Ergänzung von ELISA und einer ineinandergreifenden Elektrodenoberfläche bei der Funktionalisierung von Goldnanopartikeln zum effektiven Nachweis von Defekten bei der Blutgerinnung beim Menschen

Einführung

Die Verbesserung aller Aspekte an der Spitze der Medizin ist zwingend erforderlich, um ein gesundes menschliches Leben zu erhalten und die Lebensdauer zu verlängern. Die Diagnose von Krankheiten ist einer der großen Bereiche im medizinischen Bereich, der zur leichteren Identifizierung von Krankheiten und Behandlungen weiter verbessert werden sollte. Andererseits müssen epidemische Krankheiten wie Influenza und Denguefieber im Anfangsstadium erkannt werden, um eine Ausbreitung zu vermeiden [1,2,3]. Es gibt verschiedene Diagnostika, deren Echtheitsnachweis über eine Vielzahl von Biomarkern nachgewiesen wurde [4, 5]. Unter den bisher entwickelten Diagnosesystemen gilt der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) weithin als „Goldstandard“ zur Identifizierung der wichtigsten viralen und bakteriellen Erkrankungen und molekularen Spezies [6, 7]. Mit ELISA wurden verschiedene Strategien mit ansprechenden Eigenschaften wie Benutzerfreundlichkeit, Präzision und niedrigere Nachweisgrenze entwickelt. Darüber hinaus ist in der Praxis die gleichzeitige Erkennung verschiedener Krankheiten und die Verwendung zum Screening auf die wichtigsten Krankheiten üblich [8,9,10]. ELISA ist ein Immunoassay zum Nachweis des interessierenden Ziels unter Verwendung des entsprechenden Antikörpers auf Polystyrol (PS) 96-Well-Platten. Die Sensitivität und Selektivität der Zielmoleküle hängt stark von verschiedenen Faktoren im ELISA ab, wie der Bindungsaffinität von Ziel und Antikörper, der Interaktion von Primär- und Sekundärantikörpern und der effizienten Zielimmobilisierung auf der ELISA-Oberfläche. Insbesondere die Immobilisierung des Targets auf der PS-Platte spielt eine entscheidende Rolle bei der Begrenzung des Nachweises. Antikörper oder Protein können durch die Wechselwirkung hydrophober Gruppen mit dem Antikörper physikalisch an der Oberfläche von PS adsorbieren [11]. Es gibt einige Möglichkeiten, beispielsweise eine schwache Bindung des Antikörpers (oder Proteins) oder die Instabilität des Antikörpers auf der PS-Platte und die ungleichmäßige Verteilung des Antikörpers (oder Proteins), die zu Defekten beim Nachweis führen. Es wurde nachgewiesen, dass die richtige Ausrichtung des Antikörpers auf der immobilisierten Platte die Detektion im Vergleich zu den zufällig immobilisierten Molekülen um das 64-fache verbessert [12, 13]. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, das geeignete Verfahren zur effizienten Immobilisierung von Protein oder Antikörpern auf der PS-Platte zu finden. Verschiedene Forscher nutzen die Immobilisierung von Proteinen auf PS-ELISA-Platten durch chemische oder physikalische Prozesse, wie eine photochemische Reaktion, die durch Polyvinylbenzyllactonoylamid unterstützt wird, und die Immobilisierung von Protein in Gegenwart eines Detergens [14,15,16]. Dixit et al. [8] haben die Antikörper auf der aminmodifizierten PS-Platte immobilisiert, um die Nachweisgrenze zu verbessern, und sie zeigten, dass die Vormischung von (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES) und Antikörper vor dem Immobilisierungsschritt die Sensitivität um das 54-Fache im Vergleich zu den konventionellen ELISA und erreichte die Nachweisgrenze von 10 pM [8, 17].

