Fluoreszierende Neoglykoprotein-Gold-Nanocluster:Synthese und Anwendungen in der pflanzlichen Lektinmessung und Zellbildgebung

Einführung

Gold-Nanocluster (AuNCs), die aus zehn bis hundert Goldatomen bestehen, haben aufgrund ihrer attraktiven chemischen und physikalischen Eigenschaften die Aufmerksamkeit der Wissenschaft auf sich gezogen [1]. Kleiner als 3 nm nähern sich Gold-Nanocluster der Fermi-Wellenlänge von Elektronen, was zu einer größenabhängigen Fluoreszenzemission führt und Möglichkeiten als Sensor- und Bildgebungssonden für In-vitro- und In-vivo-Anwendungen bietet [2,3,4]. Aktuelle Fluoreszenzassays beinhalten meist organische Farbstoffe wie Rhodamin oder Fluorescein oder seltener Quantenpunkte [5,6,7]. Aufgrund der geringen photochemischen Stabilität, der pH-empfindlichen Fluoreszenz oder der schlechten Wasserlöslichkeit einiger organischer Farbstoffe und der Toxizität von Quantenpunkten kann ihre Verwendung jedoch beeinträchtigt werden [8]. In diesem Zusammenhang können Goldnanocluster als alternative ultrakleine Fluorophore angesehen werden, denen die oben genannten Einschränkungen fehlen. Darüber hinaus zeichnen sich AuNCs durch eine große Stokes-Verschiebung und Fluoreszenzemissionswellenlänge vom roten sichtbaren bis zum nahen Infrarot (IR)-Bereich aus, was für die Biobildgebung sehr günstig ist, da sie das Gewebetransparenzfenster überlappt [8,9,10].

Die proteinunterstützte Synthese von Gold-Nanoclustern wurde erstmals 2009 unter Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA) beschrieben [11] und seitdem sind wasserlösliche, proteingeschützte Nanocluster ein aufstrebender Trend in der Nanowissenschaft [9, 12, 13]. Glykoproteinen [14] wurde bei der Herstellung von AuNCs weit weniger Aufmerksamkeit geschenkt, und uns sind keine Berichte bekannt, die die Bildung von AuNCs aus synthetischen Neoglykoproteinen als Gerüste beschreiben. Im Allgemeinen moduliert die Glykosylierung die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Glykoproteinen, z. B. Faltung, Kreislauflebensdauer oder Stabilität. Es beeinflusst auch wichtige biologische Funktionen von Proteinen, wie die Rezeptor-Liganden-Erkennung. So kann die Erzeugung synthetischer Neoglykoproteine ​​aus Proteinen durch chemische Anlagerung sorgfältig entworfener und charakterisierter Kohlenhydrate [15] diese mit neuen funktionellen Eigenschaften für biologische Anwendungen ausstatten. Da Kohlenhydrate durch die Wechselwirkung mit kohlenhydratbindenden Proteinen an einer Vielzahl verschiedener biologischer Prozesse beteiligt sind [16, 17], sehen wir Neoglykoprotein-Gold-Nanocluster als neuartige Sonden zur Untersuchung und Nutzung von Kohlenhydrat-Erkennungsereignissen sowohl in vitro als auch in vivo vor [18]. In dieser Hinsicht bietet das Vorhandensein mehrerer Glykankopien auf der Proteinoberfläche eine multivalente Präsentation von Kohlenhydraten mit der nachfolgenden Steigerung der Bindungsaffinität.

Hier untersuchen wir die Verwendung von selbstfluoreszierenden Neoglykoprotein-funktionalisierten AuNCs als Sensorsonden für Pflanzenlektine und als Targeting-Reagenzien von Lektinrezeptoren für die In-vitro-Bildgebung von dendritischen Zellen (DCs). Lektine sind kohlenhydratbindende Proteine, die bei verschiedenen biologischen Erkennungsphänomenen helfen. In höheren Pflanzen verhindern beispielsweise Lektine durch Erkennung und Agglutination fremder Glykoproteine ​​pflanzenfressende Organismen und hemmen deren Wachstum und Vermehrung [19]. In Säugetier-DCs hingegen spielen C-Typ-Lectin-Rezeptoren (CLRs), die auf der Zelloberfläche exprimieren, eine wichtige Rolle bei der Pathogenerkennung [20]. Glykan-dekorierte Antigene werden von spezifischen CLRs erkannt, weiter endozytiert, prozessiert und schließlich T-Zellen präsentiert, um spezifische Immunantworten zu induzieren. In unserer vorherigen Studie haben wir gezeigt [21], dass die Funktionalisierung eines Modellantigens, Ovalbumin (OVA), mit einem synthetischen biantennären GlcNAc, das N-Glykan G0 terminiert, das Targeting auf DCs und die anschließende Antigenaufnahme und -präsentation verbessert. Wir postulierten, dass das oben erwähnte Phänomen durch die Interaktion von G0-Glykan und endozytischen C-Typ-Lectinrezeptoren, die auf der Oberfläche von DCs exprimiert werden, initiiert wird. Folglich glauben wir, dass fluoreszierende und multivalente G0-OVA-Gold-Nanocluster eine Alternative zu fluoreszenzmarkiertem G0-OVA werden könnten, die in unserer vorherigen Studie verwendet wurden, und als neues Werkzeug für die DC-Visualisierung verwendet werden könnten. Darüber hinaus könnte das Glykan-vermittelte Targeting von DCs, das die Initiierung starker T-Zell-Immunantworten ermöglicht, verwendet werden, um die Wirksamkeit von Impfstoffkandidaten zu verbessern [22,23,24]. In dieser ersten Studie werden wir die Synthese von Gold-Nanoclustern ausgehend von Neoglykoproteinen und die Bewertung der Funktionalität und Zugänglichkeit von G0-Glykanen anhand von Lektin-Agglutinationsexperimenten vorstellen. Schließlich werden wir das Potenzial von fluoreszierenden Gold-Nanoclustern für die Bildgebung dendritischer Zellen demonstrieren.

