Neoglykoprotein-funktionalisierte fluoreszierende Gold-Nanocluster für Pflanzenlektin-Detektion und dendritische Zellbildgebung

Zusammenfassung

Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungen bilden die Grundlage essenzieller biologischer Prozesse wie Befruchtung, Signaltransduktion und Wirt-Pathogen-Kommunikation. Die komplexe Natur der Glykanerkennung erfordert fortschrittliche Analysetools. Hier berichten wir über die erste Synthese von neoglykoprotein-funktionalisierten fluoreszierenden Gold-Nanoclustern (G0-OVA-AuNCs), die ein biantennäres N-Glykan (G0) als Targeting-Ligand, Ovalbumin als Trägerprotein und einen selbst-emittierenden Goldkern kombinieren. Wir demonstrieren, dass G0-OVA-AuNCs als selektive Sensoren für Pflanzenlektine und als potente Bildgebungsonden für murine dendritische Zellen dienen.

Einleitung

Gold-Nanocluster (AuNCs), bestehend aus 10–100 Goldatomen, zeigen größenabhängige Fluoreszenz, die sie attraktiv für Biosensing und Bildgebung macht. Im Gegensatz zu herkömmlichen organischen Farbstoffen oder Quantenpunkten besitzen AuNCs einen großen Stokes-Shift, rot-bis-nahinfrarote Emission und überlegene photochemische Stabilität, was Anwendungen im Gewebetransparenzfenster ermöglicht. Protein-templatierte AuNCs wurden erstmals 2009 mit bovinem Serumalbumin berichtet und sind seither zu einer vielseitigen Plattform für das Design wasserlöslicher, biokompatibler Fluorophore geworden. Glykosylierte Proteine bleiben jedoch als Nanocluster-Gerüste unerforscht, trotz der kritischen Rolle von Glykanen bei der Modulation von Protein-Faltung, Stabilität und Rezeptorbindung. Synthetische Neoglykoproteine – Proteine, die chemisch mit definierten Kohlenhydraten konjugiert sind – bieten eine Strategie, Proteine mit neuen funktionalen Eigenschaften auszustatten, während ihre strukturelle Integrität erhalten bleibt.

In dieser Studie nutzten wir ein synthetisches biantennäres G0-Glykan, das über einen C5-Amino-Linker und Disuccinimidylsuberat an Ovalbumin (OVA) konjugiert wurde, um G0-OVA-AuNCs zu generieren. Wir untersuchten ihre physikochemischen Eigenschaften, bewerteten die Glykanzugänglichkeit durch Lektin-Agglutinationsassays und evaluierten ihre Kapazität, dendritische Zellen (DCs) in vitro zu markieren. Die Ergebnisse etablieren G0-OVA-AuNCs als robuste, multivalente Lektinsensoren und potente Bildgebungsagenten für Immunzellen.

Ergebnisse und Diskussion

Wir optimierten die Synthese von G0-OVA-AuNCs durch Anpassung eines Protokolls für unkonjugierte OVA-AuNCs. Eine 15 mg ml⁻¹ OVA-Lösung wurde mit HAuCl₄·3H₂O (4,2 mM) und NaOH (150 mM) unter Mikrowellenbestrahlung (100 °C, 6 min) gemischt, was hellbraune Cluster ergab, die bei 350 nm Anregung hellrote Fluoreszenz bei 670 nm emittieren. UV-Vis-Spektren zeigen keine Plasmonenresonanzbande, was Partikelgrößen unter 5 nm bestätigt; TEM ergab einen durchschnittlichen Kerndurchmesser von 1,9 ± 0,7 nm, und dynamische Lichtstreuung zeigte einen hydrodynamischen Durchmesser von 8,7 ± 2,5 nm, konsistent mit einem einzelnen Protein, das den Kern einkapselt. Die Cluster wiesen einen Quantenausbeute von ~4 % auf und blieben photostabil über pH 3–11 und in fetalem bovinem Serum, was ihre Eignung für biologische Assays anzeigt.

Für G0-funktionalisierte Cluster wurden G0-Glykane mittels DSS an OVA konjugiert, was Neoglykoproteine mit 2–3, 3–4 oder 5–6 Glykanen pro Protein ergab (verifiziert durch SDS-PAGE und MALDI-TOF). Die anschließende AuNC-Bildung unter identischen Bedingungen produzierte G0-OVA-AuNCs, deren optische Eigenschaften denen von OVA-AuNCs entsprachen: Absorption bei 278 nm und ein 670 nm Emissionspeak. TEM bestätigte einen Kerndurchmesser von 1,6 ± 0,5 nm. CD-Spektren wiesen auf eine Random-Coil-Sekundärstruktur hin, wahrscheinlich aufgrund der alkalischen Synthese, doch die Glykanreste blieben für Lektinbindung zugänglich.

Lektin-Agglutinationsassays mit Bandeiraea simplicifolia Lektin-II (BSL-II) und Solanum tuberosum Lektin (STL) zeigten konzentrationsabhängige Fluoreszenzlöschung für G0-OVA-AuNCs (5/6), während ein Kontrolllektin (Aleuria aurantia, AAL) keine Wirkung zeigte. Die Löschung folgte linearen Kalibrierkurven, mit Detektionsgrenzen von 2,83 µM (BSL-II) und 2,35 µM (STL). G0-OVA-AuNCs mit weniger Glykanen (2/3) agglutinierten nicht, was die Notwendigkeit multivalenter Glykanpräsentation unterstreicht. Agarosegelektrophorese in Zellkulturmedien bestätigte, dass Lektinbindung in komplexen biologischen Umgebungen effizient blieb.