In der vorliegenden Arbeit haben wir eine neue Methode der Proteinimmobilisierung auf PS ELISA-Platten vorgestellt, die durch Goldnanopartikel (GNPs) unterstützt wird. GNPs sind eines der mächtigsten Werkzeuge im Bereich der Sensorentwicklung. Sie bieten positive Eigenschaften wie leichte Dispergierbarkeit in Wasser, biologische Inertheit und gute Kompatibilität mit der Oberflächenfunktionalisierung und können auf einheitliche Nanogrößen zugeschnitten werden [18,19,20,21,22,23]. Es wurde nachgewiesen, dass GNP-konjugierte Antikörper die Nachweisgrenze mit Influenzavirus und FIX auf dem Waveguide-Mode-Sensor verbessern [21,22,23]. GNPs werden in allen Arten von Sensoren verwendet, einschließlich Waveguide-Mode-Sensoren, Oberflächenplasmonenresonanz und Raman-Spektroskopie für die Hochleistungsdetektion. Darüber hinaus wurden GNPs auch in kolorimetrischen Assays verwendet, bei denen die Konjugation von Aptamer oder Antikörper an GNP-Oberflächen verfolgt wurde, um den Analyten mit bloßem Auge nachzuweisen. Die Forscher konzentrieren sich auch auf die Verwendung von BSP in ELISA-Methoden, um den Nachweis zu verbessern [24]. Zuvor verbesserte GNP-konjugiertes Anti-Maus-IgG-HRP den Nachweis von Pb(II) und erreichte die Nachweisgrenze von 9 µg/ml [25]. Lakshmipriyaet al. haben herausgefunden, dass die Konjugation von primären und sekundären Antikörpern an GNPs den Nachweis des ESAT-6-Proteins verbessert, das an der Entstehung von Tuberkulose beteiligt ist [9, 26]. Hier verwendeten wir GNPs, um das Protein auf der PS-ELISA-Oberfläche mit der durch APTES unterstützten chemischen Modifikation zu immobilisieren. Dieser Ansatz umfasst zwei Schritte:Funktionalisierung der PS-Oberfläche mit Amingruppen unter Verwendung von APTES, gefolgt von der Immobilisierung von GNP-konjugiertem Protein auf der aminmodifizierten PS-Platte. Die Amingruppen des APTES können an COOH-Gruppen auf der PS-ELISA-Oberfläche binden. Andererseits können mit anionischen Citronen-Ionen stabilisierte GNP-konjugierte Proteine ​​durch elektrostatische Wechselwirkung an die kationischen APTES binden [11, 27, 28]. Die aminoterminalen Gruppen in den APTES verdrängen die Citratgruppen auf den GNPs und fixieren chemisch auf der PS-Platte [29]. Die positiv geladenen Amingruppen in APTES ziehen auch die negativ geladenen GNPs an. Darüber hinaus verändert die APTES-Behandlung das PS-Substrat, um es hydrophober zu machen [30].

Eine chemisch modifizierte ELISA-Platte und GNP-Konjugation wurden verwendet, um Faktor IX (FIX) aus der menschlichen Blutgerinnungskaskade nachzuweisen. FIX ist ein wichtiges Protein im Blutgerinnungssystem, und niedrigere Konzentrationen von FIX im Blutkreislauf führen zu einem Gerinnungsmangel. Die verstärkte Immobilisierung von FIX auf der ELISA-Platte durch GNPs ermöglicht einen potenziellen Weg zum Nachweis niedrigerer FIX-Spiegel. Die GNP-modifizierte ELISA-Platte zeigte eine drastische Verbesserung beim FIX-Nachweis. Darüber hinaus haben wir auch den Nachweis von FIX in Humanserum demonstriert, und die aktuelle Strategie kann mit ELISA zum Nachweis anderer Biomarker verwendet werden. Um die obige Studie mit dem ELISA-Substrat zu ergänzen, haben wir die obige Strategie auch auf eine andere weit verbreitete Interdigitalelektrodenoberfläche (IDE) in einem elektrochemischen dielektrischen Sensor angewendet, um reines FIX und FIX in einer verdünnten Humanserumprobe nachzuweisen (Abb. 1a, b). .

a Schematische Darstellung des GNP-unterstützten ELISA. GNP wurde mit Protein vorgemischt und auf einer APTES-modifizierten ELISA-Oberfläche immobilisiert. Dann wurden Antikörper zugegeben. Schließlich wurde Substrat für HRP verwendet, um das Ziel nachzuweisen. b Schematische Darstellung der BSP-gestützten IDE

Materialien und Methoden

Reagenzien und Biomoleküle

(3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES) und Humanserum wurden von Sigma-Aldrich (USA) bezogen. FIX-Protein und Anti-FIX-Antikörper stammten von Abcam (Malaysia). Anti-Maus-IgG-konjugierte Meerrettichperoxidase (Anti-Maus-Immunglobulin HRP) wurde von Thermo-Scientific (USA) bezogen. Die ELISA-Platte wurde von Becton Dickinson (Frankreich) bezogen. ELISA 5x Beschichtungspuffer wurde von BioLegend (UK) bezogen. Rinderserumalbumin (BSA) und HRP-Substrat wurden von Promega (USA) bezogen. Goldnanopartikel (GNPs) (10, 15 und 80 nm) wurden von Nanocs (USA) bezogen. Der analytische ELISA-Reader stammte von Fisher Scientific (Malaysia).