Ergebnisse und Diskussion

Wir optimierten die Synthese von Ovalbumin-Gold-Nanoclustern, die mit dem G0-Glykan (G0-OVA-AuNCs) dekoriert sind, basierend auf früheren Berichten unter Verwendung von unkonjugiertem OVA-Protein [25, 26]. Proteingeschützte AuNCs wurden durch Zugabe von Goldtetrachlorogold(III)-Säure (HAuCl₄ .) hergestellt ^. 3H₂ O) zu einer Proteinlösung, gefolgt von 1 M wässriger Natriumhydroxidlösung. Eine Erhöhung des Reaktions-pH erhöht das Reduktionspotential von Tryptophan- und Tyrosinresten, die in OVA vorhanden sind (Abb. 1a) [14]. Das Proteingerüst fungiert sowohl als reduzierendes als auch stabilisierendes Reagens, indem es den kleinen Goldcluster innerhalb der Proteinstruktur einschließt und ihn von der Umgebung isoliert. Ein früheres Protokoll für die Synthese fluoreszierender OVA-AuNCs erforderte eine sehr hochkonzentrierte OVA-Lösung (bis zu 65 mg mL ⁻¹ ) [25]. Um die Verwendung wertvoller OVA-Neoglycokonjugate für die Herstellung von AuNCs einzuschränken, haben wir die minimale Menge an unkonjugiertem OVA bestimmt, die effizient OVA-AuNCs produzieren könnte. Wir haben festgestellt, dass eine OVA-Konzentration von 15 mg ml ⁻¹ war ausreichend, um Cluster mit starker Fluoreszenzemission zu erzeugen (Zusatzdatei 1:Abbildung S1). Die Bildung von OVA-AuNCs wurde durch Mikrowellenbestrahlung signifikant beschleunigt, wodurch die Reaktionszeit von 18 h auf 6 min verkürzt wurde [25]. Darüber hinaus bewirkte Mikrowellenbestrahlung eine homogene Erwärmung der Lösung, wodurch die Bildung einheitlicher und monodisperser Cluster begünstigt wurde [1]. Auf diese Weise hergestellte OVA-AuNCs zeigen eine blassbraune Farbe und emittieren unter UV-Licht eine starke rote Fluoreszenz (Abb. 1b). Dem UV-Vis-Spektrum von OVA-AuNCs fehlt die Absorption, die einer lokalisierten Oberflächenplasmonenresonanzbande entspricht, was auf das Fehlen von Goldnanopartikeln größer als 5 nm hinweist [27], was weiter durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt wurde. Wir haben einen durchschnittlichen Durchmesser des OVA-AuNCs-Goldkerns in einem Bereich von 1,9 ± 0,7 nm gemessen (zusätzliche Datei 1:Abbildung S2). Schließlich wurde eine durchschnittliche hydrodynamische Größe der OVA-AuNCs von 8,7 nm ± 2,5 nm durch dynamische Lichtstreuung zugewiesen (Zusätzliche Datei 1:Abbildung S2). Sein ähnlicher Größenbereich wie OVA (6,5–7 nm Durchmesser [28]) lässt auf die Anwesenheit eines einzelnen Proteinmoleküls pro Goldkern schließen. Eine weitere Analyse von OVA-AuNCs durch Agarosegelelektrophorese zeigte eine ähnliche Mobilität für OVA und OVA-AuNCs in Richtung einer positiven Elektrode, was die ähnliche Größe für beide Spezies und ihre negative Ladung bei neutralem pH weiter bestätigt (Abb. 1c). Das Fluoreszenzemissionsspektrum von OVA-AuNCs zeigt einen maximalen Emissionspeak bei λ 670 nm bei Anregung bei 350 nm (Abb. 1d). Die Anregungsspektren von AuNCs sind breit und die Stokes-Verschiebung groß (über 200 nm), was ideal für spektrale Mehrfarbendetektionsanwendungen in Gegenwart einer anderen Fluoreszenzsonde (Multiplexing) ist, die durch eine ähnliche Anregungswellenlänge gekennzeichnet ist, wie der blau emittierende Alexa Fluor® 405-Farbstoff [26]. Die Quantenausbeute (QY) von OVA-AuNCs wurde mit ≈  4 % berechnet, wenn Fluorescein in 0,1 M NaOH (QY  = ≈  92 %) als Referenzstandard verwendet wurde [29]. Die Oxidationsstufe des Goldkerns wurde anhand von Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS)-Messungen einer Mischung aus Au(I)- und Au(0)-Spezies zugeordnet (Zusatzdatei 1:Abbildung S3) [11, 30]. Die Untersuchung des Circulardichroismus (CD) der Sekundärstruktur von Proteinen ergab eine zufällige Coil-Organisation, die auf einen Verlust der nativen Faltung für OVA in AuNCs hindeutet, wahrscheinlich aufgrund von harschen alkalischen Bedingungen während der Synthese (zusätzliche Datei 1:Abbildung S4) [31]. Schließlich haben wir auch eine außergewöhnliche Stabilität von OVA-AuNCs in einem breiten pH-Bereich (3–11) sowie in einer Lösung mit fetalem Rinderserum (FBS), dem am häufigsten verwendeten Serum-Supplement für in vitro Zellkulturen, beobachtet (Zusatzdatei 1:Abbildung S5). Diese Eigenschaft von OVA-Gold-Nanoclustern unterstreicht ihre Nützlichkeit für In-vitro- und In-vivo-Bioassays und eröffnet spannende neue Anwendungen. Beispielsweise könnte die pH-unempfindliche Fluoreszenzemission von OVA-AuNCs eine effiziente Partikelverfolgung innerhalb der Zelle ohne Signalverlust sogar innerhalb der endosomalen Kompartimente ermöglichen, die durch einen leicht sauren pH gekennzeichnet sind [32, 33]. Im Gegensatz dazu kann unter diesen Bedingungen die Verwendung bestimmter Fluorescein-Konjugate beeinträchtigt werden, da die maximale Fluoreszenzemission dieser Farbstoffe im basischen pH erreicht wird. OVA-AuNCs zeigten auch eine ausgezeichnete Löslichkeit sowohl in Wasser als auch in Zellwachstumsmedium. Eine vollständige Solubilisierung von OVA-AuNCs wurde bis zu einer Konzentration von 40 mg/ml sowohl in Wasser als auch im Zellwachstumsmedium beobachtet. (Zusätzliche Datei 1:Abbildung S6). Fluoreszenzemissionsspektren bei verschiedenen OVA-AuNCs-Verdünnungen wurden gemessen und auf Stabilität unter Inkubation bei 37 °C bis zu 24 Stunden getestet.