Confokalmikroskopie von murinen splenischen DCs (CD11c⁺), inkubiert mit G0-OVA-AuNCs (3/4), demonstrierte rasche Internalisierung innerhalb von 40 min, mit intrazellulär lokalisierter Fluoreszenz und Abwesenheit in unbehandelten Kontrollen. 3D-Rekonstruktionen bestätigten die intrazelluläre Clusterverteilung.

Zusammenfassend präsentieren wir die ersten neoglykoprotein-geschützten AuNCs, demonstrieren ihre selektive Lektinerkennung über multivalente Glykane und etablieren ihre Kapazität zur Bildgebung dendritischer Zellen. Ihre robuste Fluoreszenz, wässrige Löslichkeit und pH-Stabilität machen sie zu vielversprechenden Alternativen zu herkömmlichen Farbstoffen für Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungsstudien und immunologische Bildgebung.

Schlussfolgerungen

Wir synthetisierten und charakterisierten G0-OVA-AuNCs erfolgreich, bestätigten Glykanzugänglichkeit und lektinspezifische Agglutination. Die multivalente Glykandarstellung war essenziell für effizientes Quervernetzen, während die Cluster hohe Photostabilität und wässrige Löslichkeit beibehielten. In-vitro-Bildgebung muriner dendritischer Zellen validierte die Cluster als potente, selbstfluoreszente Sonden. Diese Befunde unterstützen die weitere Erforschung neoglykoprotein-funktionalisierter AuNCs als vielseitige Werkzeuge für Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungsassays, Immunzellbildgebung und potenzielle therapeutische Anwendungen.

Methoden/Experimentell

Materialien

Alle Lösungen wurden in ultrapurem Wasser (18 MΩ cm) hergestellt. Gold(III)-chlorid-trihydrat, NaOH und Triethylamin stammten von Sigma-Aldrich. Ovalbumin wurde von Hyglos bezogen. DSS und DMSO kamen von Thermo Fisher. G0-Glykan wurde wie zuvor beschrieben synthetisiert.

AuNC-Synthese. Allgemeines Verfahren

15 mg ml⁻¹ Protein in ultrapurem Wasser wurde mit 4,2 mM HAuCl₄·3H₂O gemischt, 5 min gerührt, dann 150 mM NaOH zugegeben. Das Gemisch wurde in einem Mikrowellenreaktor bei 100 °C für 6 min erhitzt. Cluster wurden dialysiert (10 kDa MWCO) gegen ultrapures Wasser. Fluoreszenz wurde auf einem Varioskan Flash Plattenleser aufgezeichnet (λ_ex=350 nm). Agarosegel (0,75 %) und TEM (200 kV) wurden für Größencharakterisierung verwendet. CD bewertete Sekundärstruktur. XPS bestimmte Goldoxidationszustände.

Lektin-Agglutinationsassay

G0-OVA-AuNCs (0,2 mg ml⁻¹) wurden mit Lectinen (AAL, STL, BSL-II) bei 0–10 µM in TSP-Puffer gemischt. Nach übernächtiger Inkubation wurden Proben zentrifugiert und Überstandsfluoreszenz gemessen. Fällung wurde unter UV für STL beobachtet.

Isolierung muriner splenischer DCs

Milzen von C57BL/6J-Mäusen wurden zu Einzelzellsuspensionen verarbeitet. CD11c⁺ Zellen wurden durch magnetisch aktivierte Zellsortierung (Miltenyi) isoliert und auf Poly-D-Lysin-beschichteten Deckgläsern kultiviert.

DC-Aufnahme von G0-OVA-AuNCs

DCs (2 × 10⁶ Zellen) wurden mit 150 µg ml⁻¹ G0-OVA-AuNCs (3/4) für 40 min bei 37 °C inkubiert, gewaschen, mit 3 % PFA fixiert und an einem Zeiss LSM 510 Confokalmikroskop (365 nm Laser, 63× Öl-Objektiv) abgebildet.

Abkürzungen

AAL:

Aleuria aurantia Lektin

AuNCs:

Gold-Nanocluster

BSA:

Bovines Serumalbumin

BSL-II:

Bandeiraea simplicifolia Lektin-II

CD:

Zirkulärer Dichroismus

CLRs:

C-Typ Lektin-Rezeptoren

DCs:

Dendritische Zellen

DMSO:

Dimethylsulfoxid

DSS:

Disuccinimidylsuberat-Ester

FBS:

Fetales bovines Serum

G0:

Biantennäres N-Glykan

G0-OVA-AuNCs:

Neoglykoprotein-funktionalisierte Gold-Nanocluster

HAuCl₄·3H₂O:

Gold(III)-chlorid-trihydrat

IMDM:

Iscove's modifiziertes Dulbecco-Medium

IR:

Infrarot

LOD:

Detektionsgrenze

MACS:

Magnetisch aktivierte Zellseparation

OVA:

Ovalbumin

QY:

Quantenausbeute

STL:

Solanum tuberosum Lektin

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

XPS:

Röntgenphotoelektronenspektroskopie