Optimierung mit Silanreagenz und BSP

Um die geeigneten Konzentrationen von APTES und GNPs zu optimieren, führten wir den Immobilisierungsprozess mit verschiedenen Kombinationen von APTES und GNPs auf der ELISA-Platte durch. Anfänglich wurde die ELISA-Platte mit 1 % KOH für 1 h hydroxyliert. Dann wurden 1,25, 2,5 und 5 % APTES auf separaten Vertiefungen der ELISA-Platte bei Raumtemperatur (RT) für 5 h verbunden. Danach wurden die verdünnten GNPs (in destilliertem Wasser) mit 25, 50 und 100 % Konzentration auf den APTES-modifizierten Oberflächen immobilisiert. FIX bei 200 &mgr;nM wurde dann an die GNP-Oberflächen binden gelassen. Die verbleibenden Bindungsstellen wurden dann unter Verwendung von 2% BSA blockiert, dann wurde eine 1:1000-Verdünnung des FIX-Antikörpers eingeführt, gefolgt von der Zugabe einer 1:1000-Verdünnung von Anti-Maus-IgG-HRP. Schließlich wurde das Substrat zugegeben, um die FIX-Wechselwirkung nachzuweisen. Die Wells wurden zwischen jedem Schritt fünfmal unter Verwendung von Waschpuffer (PBS-Puffer enthaltend 0,05% Tween 20, pH 7,4) gewaschen. Schließlich wurde die optische Dichte (OD) mit einem ELISA-Lesegerät bei 405 nm gemessen. In diesem Experiment wurden BSP mit einer Größe von 15 nm verwendet.

Bestimmung der erforderlichen BSP-Größe

Nach Bestimmung der geeigneten Konzentration von APTES und GNP-Verdünnung unter optimalen Bedingungen wurden 10, 15 und 80 nm GNPs für die FIX-Immobilisierung getestet, um die am besten geeignete Größe zu bestimmen. Es wurden die gleichen experimentellen Bedingungen wie oben angegeben verwendet. Für die FIX-Immobilisierung wurden 2,5% APTES und eine BSP-Verdünnung von 50% verwendet.

Spezifische und selektive Erkennung von FIX

Wir bestätigten auch die spezifische Bindung von Protein und Antikörper auf der ELISA-Platte. Dafür haben wir drei verschiedene Arten von Kontrollexperimenten verwendet. Wir immobilisierten die folgende Reihenfolge von Biomolekülen auf der ELISA-Platte, um als Kontrollen und spezifische Bedingungen zu dienen:Kontrolle 1 (C1), FIX-BSA-Anti-Maus-IgG-Substrat; Kontrolle 2 (C2), FIX-BSA-FIX-Antikörper-Substrat; Kontrolle 3 (C3), BSA-FIX-Antikörper-Anti-Maus-IgG-Substrat, spezifisch (S), FIX-BSA-FIX-Antikörper-Anti-Maus-IgG-Substrat.

Nachweis von GNP-konjugiertem FIX auf ELISA-Platten im Vergleich zu konventionellem ELISA

FIX wurde unter Verwendung der GNP-modifizierten ELISA-Platte durch zwei verschiedene Methoden nachgewiesen, wie APTES-GNP-FIX und APTES-GNP vorgemischter FIX, und diese Methoden wurden mit dem herkömmlichen ELISA verglichen. Die folgenden Schritte bilden die Verfahren. Herkömmlicher ELISA:(i) FIX-Protein wurde in 1× Beschichtungspuffer mit Konzentrationen von 0 bis 200 nM verdünnt, (ii) mit 2% BSA blockiert, (iii) FIX-Antikörper wurde mit einer Verdünnung von 1:1000 verdünnt, (iv) 1:1000 Verdünnung von Anti-Maus-IgG-HRP wurde zugegeben, (v) Substrat für HRP wurde zugegeben und bei 405 nm gemessen.

APTES-GNP-FIX (Methode 1):(i) PS-Platte wurde mit 1% KOH aktiviert, (ii) 2,5% APTES wurde bei RT für 5 h auf die ELISA-Platte gegeben, (iii) 25% der erhaltenen 15 nm GNP wurde zugegeben und über Nacht bei 4°C gehalten, (iv) FIX mit Konzentrationen von 0 bis 200 nM durfte unabhängig an die GNP-Oberfläche binden, (v) die verbleibende Oberfläche wurde durch 2% BSA blockiert, (vi) 1:1000 Verdünnung des FIX-Antikörpers wurde zugegeben, (vii) 1:1000 Verdünnung von Anti-Maus-IgG-HRP wurde zugegeben, (vii) Substrat für HRP wurde zugegeben und bei 405 nm gemessen

APTES-GNP vorgemischtes FIX (Methode 2):(i) PS-Platte wurde mit 1% KOH aktiviert, (ii) 2,5% APTES wurde bei RT für 5 h zugegeben, (iii) Vormischung von 25% 15 nm GNP-Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen von FIX (inkubiert bei RT für 30 min; 0 bis 200 nM) wurden auf der APTES-modifizierten Oberfläche immobilisiert, (iv) die verbleibende Oberfläche wurde durch 2% BSA blockiert, (v) wurde eine 1:1000 Verdünnung des FIX-Antikörpers hinzugefügt, (vi) 1:1000 Verdünnung von Anti-Maus-IgG-HRP wurde zugegeben, (vii) Substrat für HRP wurde zugegeben und bei 405 nm gemessen

Nachweis von FIX in Humanserum und nach dem Aufstocken von FIX

Um FIX in Humanserum nachzuweisen, haben wir das Serum hier mit GNPs anstelle von FIX vorgemischt. Serumverdünnungen von 20 bis 1280 wurden titriert und mit GNPs gemischt, um den Nachweis von FIX zu bewerten. Andere experimentelle Bedingungen und Konzentrationen wurden verwendet, ähnlich wie bei den vorherigen Experimenten.

