschaften der CHP-, CHSP- und CHAP-NPs

Größe und Oberflächenladung beeinflussten die NP-Selbstassemblierung direkt: negativ geladenes CHSP und positiv geladenes CHAP bildeten größere Partikel (156,9 nm und 116,9 nm) im Vergleich zu neutralem CHP (73,1 nm). Zeta-Potenziale spiegelten die eingebauten Funktionsgruppen wider (−15,4 mV, +12,9 mV, −0,698 mV). Die Anwesenheit geladener Gruppen störte die Kernpackung, was zu lockereren, größeren Strukturen führte (Abb. 4).

Thermodynamische Analyse

ITC-Daten (Tabelle 2) zeigten exotherme Bindung für CHP (ΔH = 42,8 kJ mol⁻¹) und CHSP (ΔH = 80,4 kJ mol⁻¹) sowie ein gemischtes exo-endo-Profil für CHAP (ΔH = 22,4 kJ mol⁻¹). Entropieänderungen deuteten auf leichtere HSA-Bindung an CHP und CHAP (ΔS = 0,251 kJ mol⁻¹ K⁻¹ und 2,775 kJ mol⁻¹ K⁻¹) hin als an CHSP (ΔS = 0,201 kJ mol⁻¹ K⁻¹).

Fluoreszenzspektroskopie

Fluoreszenz-Quenching bestätigte eine schnelle Adsorptionsphase gefolgt von langsamerer Komplexbildung. Die aus Stern-Volmer-Analyse abgeleiteten Bindungskonstanten stimmten mit ITC-Ergebnissen überein und unterstrichen die dominierende Rolle der Elektrostatik für CHAP und der Hydrophobie für CHP (Abb. 7).

CD-Spektren-Analyse

CD-Messungen zeigten progressiven α-Helix-Verlust bei Komplexierung: CHP–HSA fiel auf 48,0 %, CHAP–HSA auf 48,6 % und CHSP–HSA auf 52,0 % (Abb. 8). Die schnellste Helizitätsreduktion trat für CHP auf, konsistent mit seinem kompakten, dicht gepackten Kern.

Arzneimittelfreisetzung

HSA-Adsorption verlangsamte die Arzneimittelfreisetzung konsistent über alle NP-Typen. Die Hierarchie der Freisetzungsraten (48 h) entsprach der Sequenz von NP-Größe und Oberflächenladung: CHSP > CHAP > CHP für freie NPs, und CHSP–HSA > CHP–HSA > CHAP–HSA für protein-gebundene Komplexe (Abb. 9). Diese Ergebnisse verdeutlichen, wie die Proteinkorona Diffusions- und Degradationswege moduliert.

Diskussion

Unsere Daten bestätigen, dass die Oberflächenladung ein entscheidender Faktor für die HSA-Korona-Bildung und die nachfolgende Arzneimittelfreisetzung ist. Das positiv geladene CHAP bildete den stärksten NP–HSA-Komplex, was auf kombinierte elektrostatische Anziehung und hydrophobe Verankerung zurückzuführen ist. Im Gegensatz dazu zeigte das negativ geladene CHSP die schwächste Bindung, begrenzt durch Ladungsabstoßung und eine porösere Hülle, die die Proteinmigration zum Kern verlangsamte. Neutrales CHP nahm eine intermediäre Position ein und zeigte die höchste HSA-Bedeckung aufgrund seines kompakten, hydrophoben Kerns.

Diese Wechselwirkungen beeinflussen das in-vivo-Schicksal von medikamentenbeladenen NPs. Eine dichte Proteinkorona kann die Endothelpassage behindern, die Organverteilung verändern und die zelluläre Aufnahme reduzieren (15–18). Durch Abstimmung der Oberflächenladung können wir die Koronazusammensetzung modulieren und so Pharmakokinetik und therapeutische Fenster feinjustieren.

Schlussfolgerungen

Wir haben erfolgreich drei Pullulan-basierte Nanopartikel mit unterschiedlichen Oberflächenladungen entwickelt. Größe, Ladung und Hydrophobie steuerten gemeinsam HSA-Adsorption, Bindungsstärke und Freisetzungskinetik. Positiv geladenes CHAP zeigte die stärkste Proteinbindung und die langsamste Arzneimittelfreisetzung, während neutrales CHP die höchste Proteinbedeckung aber die schnellste Freisetzung unter freien NPs aufwies. Diese Erkenntnisse bieten einen Bauplan für das Design von Nanoträgern mit maßgeschneiderten Proteinkorona-Profilen zur Optimierung gezielter Abgabe und kontrollierter Freisetzung.

Abkürzungen

EDX

Energiedispersive Röntgenspektroskopie

SEM

Rasterelektronenmikroskop

TEM

Transmissionselektronenmikroskopie

XRD

Röntgendiffraktion