a Schematische Darstellung der OVA-AuNCs-Synthese. b UV-sichtbare Spektren von OVA (blaue Linie) und OVA-AuNCs (orange Linie). Einfügen:Bilder von OVA-AuNCs (a ) und OVA (b ) unter Beleuchtung mit sichtbarem Licht (links) und unter Beleuchtung mit UV-Licht (365 nm) (rechts). c Agarosegelelektrophorese von OVA (gefärbt mit Coomassie Blue G-250) und OVA-AuNCs (unter UV-Licht-Beleuchtung). d Fluoreszenzanregungs- (grüne Linie) und Emissionsspektren (rosa Linie) von OVA-AuNCs

Für die Synthese von G0-OVA-Neoglykoprotein-geschützten AuNCs haben wir zunächst G0-funktionalisierte OVA-Neoglykoproteine ​​hergestellt. Biantennäres N-Glycan G0, das mit einem C5-Aminolinker ausgestattet ist, wurde wie zuvor beschrieben synthetisiert [34] und die Konjugation mit OVA wurde unter Verwendung von Disuccinimidylsuberatester (DSS) als Vernetzungsreagenz erreicht (Abb. 2a) [21, 35]. Kurz gesagt, die Konjugation erfolgt in einer zweistufigen Reaktion:N-Glycan G0 wird mit einem 13-fachen Überschuss an DSS-Linker funktionalisiert und dann an freie Aminogruppen auf OVA gekoppelt. Durch die Kontrolle des Glykan/Protein-Verhältnisses konnten wir den Grad der OVA-Substitution effektiv anpassen (siehe SI). Die erfolgreiche Bildung von Neoglykoproteinen wurde durch das Auftreten einer diffusen elektrophoretisch langsamer wandernden Bande auf dem SDS-PAGE-Gel bestätigt (Abb. 2b), während die durchschnittliche Anzahl der eingeführten Glykane durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie [21] (Abb .2c). Nach dieser Strategie stellten wir OVA-Neoglycokonjugate her, die 2–3, 3–4 und 5–6 Kopien von N-Glycan G0 pro Protein aufweisen.

a Synthese von G0-OVA-Neoglykokonjugaten (n =Wertigkeit). b SDS-PAGE-Gelelektrophorese von OVA- und G0-OVA-Neoglykoproteinen, die verschiedene Valenzen von N-Glykan G0 enthalten. c MALDI-TOF-Massenspektren von OVA- und G0-OVA-Neoglykoproteinen mit unterschiedlichen Valenzen von N-Glykan G0

Als nächstes setzten wir die synthetischen Neoglykoproteine ​​bei der Herstellung von AuNCs (Abb. 3a) unter zuvor optimierten Bedingungen ein und untersuchten den Einfluss der Glykanfunktionalisierung und ihrer Wertigkeit auf die physikalischen und optischen Eigenschaften der Cluster. Wie in Abb. 3 gezeigt, waren die UV-Vis-Absorption und die Fluoreszenzemission von G0-OVA-AuNCs identisch mit OVA-AuNCs mit einer charakteristischen Absorption bei 278 nm und einer roten Fluoreszenzemission mit einem Maximum bei etwa 670 nm (Abb. 3b, c).

a Schematische Darstellung der Synthese von G0-Glykan-abgeleiteten OVA-AuNCs. b Fluoreszenzemissionsspektren von G0-OVA-AuNCs (blaue, orange und grüne Linie) im Vergleich zu OVA-AuNCs (rosa Linie). c UV-sichtbare Spektren von G0-OVA-AuNC (blaue, orange und grüne Linie) und OVA-AuNC (rosa Linie)

Darüber hinaus haben wir durch TEM-Messungen einen durchschnittlichen Durchmesser von 1,6 ± 0,5 nm (Abb. 4) für den Kern der G0-OVA-AuNCs ermittelt, der mit der Größe von OVA-AuNCs (1,9 ± 0,7 nm) vergleichbar ist. Basierend auf unseren Ergebnissen glauben wir, dass die über Lysinreste oder den N-Terminus an OVA konjugierten Glykane das gesamte Reduktionspotential von Glykoproteinen und die weitere Bildung von Clustern bei den getesteten Valenzen nicht beeinflussen [36]. Außerdem scheinen Zucker die Bildung von Cluster-stabilisierenden Au(I)-Thiolat-Polymeren [37, 38] zwischen den Cysteingruppen des Proteins und des Goldkerns nicht zu behindern, selbst wenn sie in höherer Zahl (5–6 Kopien) vorliegen.

TEM-Aufnahme von G0-OVA-AuNCs (3/4). Insert:Größenverteilung des Goldkerndurchmessers von G0-OVA-AuNCs (3/4)

Schließlich wurde, ähnlich wie bei OVA-AuNCs, die Sekundärstruktur des G0-OVA-AuNCs (3/4)-Proteins durch CD zugeordnet und zeigte eine zufällige Coil-Organisation (Zusatzdatei 1:Abbildung S4). Durch die Anlagerung von Glykanen an das Proteingerüst von AuNCs führen wir jedoch zielgerichtete Moleküle ein, die eine Interaktion mit Kohlenhydrat-bindenden Proteinen ermöglichen, und gleichzeitig bleibt ein OVA-Protein nur als Träger übrig, dessen Konformationsänderungen die Lektinerkennung des das ganze System. Die antigene Kapazität von denaturiertem OVA bei der Produktion von Antikörpern bei Mäusen [39] und bei der T-Zell-Aktivierung wurde beschrieben. Die Aktivierung von T-Zellen ist unabhängig von der Antigen-Sekundärstruktur, da sie über die Erkennung bestimmter Aminosäuresequenzen vermittelt wird, die sowohl in nativer als auch in denaturierter OVA präsentiert werden [40]. Tatsächlich ist das Antigen OVA 323-339-Peptid für die wichtigste spezifische T-Zell-Antwort auf OVA verantwortlich und dieses Peptid wurde in Nanopartikeln verwendet, um Immunantworten zu induzieren [41].

Um die Funktionalität neu eingeführter Glykanketten auf Neoglykoprotein-geschützten Gold-Nanoclustern zu untersuchen, haben wir deren Interaktion mit verschiedenen Pflanzenlektinen in Agglutinationsexperimenten untersucht. Wir führten Inkubationen von G0-OVA-AuNCs und OVA-AuNCs mit zwei verschiedenen Pflanzenlektinen durch, Bandeiraea simplicifolia lectin-II (BSL-II) spezifisch für terminale GlcNAc-Einheiten und Solanum tuberosum Lektin (STL), das die in den N-Glykanen vorhandene Kern-Chitobiose erkennt [34, 42]. Zusätzlich und um alle unspezifischen Wechselwirkungen zwischen G0-OVA-AuNCs und Lektinen zu verwerfen, Aleuria aurantia Lektin (AAL), das für L-Fucose spezifisch ist, wurde als Kontrolle eingeschlossen. Wir fügten einer Lösung von G0-OVA-AuNCs (5/6) steigende Konzentrationen von BSL-II-, STL- und AAL-Lectinen hinzu. Nach Inkubation im Dunkeln wurden die Lösungen zentrifugiert und die Fluoreszenz des Überstands gemessen. Wie in Abb. 5 gezeigt, konnten wir nach Inkubation mit BSL-II und STL konzentrationsabhängig eine Abnahme der Fluoreszenzintensität beobachten (Abb. 5a–d), während die Fluoreszenzintensität in Gegenwart von AAL unverändert blieb (Abb . 5e). Nach der Inkubation von GO-OVA-AuNCs (5/6) mit STL wurde ein sichtbarer Niederschlag unter UV-Lampenbestrahlung beobachtet, wohingegen bei Inkubation mit AAL kein Niederschlag auftrat (Fig. 5f). Das Verhältnis der anfänglichen Fluoreszenzwerte (F0) zu den Endwerten (F) nach der Lektininkubation wurde gegen steigende Konzentrationen von Lektinen dargestellt (Abb. 5b, d). Die STL-Interaktion mit G0-OVA-AuNCs (5/6) zeigte eine Linearität von 0 bis 7,5 μM und die Nachweisgrenze wurde basierend auf der Gleichung SD*3/S berechnet (wobei SD die Standardabweichung der Kalibrierungskurve ist und S ist der Steigungswert) [12, 13] zu 2,35 μM (y = 1.95x +0,4266  , R ² = 0,97). Ebenso zeigte die BSL-II-Interaktion mit G0-OVA-AuNCs (5/6) eine Linearität von 0 bis 10 μM und die Nachweisgrenze (LOD) wurde mit 2,83 μM berechnet (y = 0,5687x +0,5838  , R ² = 0,965). Interessanterweise zeigten Cluster mit einer geringeren Anzahl an konjugierten Zuckern wie G0-OVA-AuNCs (2/3) (Zusatzdatei 1:Abbildung S7, AB) keine signifikante Änderung der Fluoreszenzintensität nach Zugabe von BSL-II und STL, was darauf hindeutet, dass fehlende Agglutination. Dieses Verhalten unterstreicht einen wichtigen Effekt der multivalenten Präsentation von Glykanen auf die Vernetzungsaktivität von Lektinen, selbst wenn nur kleine Unterschiede in der Glykandichte angewendet werden. Wichtig ist, dass keine Änderung der Fluoreszenzemissionsintensität von unkonjugierten OVA-AuNCs, die mit Lektinen inkubiert wurden, beobachtet wurde (zusätzliche Datei 1:Abbildung S7, C-D). Obwohl native Hühner-OVA eine einzelne N-verknüpfte Glykosylierungsstelle (Asn-292) enthält, die überwiegend mit viel Mannose oder weniger häufig hybriden und komplexen N-Glykanen substituiert ist [43], wird diese Zuckermodifikation weder von STL noch von BSL-II . erkannt , wahrscheinlich aufgrund der monovalenten Darstellung. Dies bestätigte das Vorhandensein einer spezifischen Kohlenhydrat-Lectin-Interaktion zwischen chemisch eingeführtem G0 auf G0-OVA-AuNCs und STL/BSL-II und schloss eine unspezifische Bindung von OVA-AuNCs an die Lektine aus. Wir sehen eine mögliche Anwendung dieses Systems zum Nachweis von Biomarkern für kohlenhydratbindende Proteine. Dennoch würde die Herstellung von Neoglykoproteinen mit einer hohen Anzahl von Glykankopien die Avidität des Konstrukts gegenüber dem gewünschten Lektin erhöhen und die Nachweisgrenze verbessern [44].

Lectin-Agglutinationsassays von G0-OVA-AuNCs (5/6). a Repräsentative Fluoreszenzspektren der Überstände von OVA-G0 (5/6)-AuNCs-Lösungen nach Inkubation mit BSL-II. b Darstellung von F0/F gegen steigende Konzentrationen von BSL-II. c Repräsentative Fluoreszenzspektren der Überstände von OVA-G0 (5/6)-AuNCs-Lösungen nach Inkubation mit STL. d Darstellung von F0/F gegen steigende Konzentrationen von STL. e Repräsentative Fluoreszenzspektren der Überstände von OVA-G0 (5/6)-AuNCs nach Inkubation mit AAL. f Bild entsprechend der Inkubation von G0-OVA-AuNCs (5/6) mit AAL und STL unter UV-Licht (365 nm). Nach Inkubation mit STL bildete sich ein sichtbarer Niederschlag. Rechts:schematische Darstellung der Bindung zwischen G0-OVA-AuNCs und Pflanzenlektin

Wir untersuchten auch die Interaktion von G0-OVA-AuNCs (5/6) mit STL in Gegenwart von zellulären Wachstumsmedien, um die mögliche Wirkung von Medienkomponenten bei Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungen zu unterscheiden. G0-OVA-AuNCs (5/6) wurden in komplettem Iscoves modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM), ergänzt mit fötalem Kälberserum, gelöst und mit steigenden Mengen an STL inkubiert; die resultierenden Lösungen wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert. (Zusatzdatei 1:Abbildung S8). Die elektrophoretische Mobilität von G0-OVA-AuNCs (5/6) bleibt sowohl in Wasser als auch in komplexem Medium erhalten. Nichtsdestotrotz gab es in Gegenwart zunehmender Mengen an STL eine dosisabhängige Verdrängung von G0-OVA-AuNCs (5/6) zum negativen Pol, was die Protein-Kohlenhydrat-Interaktion selbst in Gegenwart komplexer zellulärer Medien hervorhebt. Dies weist darauf hin, dass Protein-Kohlenhydrat-Wechselwirkungen mit G0-OVA-AuNCs (5/6) nicht durch die Anwesenheit von Medienkomponenten behindert werden.

Das Potenzial von Clustern für die Fluoreszenzbildgebung und der frühere Erfolg mit DCs, die durch G0-OVA-Neoglykoproteine ​​angreifen [21] ermutigten uns, G0-OVA-AuNCs in der Aufnahme durch Maus-DCs in vitro zu untersuchen. Wir verwendeten konfokale Fluoreszenzmikroskopie, um die Internalisierung von selbstfluoreszierenden G0-OVA-AuNCs (3/4) sichtbar zu machen. Milz-DCs wurden aus C57BL/6J-Mäusen und CD11c ⁺ . isoliert Population wurde durch magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) gereinigt (zusätzliche Datei 1:Abbildung S9) und über Nacht auf Poly-d-Lysin-beschichtete Glasdeckgläser ausgesät. Als Machbarkeitsnachweis wurden gereinigte DCs mit G0-OVA-AuNCs (3/4) inkubiert, gewaschen, um ungebundene Materialien zu entfernen, und fixiert. Nach 40 Minuten Inkubation wurden konfokale Fluoreszenzmikroskopiebilder aufgenommen (Abb. 6) und wir beobachteten eine starke Fluoreszenz bei dendritischen Zellen, die mit G0-OVA-AuNCs (3/4) inkubiert wurden, was ihre effektive Internalisierung (Abb. 6a) und das Fehlen von Fluoreszenz demonstrierte. in der Negativkontrolle (unstimuliertes CD11 ⁺ Zellen; Zusätzliche Datei 1:Abbildung S9). Die Internalisierung von Nanoclustern wurde durch Stapeln einzelner DC-Bilder entlang ihrer Z . weiter bestätigt -Achse (z-Stapel) und durch Rekonstruktion eines 3D-Bildes einer einzelnen DC zur Visualisierung der Fluoreszenzemission aus dem Inneren der Zelle (Abb. 6b und Zusatzdatei 1:Abbildung S10).

Aufnahme von G0-OVA-AuNCs (3/4) durch Maus-DCs, gemessen durch konfokale Mikroskopie. a Repräsentative Bilder von CD11c ⁺ Zellen nach Inkubation mit G0-OVA-AuNCs (3/4). b Z-Stapelbild einer einzelnen dendritischen Zelle, die die Aufnahme von G0-OVA-AuNCs innerhalb der Zelle darstellt

Zusammenfassend haben wir Neoglykoprotein-geschützte Gold-Nanocluster hergestellt und charakterisiert, die in Agglutinationsexperimenten und in DCs-Aufnahmetests verwendet wurden. Am Beispiel der spezifischen pflanzlichen Lektinerkennung haben wir die Nützlichkeit von G0-OVA-AuNCs für die Analyse von Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungen gezeigt. Wir zeigten auch die In-vitro-Bildgebung von dendritischen Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie. Es müssen jedoch weitere Experimente durchgeführt werden, um erstens die Rolle von Glykan bei der Aufnahme von Nanoclustern durch DCs besser zu verstehen (z. B. indem die Lokalisation von Nanoclustern in den Zellkompartimenten verfolgt wird) und zweitens ihre Bio- und Zytokompatibilität zu untersuchen. Basierend auf unseren früheren Ergebnissen, die die Targeting-Eigenschaften von G0-Glykan und die Erhöhung der G0-OVA-Aufnahme durch DCs im Vergleich zu unkonjugiertem OVA beschreiben, glauben wir, dass G0-OVA-AuNCs eine attraktive Alternative zu fluoreszenzmarkierten Neoglykoproteinen werden könnten.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend präsentieren wir in dieser ersten Studie die erste Synthese von Neoglykoprotein-geschützten Goldnanoclustern und die Bewertung ihrer physikalischen und optischen Eigenschaften im Vergleich zu unkonjugierten Proteinclustern. Wir bestätigten die Zugänglichkeit von Zucker G0 auf AuNCs in Agglutinationsassays durch spezifische Interaktionen mit Pflanzenlektinen, was zusätzlich die Bedeutung einer minimalen Glykandichte für die effektive Vernetzungsaktivität von Lektinen hervorhob. Als Machbarkeitsnachweis haben wir auch die Eignung von G0-OVA-AuNCs für die Bildgebung von murinen DC-Modellen nachgewiesen.

Wir glauben, dass selbstfluoreszierende Neoglycoprotein-funktionalisierte AuNCs zu attraktiven Werkzeugen werden könnten, die die Analyse und Anwendung von Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungen ermöglichen. Aufgrund ihrer einzigartigen physikalischen und chemischen Eigenschaften, wie große Stokes-Verschiebungen, Wasserlöslichkeit oder pH-Stabilität, könnten G0-OVA-AuNCs eine Alternative zu organischen Farbstoffmarkierungen werden und für die Visualisierung von DCs, kohlenhydratvermittelte Aufnahmestudien und pflanzliche . verwendet werden Lektin-Erfassung. Schließlich könnten Neoglykoprotein-funktionalisierte Gold-Nanocluster durch den Einsatz immunogener Träger wie OVA zur Anlagerung von Glykanen nicht nur eingehende Studien der Antigenaufnahme, -prozessierung und -präsentation ermöglichen, sondern könnten in Zukunft auch als fluoreszierende Therapeutika Anwendung finden oder Hilfsmoleküle.

Methoden/Experimental

Materialien

Alle Lösungen wurden in nanoreinem Wasser (18 MΩ cm) aus einem Diamond UV-Wasserreinigungssystem (Branstead International, IA, Madrid, Spanien) hergestellt. Alle zur Herstellung von AuNCs verwendeten Glaswaren wurden zuvor mit Königswasserlösung (HNO₃ :HCl, 1:3, v /v ) und ausgiebig mit Nanopure-Wasser gespült. Gold(III)-chloridtrihydrat, Natriumhydroxid und Triethylamin wurden von Sigma Aldrich bezogen. LPS-freies Ovalbumin wurde von Hyglos (Bernried, Deutschland) bezogen. Disuccinimidylsuberat (DSS) und DMSO wurden von Thermo Fisher Scientific bezogen. N-Glykan G0 wurde wie zuvor beschrieben chemisch synthetisiert [21].

AuNCs-Synthese. Allgemeines Verfahren

Zu einer gerührten Lösung von OVA oder Neoglykoprotein (15 mg ml ^-1 ) in nanoreinem Wasser, einer wässrigen 0,1 M Lösung von HAuCl₄ ·3H₂ O (4,2 mM, Endkonzentration) wurde tropfenweise zugegeben. Die resultierende Mischung wurde 5 min bei Raumtemperatur gerührt und wässrige 1 M NaOH-Lösung (150 mM Endkonzentration) wurde tropfenweise zugegeben, um den pH-Wert der Mischung zu erhöhen. Die resultierenden Lösungen wurden bei 100 °C für 6 Minuten in einem Biotage® Initiator-Mikrowellenreaktor inkubiert. Die Dialyse von AuNCs wurde auf Slide-Z-lyser TM -Dialysekassetten (10 K MWCO) von Thermo Fisher Scientific über nanoreinem Wasser durchgeführt.

Fluoreszenzemissionsspektren von synthetisierten OVA- und Neoglykoprotein-geschützten AuNCs wurden mit Nunc™ 96-Well Polystyrol Black Plates auf einem Varioskan Flashmicroplate Reader (Thermo Scientific) mit einer Anregungswellenlänge bei λ 350 nm und einer ScanIt-Software gemessen.

Agarosegelelektrophorese von OVA-AuNCs und OVA-Protein wurde in 0,75% Agarosegel bei 80 V für 30 Minuten durchgeführt. Die Visualisierung von OVA-geschützten AuNCs wurde unter UV-Licht-Bestrahlung (365 nm) durchgeführt und das OVA-Protein wurde mit Coomassie Blue G-250 gefärbt.

Die TEM-Bildgebung wurde an einem JOEL JEM-2100F-Feldemissions-TEM mit einer Beschleunigungsspannung von 200 kV durchgeführt. AuNCs-Lösungen wurden auf Kupfer-TEM-Gitter gegossen, die mit einem ultradünnen Kohlenstoffträger beschichtet waren (Ted Pella, Redding, USA). Der durchschnittliche Durchmesser des Gold-Nanoclusters wurde mit ImageJ (Java) quantifiziert.

Inkubation von G0-OVA-AuNCs (5/6) mit Pflanzenlektinen

Zehn Mikroliter G0-OVA-AuNCs (5/6) [0,2 mg ml ⁻¹ ] in TSM-Puffer (20 mM Tris·HCl, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl₂ , 2 mM MgCl₂ , pH =7,4) wurden auf eine Nunc TM 384-Well-Polystyrol-Schwarzplatte gegeben. Anschließend 10 μL Aleuria aurantia Lektin (AAL), Solanum tuberosum Lektin (STL) und Bandeiraea simplicifolia-Lektin-II (BSL-II) in TSM-Puffer wurden zugegeben, was zu Proteinendkonzentrationen von 0, 2,5, 5, 7,5, 10 μM führte. Die entsprechenden Lösungen wurden über Nacht im Dunkeln unter leichtem Schütteln inkubiert. Proteinlösungen wurden 1 h bei 11.000 g zentrifugiert und die Fluoreszenzemissionsspektren der Überstände wurden mit einem Varioskan Flash-Mikroplattenlesegerät (Thermo Scientific) mit einer Anregungswellenlänge bei λ 350 nm aufgenommen. Um die Fällung bei der Bildung von AuNCs-Lectin-Komplexen zu beobachten, wurde ein Kontrollexperiment durchgeführt. Dann 10 μl G0-OVA-AuNCs (5/6) [0,2 mg ml ⁻¹ ] wurde 1 h mit 10 μL AAL und STL [40 μM] inkubiert, gefolgt von einer Zentrifugation bei 11.000 g (1 h). Die Bilder wurden unter UV-Licht-Bestrahlung (365 nm) aufgenommen.

Isolierung von dendritischen Zellen der Mausmilz

Dendritische Mauszellen, die in allen Experimenten verwendet wurden, wurden aus C57BL/6J-Mäusen isoliert, die von Charles River (CIC biomaGUNE, San Sebastian, Spanien) gezüchtet wurden. Tierversuchsprotokolle wurden von der Tierethikkommission von CIC biomaGUNE genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien und -Richtlinien der Europäischen Union zu Tierethik und Tierschutz durchgeführt. Die Mäuse wurden unter herkömmlichen Haltungsbedingungen (22 ± 2 °C, 55 ± 10 % Luftfeuchtigkeit und 12-Stunden-Tag/Nacht-Zyklus) gehalten und nach Belieben mit einer Standarddiät gefüttert. Mäuse wurden mit 2,5 % Isofluran in 100 % O₂ . anästhesiert und durch zervikale Luxation eingeschläfert.

Milzen wurden von C57BL/6J-Mäusen (n = 3, weiblich, 27–28 Wochen alt). Um Milzzellen zu isolieren, wurde die Milz mit Iscoves modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) gespült, das mit 2 mM l-Glutamin, 100 E/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 10 % fötalem Kälberserum (FCS; PAN Biotech) ergänzt war. Die Zellsuspension wurde kalt gehalten und durch ein 40 μm-Zellsieb filtriert, um Zellaggregate zu entfernen. Nach der Zentrifugation (300 g, 5 min, 4 °C) wurden die Zellpellets in 5 ml frisch zubereitetem Erythrozyten-Lysepuffer (10 % 100 mM Tris pH 7,5 + 90 % 160 mM NH₄ .) resuspendiert Cl), vorsichtig gemischt und 2 min bei RT inkubiert. Die Zellen wurden zweimal in vollständigem IMDM-Medium gewaschen und vor der Resuspendierung in MACS-Puffer (PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA) zentrifugiert. Dendritische Zellen (CD11c ⁺ Zellen) wurden aus einer Suspension von C57BL/6 murinen Milzzellen durch magnetisch aktivierte Zellsortierung unter Verwendung von CD11c ⁺ . isoliert Mikroperlen (Miltenyi). Mit magnetischen Mikrokügelchen inkubierte Zellen wurden auf eine MACS-Säule geladen, die in einem Magnetfeld platziert wurde. Ungebundene Zellen passierten die Säule, während CD11c ⁺ . übrig blieb Zellen wurden mit MACS-Puffer gewaschen und von der Säule eluiert. Um die DC-Reinheit zu erhöhen, ist der CD11c ⁺ Die Zellreinigung wurde wiederholt. Die Zellsuspension wurde zentrifugiert, in IMDM-Vollmedium resuspendiert und gezählt.

Aufnahme von G0-OVA-AuNCs (3/4) durch DCs

CD11c ⁺ Zellen von C57BL/6J-Mäusen (2 × 10 ⁶ Zellen) wurden über Nacht auf mit Poly-d-Lysin beschichteten Glasdeckgläsern ausgesät. G0-OVA-AuNCs (3/4) were added to cells (150 μg mL ⁻¹ ) and incubated for 40 min at 37 °C. After incubation, cells were carefully washed with cooled PBS and fixed with 3% paraformaldehyde at RT for 20 min. After washing with PBS and water, the cover-slips were mounted on slides using Vectashield® mounting medium. Fluorescent images were taken using the Zeiss LSM 510 laser scanning confocal microscope (Carl Zeiss) equipped with a UV laser (365 nm) and × 63 oil immersion objective.

Abkürzungen

AAL:

Aleuria aurantia lectin

AuNCs:

Gold nanoclusters

BSA:

Rinderserumalbumin

BSL-II:

Bandeiraea simplicifolia lectin-II

CD:

Circular dichroism

CLRs:

C-type lectin receptors

DCs:

Dendritic cells

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

DSS:

Disuccinimidyl suberate ester

FBS:

Fötales Rinderserum

G0:

Biantennary N-glycan

G0-OVA-AuNCs:

Neoglycoprotein functionalized gold nanoclusters

HAuCl₄ ^. ₃ H₂ O:

Gold tetrachloroauric (III) acid

IMDM:

Iscove’s modified Dulbecco’s medium

IR:

Infrarot

LOD:

Nachweisgrenze

MACS:

Magnetic-activated cell separation

OVA:

Ovalbumin

QY:

Quantum yield

STL:

Solanum tuberosum lectin

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

XPS:

Röntgenphotoelektronenspektroskopie