Spiking-Experimente wurden durchgeführt, indem verschiedene Konzentrationen von FIX (0 bis 8 nM) in die optimierte Verdünnung von Humanserum dosiert und mit GNPs vor der Immobilisierung auf der ELISA-Platte vorgemischt wurden. Andere experimentelle Bedingungen und Konzentrationen wurden wie in den vorherigen Experimenten verwendet.

Fertigung von interdigitalen Elektroden

Der Oberflächenherstellungsprozess für verzahnte Elektroden (IDE) umfasst Wafer-Reinigung, Oxidschicht-Wachstum, negatives Photoresist-Spincoating, Photoresist-Strukturierung, Aluminiummetallabscheidung, Photoresist-Entfernung und Wafer-Dicing. Der Prozess wurde auf einem gepufferten Oxidätzmittel gereinigten Wafer eingeleitet, gefolgt von der Oxidation auf den Siliziumwafern (310 nm) bei hoher Temperatur (1000 °C), dann wurde der Ätzprozess unter Verwendung von Aluminium durchgeführt. Negativer Photoresist wurde durch Schleuderbeschichter mit einer Schleudergeschwindigkeit von 2000  /min abgeschieden. Der Resist wurde mit RD-6 entwickelt, nachdem er UV-Licht (240  s) ausgesetzt wurde. Dann wurde 240 nm Aluminium durch einen thermischen Verdampfer (Edwards Auto 306) bei 3,0E – 5 Torr abgeschieden. Der Fotolack wurde unter Verwendung von Aceton abgezogen, bis festes IDE erschien, dann gewürfelt, um einzelnes IDE zu erzeugen. Schließlich wurde die Zinkoxidschicht zur endgültigen biomolekularen Immobilisierung darüber gelegt [31]. Bevor mit der Zinkoxid-Anlagerung fortgefahren wurde, wurde die Sensoroberfläche zunächst mit 1 M Kaliumhydroxid (pH 9,0) gewaschen.

Erkennung von FIX auf einer GNP-modifizierten Oberfläche

Nach der Optimierung und Bestätigung der Nachweiseffizienz von FIX mit GNP-modifiziertem ELISA-Substrat wurde dieselbe Oberflächenmodifikation auf der IDE-Oberfläche durchgeführt, um den obigen Nachweis zu ergänzen. Anfänglich wurde die IDE-Zinkoxid-Oberfläche mit Amin modifiziert, indem 2,5% APTES, verdünnt in Ethanol, für 3 h bei RT zugegeben wurden. Danach wurde die Oberfläche fünfmal mit Ethanol gewaschen und die Vormischung aus GNPs (25%) und FIX zugegeben. Dann wurden die verbleibenden Oberflächen durch Ethanolamin blockiert und der FIX-Antikörper wurde als nächstes hinzugefügt, um FIX nachzuweisen. Die damit einhergehenden Veränderungen des Stromsignals wurden bemerkt. Um die Nachweisgrenze zu überprüfen, wurden verschiedene Konzentrationen von FIX unabhängig mit GNPs gemischt, auf der aminmodifizierten IDE-Oberfläche immobilisiert und dann vom Antikörper nachgewiesen; die Nachweisgrenze wurde durch 3σ-Rechnung bestimmt. Die Fülle von FIX im verdünnten Humanserum gemischt mit GNPs wurde auf der aminmodifizierten IDE-Oberfläche immobilisiert und dann durch seinen Antikörper nachgewiesen. Die Herstellung der obigen Oberfläche erfolgte wie zuvor beschrieben [31].

Ergebnisse und Diskussion

Vorbehandlung auf einer PS ELISA-Oberfläche

Eine wirksame Immobilisierung von Protein oder Antikörper auf der Polystyrol (PS) ELISA-Oberfläche verbessert offensichtlich die Nachweisgrenze der Ziel-Sonde-Interaktion. Für die Protein- oder Antikörperanlagerung auf der ELISA-Platte wurden verschiedene Immobilisierungsverfahren verwendet. In dieser Arbeit haben wir eine chemisch modifizierte ELISA-Oberfläche mit GNPs zur Protein- oder Antikörper-Immobilisierung eingeführt. Wir wollten einen der wichtigen Gerinnungsfaktoren wie Faktor IX (FIX) verwenden, von dem allgemein berichtet wurde, dass er wichtig ist [32,33,34,35,36]. Abbildung 1 zeigt die schematische Darstellung der Proteinimmobilisierung auf der Polystyrol-ELISA-Oberfläche. Zuerst wurde die ELISA-Oberfläche mit 1% KOH aktiviert. Ohne KOH-Vorbehandlung ist die Zahl der auf der PS-Oberfläche zu bindenden APTES-Moleküle minimal. Dies liegt an dem Fehlen von polaren und Wasserstoffbrückenbindungen akzeptierenden Gruppen, die die anfängliche Adsorption von APTES an Polymere erleichtern [11]. Nach der KOH-Behandlung wurde die Oberfläche mit einem Amin durch die entsprechende Konzentration von APTES modifiziert, um das BSP einzufangen.

Charakterisierung des BSP

Bevor wir fortfahren, haben wir die erhaltenen GNPs (15 nm) durch optische, morphologische und Größenverteilungsmessungen charakterisiert. Abbildung 2a zeigt die UV-Vis-Spektrophotometrie-Analyse der GNPs, die anscheinend die Peakmaxima bei 550 nm aufwies. Transmissionselektronenmikroskopische Beobachtungen zeigen, dass die GNPs ~ 15 nm groß und die Form gut ist (Abb. 2b und Einschub). Die Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie-Analyse wurde von der Wellenzahl von 500 bis 4000 cm ⁻¹ . durchgeführt (Abb. 2c). Ein scheinbarer einzelner Peak bei 1650 cm ⁻¹ wurde für das Gold zusammen mit einem weiteren kleineren Peak beobachtet, während das Vorhandensein von Peaks für Amingruppen die Anlagerung von APTES darstellt. Weitere Unterstützung lieferten die Volumenverteilungs- und Zetapotentialanalysen. Basierend auf dieser Analyse zeigt die Volumenverteilung, dass es eine leichte Variation in der Größenverteilung gibt (Abb. 2d) und dass das Zetapotential − 6,9 betrug, was die Stabilität des in dieser Studie verwendeten BSPs repräsentiert (Abb. 2e).

Charakterisierung von Gold-Nanopartikeln. Durchgeführt mit der optimalen Größe 15 nm. a UV-Vis-spektrophotometrische Analyse. Ein markanter einzelner Peak wurde bei 550 nm gefunden. b Beobachtung mit einem Transmissionselektronenmikroskop. Abbildungseinschub zeigt das vergrößerte Bild. Maßstabsleiste wird angezeigt. c Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie-Analyse. Scheinbare Peakpositionen für Gold und NH₂ Sind angegeben. d Volumenverteilungsanalyse des BSP. Die erhaltene Verteilung wird angezeigt. e Zeta-Potenzialanalyse. Der Wert war − 6,9

Vorbereitung und Optimierung der Aminoberfläche zum Einfangen von GNP

Die Menge an APTES beeinflusst stark die Immobilisierung von GNP oder Antikörper auf der PS-Oberfläche. Im Allgemeinen haben stark überfüllte APTES-Moleküle eine Wahrscheinlichkeit, falsch positive Ergebnisse zu erzeugen. Da APTES von 1 bis 2 % verwendet wurde, um den Antikörper in mehreren Sensoroberflächen zu immobilisieren, haben wir hier von 1,25 bis 5 % APTES titriert, das in absolutem Ethanol hergestellt wurde. Als nächstes wollten wir BSP auf den APTES-modifizierten Oberflächen immobilisieren. Es besteht die Möglichkeit, dass die höheren Zahlen von GNPs den Crowding-Effekt bewirken, daher wurden GNPs mit 25, 50 oder 100 % von 15 nm auf der APTES-modifizierten Oberfläche getestet, um die geeignete Verdünnung zu optimieren. Auf diesen modifizierten Oberflächen wurden 250 nM des FIX mit dem FIX-Antikörper nachgewiesen. Wie in Abb. 2a und b gezeigt, zeigen 1,25% APTES eine geringere optische Extinktion (OD) bei allen Verdünnungen von GNPs (25, 50 und 100%), während 2,5 und 5% APTES sowohl bei 50 als auch bei 100% von eine höhere Extinktion aufwiesen Bruttosozialprodukt. Gleichzeitig verbesserte sich das Signal-Rausch-Verhältnis mit steigender APTES- und GNP-Konzentration (Abb. 3a, b). Die 5 % APTES mit 50 und 100 % GNPs zeigten eine unspezifische Bindung, und 50 und 100 % GNPs mit 2,5 % APTES zeigten eine ähnliche Absorption. Basierend auf diesen erhaltenen Werten wählten wir 2,5 % APTES und 25 % Verdünnung des BSP für weitere Experimente.

Bestimmung der Beträge von APTES und BSP. Drei verschiedene Konzentrationen (1,25, 2,5 und 5%) von APTES wurden mit drei Verdünnungen von GNP (25, 50 und 100%) verwendet. a Visuelle Erkennung von FIX nach Zugabe des Substrats. Kontrollspuren ohne FIX wurden eingeschlossen. b Grafische Darstellung des optimalen APTES-Niveaus. Als optimal erwiesen sich 2,5 % APTES und 25 % BSP

Bestimmung der potenziellen BSP-Größe

Nach der Optimierung der APTES- und BSP-Verdünnung haben wir als nächstes die geeignete Größe der BSP bewertet. Da die Oberfläche eine entscheidende Rolle bei der Proteinimmobilisierung spielt, haben wir hier versucht, drei verschiedene Größen von GNPs zu immobilisieren, einschließlich 10, 15 und 80 nm. Unterschiedliche Größen von GNPs haben unterschiedliche Oberflächen und Ladungen, um das Protein anzuziehen, und auch die Bindungsfähigkeit auf der APTES-modifizierten Oberfläche ist unterschiedlich. Wie in Fig. 4a gezeigt, wurde 250 nM FIX mit der ELISA-Oberfläche nachgewiesen, die mit 10, 15 und 80 nm GNPs modifiziert wurde. Es wurde festgestellt, dass GNPs mit 15 und 80 nm fast die gleiche Absorption von 0,4 (OD) für den Nachweis von 250 nm FIX aufweisen, aber GNPs mit einer Größe von 10 nm nur 0,34 OD aufweisen. Aus diesem Experiment haben wir bestätigt, dass 15 oder 80 nm GNP für weitere Experimente geeignet sind, und wir fuhren mit 15 nm GNP fort.

a Bestimmung der idealen Größe des BSP. Von 10, 15 und 80 nm zeigten 15 und 80 nm ähnliche Ergebnisse. 15 Nanometer wurden verwendet, um die Nachweisgrenze mit FIX zu bestimmen. b Ein Kontrollexperiment zum Nachweis von FIX. Drei verschiedene Kontrollexperimente (C1 – ohne FIX-Antikörper; C2 – ohne Anti-Maus-IgG; C3 – ohne FIX) wurden durchgeführt. In keinem der Kontrollexperimente wurde ein signifikantes Signal gefunden. Abbildungseinsätze zeigen die visuellen Ergebnisse an

Experimentelle Strategien zur Bestätigung von Nonfouling und hoher Leistung

Vor dem Nachweis des FIX auf der GNP-modifizierten ELISA-Oberfläche führten wir drei verschiedene Arten von Kontrollexperimenten durch, wie im Abschnitt „Materialien und Methoden“ erläutert. Wie in 4b gezeigt, konnten wir in den Vertiefungen für die Kontrollexperimente 1, 2 und 3 (C1, C2 und C3) keine signifikante Absorption beobachten. In dem spezifischen Experiment (S) ist das höhere Absorptionsniveau eindeutig mit sichtbaren Farbänderungen verbunden. Im Fall von C1 haben wir keinen FIX-Antikörper hinzugefügt, was bestätigt, dass der FIX-Antikörper spezifisch mit FIX interagiert (in S). In Abwesenheit von Anti-Maus-IgG in C2 wurde kein beobachtbares Signal gefunden, was eine weitere Verankerung für die richtige Interaktion von FIX und Antikörper, gefolgt von Anti-Maus-IgG, ergibt. In C3 konnten wir in Abwesenheit von FIX die signifikante Extinktion nicht messen. Aus diesen Ergebnissen wurde die richtige Wechselwirkung von FIX mit seinem Antikörper auf der ELISA-Oberfläche ohne unspezifische Bindung bestätigt.

BSP-gestützter ELISA vs. konventioneller ELISA:Bestimmung der Sensitivität

Nach Durchführung der Kontrollexperimente haben wir FIX mit GNP-modifizierten Oberflächen nachgewiesen und die Ergebnisse mit der konventionellen ELISA-Methode verglichen. Wir führten drei verschiedene Experimente zum Nachweis von FIX durch. Zuerst wurde GNP auf APTES-modifizierten Oberflächen immobilisiert, und dann wurde FIX durch elektrostatische Wechselwirkung auf der Oberfläche von GNP angebracht. Aufgrund der elektrostatischen Wechselwirkung haben die meisten Proteine ​​die Möglichkeit, an die GNP-Oberfläche zu binden; Auf diese Weise konnten wir FIX auf der ELISA-PS-Oberfläche immobilisieren. Die Proteinimmobilisierung hängt auch von den Ladungen ab, die sich aus den Aminosäuren und dem BSP ergeben. Gopinathet al. [37] haben die starke Bindung von FIX an die GNP-Oberfläche bewiesen, und sie fanden auch, dass es unter Bedingungen mit hohem Salzgehalt stabil ist. Bei der zweiten Methode wurden GNP und Protein zunächst vorgemischt, bevor sie auf der aminierten ELISA-PS-Oberfläche immobilisiert wurden. Es wurde erwartet, dass auf diese Weise mehr Proteine ​​binden können, da die Wahrscheinlichkeit höher ist, dass Proteinmoleküle im Lösungszustand an die GNP-Oberfläche binden können. Die vorgemischte Lösung wurde dann auf den APTES-modifizierten Aminoberflächen immobilisiert. Diese Verfahren wurden mit dem herkömmlichen ELISA-Verfahren verglichen. Wie in Fig. 5a gezeigt, zeigte ein konventioneller ELISA (Methode 1) die Nachweisgrenze von 6 nM, wenn wir die FIX-Konzentration von 0 bis 200 nM titrierten. Die APTES-GNP-FIX-Methode (Methode 2) weist die Nachweisgrenze von 200 pM auf, was eine über 30-fach höhere Sensitivität im Vergleich zum herkömmlichen ELISA darstellt. Die Empfindlichkeitssteigerung wird durch die richtige Ausrichtung einer großen Anzahl von Antigenen erreicht, die auf der ELISA-PS-Platte immobilisiert sind, und letztendlich interagieren mehr Antikörper. In dieser Forschung wurden Goldnanopartikel verwendet, um mehr Antigene durch Aminmodifikation der ELISA-Platte zu immobilisieren. Beim herkömmlichen ELISA werden Antigene direkt auf der ELISA-Platte immobilisiert, was zu einer geringeren Anzahl von Molekülen, die an die Oberfläche binden, und zu einer verringerten Sensitivität gegenüber der derzeitigen Goldnanopartikel-vermittelten Strategie führt. Darüber hinaus führt die lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz zu einer weiteren Verbesserung der Empfindlichkeit, wie in den Studien mit GNPs gezeigt wurde. Wenn wir GNPs wie erwartet mit FIX vormischen, wurde die Nachweisgrenze stark verbessert und erreichte den Wert von 100 pM, was eine 60-mal höhere Sensitivität als herkömmliche ELISAs darstellt. Wie in Abb. 5a gezeigt, war deutlich zu erkennen, dass bei Verwendung von GNPs zur Proteinimmobilisierung die maximale Extinktion sowohl für vorgemischte als auch für direkt immobilisierte Proteine ​​auf den GNP-Oberflächen ~ 0,6 erreichte, die mit konventionellem ELISA gefundene Extinktion jedoch ~ 0,4 unter Verwendung von die ähnliche Konzentration (200 &mgr;nM) von FIX. Auch bei anderen Konzentrationen zeigte Methode 3 einen höheren Extinktionsunterschied im Vergleich zum herkömmlichen ELISA, und dieser war auch angemessen höher als bei Methode 2. Im Fall des herkömmlichen ELISA wurde der sichtbare Nachweis ab 25 nM und ab 3 nM . gefunden in Methode 2. Bei Methode 3 konnten wir die Farbänderung ab 200 pM FIX aufgrund der höheren Absorption sichtbar machen (Abb. 5a). Die Extinktion war in Methode 3 bei 25 nM gesättigt. Da wir die Farbänderungen ab 200 pM FIX visualisieren konnten, haben wir die Nachweisgrenze bewertet und mit den niedrigeren Konzentrationen von FIX titriert. Es war offensichtlich, dass die Nachweisgrenze 100 pM erreichte, als wir die GNPs und FIX vormischten (Abb. 5b).

a Vergleich der Sensitivität von FIX im GNP-modifizierten ELISA mit dem konventionellen ELISA. FIX wurde von 0,2 bis 200 &mgr;nM titriert. Herkömmlicher ELISA weist die Nachweisgrenze von 6 nM auf. Auf dem GNP-modifizierten ELISA wurde das Signal bis 200 pM beobachtet. Die Abbildung zeigt die visuellen Ergebnisse. b Nachweisgrenze von FIX auf einer GNP-modifizierten ELISA-Platte. FIX wurde von 25 bis 100 pM titriert. Als Nachweisgrenze wurde 100 pM gefunden. Abbildungseinsätze zeigen die visuellen Ergebnisse an

Nachweis von FIX in Humanserum und Verbesserung durch Spiking FIX

Da festgestellt wurde, dass FIX eine wichtige Rolle in der Gerinnungskaskade spielt [38, 39], wurde FIX nach Überprüfung der Nachweisgrenze auch in Humanserum nachgewiesen. Für diese Analyse haben wir das Humanserum im Bereich zwischen 1:1280 und 1:20 Verdünnungen titriert. Das verdünnte Serum wurde mit GNPs vorgemischt und auf der APTES-modifizierten ELISA-Oberfläche immobilisiert, wie oben angegeben. Es war offensichtlich, dass der FIX bei einer Verdünnung von 1:640 des Serums nachgewiesen wurde, was 125 pM FIX entspricht ( 6a ). Das gesunde Humanserum enthält normalerweise ungefähr 87 nM FIX, zusammen mit anderen wichtigen Proteinen wie Albumin und Globulin. Mit unserer Strategie haben wir die spezifische Nachweisgrenze von 125 pM im Humanserum erreicht, die zur Identifizierung eines Blutgerinnungsfehlers hilfreich ist. Auf der anderen Seite, als wir FIX von 1 bis 8 nM in die 1:640-Verdünnung des Humanserums versetzten, zeigte es Zunahmen der Extinktion, die gleichzeitig mit den FIX-Konzentrationen anstiegen (Abb. 6b).

a Nachweis von FIX in Humanserum. Humanserum wurde von 1:20 auf 1:1280 verdünnt. FIX wurde in 1:640 verdünntem Humanserum nachgewiesen (Abbildung innen zeigt die schematische Darstellung). b Aufstocken von FIX (0,125 bis 8 nM) in eine 1:640-Verdünnung von Humanserum. Mit zunehmender FIX-Konzentration wurde die Extinktion erhöht. Abbildungseinsätze zeigen die visuellen Ergebnisse an

Erkennung von GNP-FIX auf IDE-Oberfläche:Komplementationsanalyse

Da festgestellt wurde, dass GNP-konjugiertes FIX die Nachweisgrenze verbessert, haben wir eine ähnliche Strategie unter Verwendung des elektrochemischen Sensors mit IDE-Oberfläche angewendet, um diese Ergebnisse zu ergänzen. Wir titrierten das FIX von 25 bis 200 pM (gemischt mit GNPs), immobilisierten es auf der aminmodifizierten IDE-Oberfläche und detektierten es dann durch den FIX-Antikörper. Wie in 7a gezeigt, wurde mit der Erhöhung der FIX-Konzentration auch gleichzeitig der Strompegel gegenüber der Grundlinie erhöht. Der FIX-Spiegel war ab 200 pM gesättigt und die Nachweisgrenze lag bei 25 pM. Dieser Nachweis ist im Vergleich zu ELISA (100 pM) vierfach verstärkt. Außerdem wurde ein FIX-Nachweis im verdünnten Humanserum nachgewiesen (Fig. 7b). Für dieses Experiment wurde Humanserum von 1:80 auf 1:1280 verdünnt. Wie in der Abbildung gezeigt, zeigt die Verdünnung von 1:1280 (rote Kurve) einen offensichtlichen Unterschied zur Basislinie (schwarze Kurve) bei der 3σ-Schätzung, was darauf hinweist, dass der offensichtliche Nachweis von FIX aus Humanserum mit der Verdünnung von 1:1280 übereinstimmt mit den Ergebnissen aus ELISA (nachgewiesen bei 1:640). Der Nachweis von IDE mit geringerer Verdünnung zeigt den Anstieg der Empfindlichkeit.

a Limit of detection of FIX-conjugated GNP on IDE sensing surface. FIX was titrated from 25 to 400 pM. The limit of detection was found to be 25 pM. b Detection of FIX in human serum on the IDE sensing surface. Human serum was diluted from 1:80 to 1:1280. FIX was detected in human serum diluted 1:1280

Schlussfolgerung

Efficient immobilization of protein or antibody on the PS ELISA surface is a crucial step to improve the limit of detection. Here, we introduced a new and easy protein immobilization strategy on the PS ELISA surface assisted by GNPs. Two different methods were used:one is the direct immobilization of FIX on the GNP-modified surface, and another one is premixing of FIX with GNPs before attachment. It was found with the former method that improvement of the limit detection is 30-fold higher compared with the conventional ELISA. The latter method showed a 60-fold improved limit of detection compared to the conventional ELISA. We also demonstrated the detection of FIX in 1:650 diluted human serum, which is equivalent to 125 pM. Obviously, these strategies proved that the higher binding of proteins on the ELISA surface was able to improve the sensitivity and to be useful for detecting a wide range of biomarkers on the ELISA surface.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

All of the data are fully available without restriction.

Abkürzungen

APTES:

(3-Aminopropyl)triethoxysilane

BSA:

Rinderserumalbumin

COOH:

Carboxyl

ELISA:

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Fc:

Fragment kristallisierbar

GNP:

Gold nanoparticle

HRP:

Meerrettichperoxidase

IDE:

Interdigitated electrode

IgG:

Immunglobulin

OD:

Optische Dichte

PEG:

Polyethylenglykol

PS:

Polystyrol

PVLA:

Polyvinylbenzyllactonoylamid

TMB:

3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin