Hyaluronsäure-funktionalisierte Gadoliniumoxid-Nanopartikel für die Magnetresonanztomographie-geführte Strahlentherapie von Tumoren

Einführung

Die Strahlentherapie wurde in großem Umfang bei Krebs angewendet, bei der hochenergetische Röntgenstrahlen und die Ablagerung von Bestrahlungsdosen an Tumorstellen durch Schädigung durch freie Radikale oder DNA-Schäden verursacht werden [1, 2, 3, 4]. Eine geringe Strahlenempfindlichkeit, eine ungenaue Tumorlokalisation und eine schlechte Unterscheidung zwischen Läsionen und normalem Gewebe, die Bestrahlungsnebenwirkungen verursachen, schränken jedoch die klinische Anwendung der Strahlentherapie ein [5]. Daher ist es wichtig, Verfahren zur Verbesserung der Strahlenempfindlichkeit von Tumoren zu entwickeln, während systemische Nebenwirkungen minimiert werden. Eine Kombination aus Nanotechnologie und Strahlentherapie ist eine etablierte Priorität für die Strahlensensibilisierung.

In den letzten Jahren wurde die Nanotechnologie als attraktive Strategie für die Krebsdiagnose und -therapie angesehen [6,7,8,9,10,11]. Eine der Hauptfunktionen von Nanopartikeln (NPs) ist ein genaues Tumor-Targeting basierend auf der selektiven Anreicherung von NPs in Tumorgeweben über passives Targeting, den verbesserten Permeabilitäts- und Retentionseffekt (EPR), aktives Targeting und die verlängerte Zirkulationszeit [12, 13,14]. Unsere früheren Arbeiten haben gezeigt, dass das Dotieren von Kohlenstoff-NPs mit Heteroatomen ihre intrinsischen Eigenschaften effektiv abstimmt und vorteilhafte Eigenschaften einführt [15,16,17]. Interessanterweise können NPs als Radiosensibilisatoren verwendet werden [18]. Schwermetall-NPs (mit hohen Z-Elementen) (z. B. Au, Bi, Gd) als vielversprechende Radiosensibilisatoren können aufgrund ihres hohen Röntgenphotoneneinfangquerschnitts und des Compton-Streueffekts in der strahlensensibilisierenden Therapie verwendet werden [19]. Wenn Röntgenstrahlen mit Nanopartikeln mit hohem Z-Wert, Auger-Elektronen und Photoelektronen wechselwirken, schädigt die Freisetzung von Sekundärelektronen Krebszellen, was zu einer Dosiserhöhung während der Strahlentherapie führt [20]. Bisher haben sich Gadolinium-basierte NPs (GdNPs) als wirksame MRT-Kontrastmittel (CAs) erwiesen [21, 22] und unterscheiden nichtinvasiv und in Echtzeit normales Gewebe von erkranktem Gewebe und Läsionen. Diese Wirkstoffe verkürzen die Längsrelaxationszeit, um die Längsrelaxivität r . zu beeinflussen ₁ [23], und ihr ungenaues Targeting führt häufig zu Nebenwirkungen. Es ist allgemein bekannt, dass Hyaluronsäure (HA) ein Hauptligand und ein Träger für die Wirkstoffabgabe an Zielstellen mit HA-Rezeptoren wie der Cluster-Determinante 44 (CD44) ist [24,25,26].

Basierend auf den Ergebnissen früherer Studien haben wir HA als Targeting-Ligand verwendet, um Gd₂ . zu funktionalisieren O₃ NPs mit zweifacher Funktion:wirksame MRT-CAs zur Tumor-Targeting und Radiosensibilisatoren zur Überwindung der inhärenten Radioresistenz und der Ungenauigkeit der Tumorlokalisation. Außerdem HA-Gd₂ O₃ NPs zeigen eine hohe longitudinale Relaxivität (r ₁ ) als vielversprechende MR-Bildgebungsmittel mit besserer MR-Bildgebungsqualität. Verglichen mit derzeit verfügbaren CAs [27, 28] ist das resultierende HA-Gd₂ O₃ NPs weisen drei wesentliche Vorteile auf:erstens das HA-Gd₂ O₃ NPs weisen aufgrund der Verwendung der natürlichen extrazellulären Matrix als Vorläufer eine günstige Biokompatibilität auf. Zweitens verbessert die HA-Funktionalisierung das Tumor-Targeting signifikant und reduziert die Nebenwirkungen. Schließlich das HA-Gd₂ O₃ NPs besitzen bifunktionelle Fähigkeiten in Diagnose und Therapie. Um die Wirksamkeit zu überprüfen und den Mechanismus der Verbesserung der Radiosensibilisierung zu untersuchen, haben wir die radiosensibilisierende Wirkung von HA-Gd₂ . untersucht O₃ NPs zur Lebensfähigkeit von Tumorzellen, zum Zellzyklus und zur Apoptose.

Ergebnisse und Diskussion

Herstellung und Charakterisierung von HA-Gd₂ O₃ NPs

In dieser Studie wurde HA-Gd₂ O₃ NPs wurden erfolgreich mit einem einfachen hydrothermalen Verfahren hergestellt, wie in Schema 1 gezeigt. Die Partikelgrößen wurden durch dynamische Lichtstreuung analysiert, während die morphologische Untersuchung durch Transmissionselektronenmikroskopie durchgeführt wurde. Wie in Abb. 1a gezeigt, HA-Gd₂ O₃ NPs zeigten eine gleichmäßige Dispersion und diskrete quasisphärische Formen ohne offensichtliche Aggregation. Die durchschnittlichen Durchmesser des HA-Gd₂ O₃ NPs waren 105 nm. Im Vergleich zu normalem Gewebe war die kapillare Endothelpermeabilität von Tumorgeweben erhöht und der Endothelspalt betrug 100–600 nm [29]. Daher ließen sich NPs mit wünschenswerter Größe leicht in Tumorgewebe eintauchen, und sie können die Effizienz der passiven zielgerichteten Wirkstoffabgabe dramatisch steigern.

Schematische Synthese von HA-Gd₂ O₃ Nanopartikel aus der Hydrothermalmethode (A) und den folgenden biomedizinischen Anwendungen (B)

Charakterisierung von HA-Gd₂ O₃ NPs. Niedrig (a ) und hoch (b ) Vergrößerung TEM-Bilder. Die Durchmesserverteilung (c ) und XRD-Muster (d ) von HA-Gd₂ O₃ NPs

Die Phasenstruktur von HA-Gd₂ O₃ NPs wurden durch XRD untersucht, wobei Graphitoxid(GO)-Leistung als Kontrolle verwendet wurde. Wie in Fig. 1d gezeigt, ist ein Hauptbeugungspeak (2θ =12,04°) und zwei Nebenpeaks (2θ =29,6°, 42,1°) wurden im HA-Gd₂ . beobachtet O₃ NP-Beugungsmuster, das den charakteristischen Peaks von GO (100-Ebene) bzw. Graphit (002-Ebene) entsprach. Der Hauptgitterabstand von HA-Gd₂ O₃ NPs zeigten einen kleineren Abstand (0,73 nm, berechnet nach der Bragg-Formel) als der GO-Abstand von d ₀₀₁ =0,85 nm, wobei die Verschiebung der Spitzenposition nach oben auf die Verringerung des Abstands zwischen den sp ³ Schichten. Alle breiten Beugungspeaks zeigten, dass HA-Gd₂ O₃ NPs hatten eine amorphe Struktur, die auf den stark ungeordneten Kohlenstoff und die Abnahme von sp ² . zurückgeführt werden kann (C–C) Schichtabstand während des Karbonisierungsprozesses. Das Ergebnis zeigte weiter HA-Gd₂ . an O₃ NPs mit schwacher kristalliner Natur besaßen eine heterogene mehrschichtige Struktur, die mit unseren früheren Berichten über Kohlenstoffpunkte übereinstimmt [30, 31].

Chemische Struktur und Oberflächenzusammensetzung von HA-Gd₂ O₃ NPs

Oberflächenfunktionelle Gruppen und Zusammensetzung von HA-Gd₂ O₃ NPs wurden mit Fourier-Transformations-Infrarotspektrum und Röntgen-Photoelektronenspektroskopie untersucht. Wie in Abb. 2a gezeigt, zeigte das XPS-Spektrum vier typische Peaks bei 284,0, 400,0, 530,6 und 1188,5 eV, was darauf hindeutet, dass HA-Gd₂ O₃ NPs bestanden hauptsächlich aus Gadolinium-, Kohlenstoff-, Sauerstoff- und Wasserstoffelementen. Das hochauflösende Spektrum von Gd_3d (Abb. 2b) zeigte das Vorhandensein von zwei starken Peaks bei 1187,5 eV und 1221 eV, entsprechend einer Spin-Bahn-Aufspaltung von 32 eV, entsprechend dem 3d _5/2 und 3d _3/2 Energieniveaus von Gd. Diese Beobachtungen stimmten gut mit früheren Berichten über HA-Gd₂ überein O₃ NPs. Die O (1s ) Das in Abb. 2c gezeigte Spektrum wurde von einem Hauptpeak bei 531,4 eV dominiert, der der Bindung zwischen O ²⁻ . entsprach und Gd ³⁺ . Die FITR-Spektroskopie wurde sowohl für nacktes als auch für HA-Gd₂ . durchgeführt O₃ NP-Proben (Abb. 2d). Für die nackten Proben, wie in Abb. 2a gezeigt, sind die charakteristischen Absorptionsbanden von v _als O–C–O bei 1580 und 1380 cm ⁻¹ zeigte die Anwesenheit einer Carbonatgruppe. Die breiten Peaks bei 3340 und 2900 cm ⁻¹ wurden den OH- bzw. C-H-Streckschwingungen zugeschrieben, die dem oberflächenadsorbierten Wasser entsprachen. Für HA-Gd₂ O₃ NPs, die Streckschwingungen von COO ⁻ bei 1580 und 1380 cm ⁻¹ wurden verstärkt, was auf die Einführung der Carboxylgruppe der Hyaluronsäure hinweist. Diese Ergebnisse zeigten, dass die funktionellen Gruppen von HA-Gd₂ O₃ NPs enthielten hauptsächlich bestimmte zahlreiche Carbonyl-, Carboxylat- und Hydroxylgruppen. Das Vorhandensein dieser funktionellen Gruppen befindet sich auf der mit HA-Gd₂ ausgestatteten Oberfläche O₃ NPs mit ausgezeichneter Dispergierbarkeit in Wasser. Wichtig ist, dass das in die Oberfläche der NPs eingebettete Gd-Ion für die MR-Bildgebung und Radiosensibilisierung nützlich sein kann, wodurch das Austreten des Gd-Ions in die Umgebung drastisch verhindert wird.

Die chemische Struktur und Zusammensetzung von HA-Gd₂ O₃ NPs. a Das Full-Scan-XPS-Spektrum von HA-Gd₂ O₃ NPs. b Gd_3d Spektrum. c O_1S Spektrum. d Das FTIR-Spektrum von HA-Gd₂ O₃ NPs

Biokompatibilität von HA-Gd₂ O₃ NPs

Biokompatibilität von HA-Gd₂ O₃ Nanopartikel als potenzielle biomedizinische Wirkstoffe sind für ihre biomedizinische Anwendung von entscheidender Bedeutung. Erstens die inhärente Zytotoxizität von HA-Gd₂ O₃ NPs wurden in HepG2- und VSMC-Zellen unter Verwendung des CCK-8-Assays bestimmt. Wie in Abb. 3a und S. Abb. 1 gezeigt, ist das HA-Gd₂ O₃ NPs zeigten bis zu 3 Tage keine offensichtliche Zytotoxizität. Selbst bei einer Konzentration von 200 µg/ml nach 24 Stunden Expositionszeit betrug die Zellviabilität etwa 90 %. Zweitens die Hämokompatibilität von HA-Gd₂ O₃ NPs in vivo wurden mit einem Hämolyse-Assay geschätzt. Wie in 3b gezeigt, beobachteten wir eine Hämolyse von roten Blutkörperchen im Wasser (Positivkontrolle). Im Gegensatz dazu wurde nach HA-Gd₂ . keine offensichtliche Hämolyse beobachtet O₃ NP-Inkubation bei verschiedenen Konzentrationen von 0 bis 200 µg/ml für 2 Stunden, was den Ergebnissen für PBS-Lösung (Negativkontrolle) ähnlich war. Im Vergleich zur Negativkontrolle ist der Prozentsatz der Hämolyse bei unterschiedlichen Konzentrationen von HA-Gd₂ O₃ Die NPs wurden basierend auf der Absorption des Überstands bei 541 nm leicht bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Hämolyse-Prozentsätze von HA-Gd₂ O₃ Die NPs betrugen alle weniger als 3% in der untersuchten Konzentration, was ihre günstige Hämokompatibilität bestätigt. Um die potenzielle Toxizität zu untersuchen, wurde HA-Gd₂ O₃ NPs wurden Balb/c-Mäusen intravenös injiziert (wie in S. Fig. 2 zu sehen). Nach 1 Woche wurden diese Mäuse hingerichtet und Blase, Niere und Milz für die pathologische Schnittanalyse entnommen. Wie in S. Abb. 2 gezeigt, zeigte das Ergebnis pathologischer Schnitte, dass es in den Organen von HA-Gd₂ . keine beobachtbare Läsion oder Entzündungsreaktion gab O₃ NP-behandelte Mäuse. Diese Ergebnisse zeigten eindeutig, dass das so synthetisierte HA-Gd₂ O₃ NPs hatten eine günstige Zytokompatibilität und eine gute Hämokompatibilität.

a Wirkung von HA-Gd₂ O₃ NPs zur Lebensfähigkeit von HepG2- und VSMC-Zellen unter Verwendung des CCK-8-Assays. b Hämolytische Aktivität von HA-Gd₂ O₃ NPs in verschiedenen Konzentrationen (50, 100, 200, 300 und 400 µg/ml). PBS und Wasser wurden als Negativ- bzw. Positivkontrolle verwendet

MRT-Phantomstudie

Der Längsschnitt (T ₁ ) Relaxationszeiten von HA-Gd₂ O₃ NPs wurden in vitro zusammen mit dem kommerziellen Kontrastmittel Magnevist (Gd-DTPA) als Kontrolle mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH =7,4, 0,2 µM) untersucht. Mit steigender Gd-Konzentration wird die Signalintensität von T ₁ -Gewichtsphantombilder deutlich erhöht, was darauf hindeutet, dass alle Proben eine MRT-Kontrastverstärkung auf T . erzeugen könnten ₁ -gewichtete Sequenzen (Abb. 4a). Darüber hinaus ergaben Diagramme der Signalintensität gegenüber der Inversionszeit T ₁ -Relaxationszeiten jedes Kontrastmittels bei bestimmten Konzentrationen. Wie in Abb. 4b gezeigt, ist der r ₁ Wert von HA-Gd₂ O₃ NPs wurden mit 6,0 mM ⁻¹ . gemessen S ⁻¹ , die signifikant höher war als die von Magnevist (3,86 mM ⁻¹ S ⁻¹ ) unter den gleichen Bedingungen. Das verbesserte r ₁ kann auf den viel höheren hydrodynamischen Radius und die Oberfläche von HA-Gd₂ . zurückgeführt werden O₃ NPs; daher wurden mehr Gd-Atome, die im Gitter von NPs dotiert waren, für Wassermoleküle zugänglich, was die Längsrelaxation verkürzt und das r . erhöht ₁ Wert.

a T₁ Phantombilder des HA-Gd₂ O₃ NPs mit unterschiedlichen Konzentrationen an Gesamt-Gd-Ionen. b Die entsprechenden Diagramme von 1/T₁ gegen Konzentrationen von Gesamt-Gd-Ionen. c In-vivo-T₁ MR-Bildgebung und Analyse von Mäusen nach intravenöser Injektion von HA-Gd₂ O₃ NPs als Kontrastmittel. d Quantifizierung von Signaländerungen (SNR-Verhältnis) in Blase und Niere zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verabreichung (n =3). *p <0,05

MRT-Bildgebung in Vivo

Um die potenziellen Anwendungen in vivo zu bestimmen, wurden die MR-Bildgebungsleistung und das Kreislaufverhalten von HA-Gd₂ O₃ NPs (10 mg/kg) wurden mit einem MRT-Scanner mit normalen BALB/c-Mäusen als Modell untersucht. Verglichen mit Bildern vor der Injektion (Abb. 4c) wurden die helleren Bereiche der Niere und Blase, wie durch die gestrichelten Kreise angezeigt, 10 min nach der Injektion deutlich beobachtet, was zeigt, dass HA-Gd₂ O₃ NPs könnten als CAs verwendet werden, um T . zu verbessern ₁ Entspannung in diesen Hauptorganen in vivo. Wichtig ist die Kontrastverstärkung von HA-Gd₂ O₃ Die NPs wurden bis zu 60 Minuten nach der Injektion aufrechterhalten, was viel länger war als die von Gd-Komplex-Kleinmolekülen (Halbwertszeit von etwa mehreren Minuten bei kleinen Tieren) [27], was darauf hindeutet, dass HA-Gd₂ O₃ NPs besaßen in vivo längere Retentionszeiten als die kommerziellen Kontrastmittel. Um den MR-Kontrasteffekt quantitativ zu analysieren, haben wir das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) berechnet, indem wir die interessierenden Regionen der MRT-Bilder fein analysiert und die Werte von SNR_post . berechnet /SNR_vor um die relative Signalverstärkung (RSE) darzustellen (Fig. 4d). Die RSE-Werte von HA-Gd₂ O₃ NPs in der Niere betrugen 1,35, 1,99 und 1,86. Ebenso die RSE-Werte von HA-Gd₂ O₃ NPs in der Blase waren höher als in der Niere (1,29, 3,59 und 2,26). HA-Gd₂ O₃ NPs mit großer Größe (mehr als 100 nm) zeigten lange Zirkulationszeiten und können dann nach früheren Ergebnissen über den biliär-intestinalen Weg eliminiert werden [32]. Darüber hinaus kann die verlängerte Zirkulationszeit in vivo zu einem erhöhten passiven Targeting in Tumoren führen, indem der EPR-Effekt verstärkt wird.

Tumorbildgebung

HA-Gd₂ O₃ NPs mit hervorragender MR-Bildgebungsleistung und langer Zirkulationszeit bieten eine großartige Möglichkeit zur Bildgebung von Tumoren durch einen EPR-Effekt. Daher haben wir subkutane Lebertumormodelle etabliert, um zu untersuchen, ob hepatozelluläre Karzinome (HCCs) durch HA-Gd₂ . nachgewiesen werden können O₃ NP-verstärkte MRT. Nach intravenöser Injektion von HA-Gd₂ O₃ NPs beobachteten wir, dass die subkutane Tumorregion heller wird als das umgebende Gewebe, wie es sowohl durch koronale als auch durch transversale Scans zu sehen ist (Abb. 5a). Das RES des subkutanen Tumors erreichte bei transversalen bzw. koronalen Scans dramatisch 1,54 bzw. 1,83, was auf die effektive Akkumulation von HA-Gd₂ . hinweist O₃ NPs in der Tumorregion durch den EPR-Effekt. Diese Ergebnisse zeigen, dass HA-Gd₂ O₃ NPs sind hochempfindlich für die MRT-Visualisierung von Tumoren. Viele Studien zeigten, dass die lange Zirkulationszeit die Effizienz des passiven Targetings durch undichte Gefäße solider Tumoren fördern könnte [33].

T ₁ -gewichtete MR-Bildgebung (a ) und entsprechende quantitative Analyse (b ) von Heps-Maus-Leberkrebs-Xenotransplantat-Tumoren nach intravenöser Injektion von HA-Gd₂ O₃ NPs

Verbesserung der Radiosensibilisierung von HA-Gd₂ O₃ NPs

Die hervorragende Leistung von HA-Gd₂ O₃ NPs als T ₁ Kontrastmittel veranlasste uns, seinen Standort bei der Radiosensibilisierung von Tumoren genau zu bestimmen. Zunächst wurde unter Verwendung eines CCK-8-Assays untersucht, ob bei dieser Kombinationsbehandlung eine Dosiserhöhung auftrat. Wie in Abb. 6a dargestellt, einzelnes HA-Gd₂ O₃ NPs (Konzentration 0–200 µg/ml) beeinflussten die Lebensfähigkeit von HepG-2 nicht signifikant, aber Röntgenbestrahlung (Bereich 0–9 Gy) verringerte die Lebensfähigkeit der HepG-2-Zellen auf weniger als 70 % bei 9 Gy. Wichtig ist, dass eine Kombination aus Röntgenbestrahlung mit HA-Gd₂ O₃ NPs verringerten die Lebensfähigkeit der HepG-2-Zellen dramatisch auf weniger als 50 %, insbesondere bei einer Konzentration von 200 µg/ml bei 9 Gy. Als nächstes wurde ein klonogener Assay durchgeführt, um die Zelllebensfähigkeit in HepG-2-Zellen nach einer Kombination aus Röntgenbestrahlung und HA-Gd₂ . zu bewerten O₃ NPs. Wie in Abb. 6b gezeigt, einzelnes HA-Gd₂ O₃ NPs hatten keinen dramatischen Einfluss auf die Bildung von HepG-2-Zellkolonien, aber Röntgenbestrahlung verringerte die Bildung von HepG-2-Zellkolonien auf 46,7 %. Behandlung mit Röntgenbestrahlung und HA-Gd₂ O₃ NPs hemmten die Lebensfähigkeit der Zellkoloniebildung merklich auf 29,8 %. Die entsprechenden Bilder bestätigten weiter die Radiosensibilisierung von HA-Gd₂ O₃ NPs gegen HepG-2-Zellen.

Die Strahlensensibilisierungswirkung von HA-Gd₂ O₃ Nanopartikel in vitro. a Die synergistische Wirkung von HA-Gd₂ O₃ NPs (0 μg/ml, 12,5 μg/ml, 25 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml und 200 μg/ml) und Röntgenstrahlung (0 Gy, 3 Gy, 6 Gy und 9 Gy) auf die Lebensfähigkeit von HepG2-Zellen unter Verwendung des CCK-8-Assays. *p <0,05, **p <0,01, der Unterschied war statistisch signifikant. b Die Kolonien-Überlebenstests von HepG2-Zellen, die mit HA-Gd₂ . behandelt wurden O₃ NPs und Röntgenstrahlung und c die entsprechende quantitative Analyse der Fähigkeiten zur Klonogenese. d Tumorvolumen-Wachstumskurven verschiedener Gruppen von Mäusen nach verschiedenen Behandlungen. Gruppen:a Kontrolle, b Strahlung, c HA-Gd₂ O₃ NPs und d Strahlung + HA-Gd₂ O₃ NPs. e Fotos von Tumoren, die am Ende der Behandlung von verschiedenen Mäusegruppen gesammelt wurden

Die Wirksamkeit der Strahlentherapie in vitro hat uns ermutigt, HA-Gd₂ . anzuwenden O₃ NPs kombiniert mit der Bestrahlung, um das Tumorwachstum bei tumortragenden Mäusen zu kontrollieren. Die Tumorvolumina in der Kontrolle und dem einzelnen HA-Gd₂ O₃ Die NP-Behandlungen nahmen schnell zu und beide nahmen um 180 % zu. Verglichen mit den einzelnen Bestrahlungsbehandlungen 58 %, HA-Gd₂ O₃ NPs in Kombination mit Bestrahlung zeigten eine wirksame Tumorhemmung von 38 % nach 10 Tagen Bestrahlung ( 6d ). Der Tumor wurde fotografiert und die durchschnittlichen Tumorvolumina in jeder Gruppe zeigten, dass das durchschnittliche Tumorvolumen in Gruppe (a) das höchste war, während das in Gruppe (d) das niedrigste unter allen Gruppen war ( 6e ). Diese Ergebnisse zeigen, dass das frisch zubereitete HA-Gd₂ O₃ Nanopartikel sind vielversprechend für die Hemmung des Tumorwachstums unter Röntgenbestrahlung.

Durchflusszytometrie-Assay und Lebend-/Tot-Färbungsassay wurden durchgeführt, um den Radiosensibilisierungsmechanismus bei der kombinierten Behandlung von HA-Gd₂ . besser zu verstehen O₃ NPs und Röntgenstrahlung. Wie in 7a gezeigt, wurde eine intensive grüne Fluoreszenz ohne Rot in HepG-2-Zellen beobachtet, die mit einzelnem HA-Gd₂ . behandelt wurden O₃ NPs, die eine hohe Zelllebensfähigkeit bestätigten. Eine geringe Menge roter Fluoreszenz wurde nach Röntgenbestrahlungsbehandlungen beobachtet, was auf eine geringe Zellapoptose hinweist. Nach der Kombinationsbehandlung mit HA-Gd₂ . wurde jedoch eine starke rote Fluoreszenz beobachtet O₃ NPs (200 μg/ml) und Strahlung, die zeigen, dass HA-Gd₂ O₃ NPs könnten die durch Röntgenstrahlung induzierte Zellapoptose dramatisch verbessern. Der Radiosensibilisierungsmechanismus von HA-Gd₂ O₃ NPs wurde mit Durchflusszytometrie weiter untersucht. Wie in Abb. 7b dargestellt, Einzelbestrahlung und HA-Gd₂ O₃ NPs induzierten 27,55 % bzw. 19,12 % des G2/M-Phasenstillstands. Allerdings Kombinationsbehandlung von HA-Gd₂ O₃ NPs und Strahlung erhöhten den G2/M-Phasenstillstand merklich und reichten dosisabhängig von 30,89 bis 33,27 %. Unterdessen induzierte die Kombinationsbehandlung den apoptotischen Zelltod von 10,63 auf 22,67%, was sich in den Sub-G1-Anteilen widerspiegelt, wenn das einzelne HA-Gd₂ O₃ NPs und Strahlung induzierten 3,02 % und 13,87 %. Um den möglichen Mechanismus des Zelltods weiter zu untersuchen, wurde ein Annexin V-EGFP/PI-Verfahren mittels Durchflusszytometrie durchgeführt. Das Emissionssignal von Annexin V-EGFP wurde auf dem x . aufgetragen -Achse, während das PI-Emissionssignal auf der y . aufgetragen wurde -Achse (Abb. 8). Die Mengen an Nekrosezellen, frühen Apoptosezellen, späten Apoptosezellen und lebenden Zellen wurden durch den Prozentsatz von Annexin V ⁻ . bestimmt /PI ⁺ (Q3), Annexin V ⁺ /PI ⁺ (Q2) und Annexin V ⁻ /PI ⁻ (Q4) bzw. Der apoptotische Prozentsatz der Zellen in der Kontrollgruppe und einzelnem HA-Gd₂ O₃ Die NP-Gruppe (100 µg/ml) betrug weniger als 5 %, was zu einem subtilen Einfluss führte. Im Vergleich zu den Behandlungsgruppen mit Einzelbestrahlung (8,8%) ist die Apoptoserate der Kombination von HA-Gd₂ O₃ NPs und Strahlung nahmen mit der Konzentration im Bereich von 50 bis 200 µg/ml zu. Insbesondere stieg die frühe Apoptoserate der Zellen offensichtlich auf 33,2% und die frühe und späte Apoptose erreichte 44,3%, wenn die Konzentration 200 µg/ml beträgt. Im Allgemeinen ist die Kombination von HA-Gd₂ O₃ NPs und Röntgenbestrahlung hatten einen synergistischen Effekt auf die Zellkoloniebildung, die Lebensfähigkeit der Zellen in einer dosisabhängigen Weise und den strahlensensibilisierenden Effekt. Basierend auf diesen Ergebnissen, HA-Gd₂ O₃ NPs können eine effiziente Alternative zur Verbesserung der Strahlensensibilisierung für die Strahlentherapie sein.

Erhöhung der Strahlendosis von HA-Gd₂ O₃ NPs. a Lebendtote Färbung von HepG2-Zellen. Grün (Fluoresceindiacetat-Färbung) =lebende Zellen, rot (Propidiumiodid-Färbung) =tote Zellen. Maßstabsbalken =200 mm. b Die Zellzyklusverteilung nach verschiedenen Behandlungen wurde durch Quantifizierung des DNA-Gehalts mit einem Durchflusszytometrie-Assay analysiert

Die Apoptose-Analysen von HA-Gd₂ O₃ NPs. a Die Apoptosespiegel von HepG-2-Zellen 24 Stunden nach der Behandlung mit Röntgenstrahlung. b Die entsprechende quantitative Analyse

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend haben wir ein bifunktionales HA-Gd₂ . entwickelt O₃ NPs für die effektive MR-Bildgebung und Radiosensibilisierung von Tumoren in einem hydrothermalen Eintopfverfahren. Nach der Beschichtung mit HA wird das wie synthetisierte HA-Gd₂ O₃ NPs zeigten eine günstige Dispergierbarkeit in Wasser und eine ausgezeichnete Biokompatibilität. Das resultierende HA-Gd₂ O₃ NPs, die die Gd-Atome einkapseln, zeigten nicht nur effektiv eine hohe longitudinale Relaxivität (r ₁ ) für MRT als T ₁ Kontrastmittel, sondern auch eine erhöhte Strahlenempfindlichkeit von Tumoren durch Induktion der Zellapoptose und Blockierung des Zellzyklus als Radiosensibilisator. Somit ist das neuartige HA-Gd₂ O₃ NPs zeigen ein vielversprechendes Potenzial für die Tumordiagnose und Strahlentherapie.

Materialien und Methoden

Materialien

Fluoresceindiacetat (FDA) und Propidiumiodid (PI) wurden von Sigma (New York, NY, USA) bezogen. GdCl₃ ·6H₂ O, Ethylenglykol (99 %) wurden von Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. (Lianyungang, Jiangsu, Volksrepublik China) bezogen. Das Cell Counting Kit-8 (CCK-8) wurde von Dojindo (Kumamoto, Japan) gekauft. NaH₂ PO₄ , Na₂ HPO₄ , und H₂ SO₄ wurden vom Guangfu Fine Chemical Research Institute (Nankai, Tianjin, Volksrepublik China) bezogen. Fötales Rinderserum und Dulbecco’s minimum essential medium (DMEM) wurden von Invitrogen China Limited (Shanghai, Volksrepublik China) bezogen. Alle Chemikalien waren von analytischer Qualität und wurden ohne weitere Reinigung verwendet.

Synthese von HA-Gd₂ O₃ NPs

Der HA-Gd₂ O₃ NPs wurden unter Verwendung eines hydrothermalen Eintopfansatzes wie folgt hergestellt:Zuerst wurden 0,1 µg HA in 20 µl Wasser unter kräftigem Rühren bei Umgebungstemperatur über Nacht gelöst. Anschließend 0,1 g GdCl₃ ·6H₂ O bzw. 0,5 µl NaOH (1 µM) wurden zugegeben. Dann wurde die Mischung weitere 5 min gerührt, um eine homogene klare Lösung zu bilden, und in einen 50-ml-Autoklaven überführt, verschlossen und 6 h bei 120°C hydrothermal behandelt. Nach dem natürlichen Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die transparente Suspension mit einer 0,22-&mgr;m-Membran filtriert, um jegliche große Agglomeration zu entfernen. Die hergestellte Lösung wurde dann 3 Tage lang in einem Dialysebeutel mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 14 kDa gegen Wasser dialysiert. Die Dialyselösung wurde gesammelt und unter Verwendung eines Vakuumgefriertrockners gefriergetrocknet. Der HA-Gd₂ O₃ Auf diese Weise wurden NP-Pulver erhalten und zur weiteren Charakterisierung aufbewahrt.

Instrumentierung und Charakterisierung

Die Morphologien des HA-Gd₂ O₃ NPs wurden durch hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopie auf einem JEM-2100-Mikroskop (JEOL, Tokio, Japan) bei einer Beschleunigungsspannung von 200 kV untersucht. Die elementare Zusammensetzung von HA-Gd₂ O₃ NPs wurden durch XPS-Messungen in einem MK II-Photoelektronenspektrometer unter Verwendung von Al-Ka (1486,6 eV) als Röntgenquelle und einem Fourier-Transformations-Infrarot-(FTIR)-Spektrometer (Nicolet Nexus 470, GMI, Ramsey, MN, USA) bestimmt. Die Kristallstruktur von HA-Gd₂ O₃ NPs wurden über Röntgenbeugungsmuster (XRD) auf einem Rigaku-D/MAX2500-Diffraktometer (Rigaku, Japan) mit Cu Kα (λ =0,15405 nm) Strahlung bei einer Scangeschwindigkeit von 4°/min im Bereich von 5 bis 80°.

Zelllebensfähigkeitstest

Der Einfluss von HA-Gd₂ O₃ NPs auf die Lebensfähigkeit der Zellen wurden mit dem Cell Counting Kit CCK-8-Assay (CCK-8-Assay) untersucht. HepG2 (humanes Hepatokarzinom, ATCC-Nummer:HB-8065) ​​und VSMCs (vaskuläre glatte Muskelzellen) wurden in einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 3 × 10 ³ . ausgesät Zellen/Well und kultiviert bei 37 °C in 5% CO₂ Inkubator für 24 h, dann mit DMEM mit unterschiedlichen Konzentrationen von HA-Gd₂ O₃ NPs (0 µg/ml, 25 µg/ml, 50 µg/ml, 100 µg/ml und 200 µg/ml) ersetzen das Wachstumsmedium. Nach weiteren 4 h Inkubation und Zugabe von 10 &mgr;l CCK-8-Lösung zu jeder Vertiefung wurden die Zellen 4 h an einem dunklen Ort inkubiert. Die Extinktion wurde bei 490 nm unter Verwendung des Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader (Bio Tek, Winooski, VT, USA) gemessen. Als Kontrolle wurden unbehandelte Zellen (in DMEM) verwendet, und die relative Lebensfähigkeit der Zellen (mittlere SD, n =5) wurde als Abssample/Abscontrol × 100 % ausgedrückt.

Hämolyse-Assay

Kurz gesagt, 19–21 µg, 6 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse wurden freundlicherweise gemäß den Tiermanagementregeln des Gesundheitsministeriums der Volksrepublik China präpariert. Drei Milliliter des mit Heparin-Natrium stabilisierten Blutes wurden aus der Entnahme von Augäpfeln gewonnen. Dann wurde es zentrifugiert, um den Überstand mit 1200 U/min, 15 Minuten gemäß der Literatur zu entfernen. Danach die Sedimentation fünfmal mit PBS waschen, um die roten Blutkörperchen (MRBCs) der Maus zu erhalten, dann etwa 3 ml Blut durch Entfernen des Augapfels entnehmen, mit Heparin-Natrium stabilisiert, zentrifugiert (1, 200 U/min, 15 Min) um den Überstand gemäß der Literatur [27] zu entfernen, fünfmal mit PBS gewaschen, um die roten Blutkörperchen (MRBCs) der Maus zu erhalten. Durch zehnfache Verdünnung mit PBS wurden 0,1 µl MRBCs in 1,5 µl-Röhrchen überführt, die mit 0,9 µl PBS vorgefüllt waren, die verschiedene Partikelkonzentrationen (50–200 µg/ml) HA-Gd₂ . enthielten O₃ NPs, 0,9 ml Wasser (als positive Kontrolle) bzw. 0,9 ml PBS (als negative Kontrolle). Die Mischung wurde nach leichtem Schütteln 2 h bei Raumtemperatur inkubiert, dann 1 min bei 12.000 U/min zentrifugiert. Schließlich wurden die Fotografien aller Proben aufgenommen und die Extinktion des Überstands (Hämoglobin) wurde mit einem UV-2450 UV-Vis-Spektrophotometer gemessen. Die Hämolyse-Prozentsätze verschiedener Proben wurden berechnet, indem die Extinktionsdifferenz zwischen der Probe, der positiven und der negativen Kontrolle bei 541 nm geteilt wurde.

MR-Phantomstudie in vitro und in vivo

In vitro and in vivo MR images were acquired on 3 Tesla MRI scanner (Magnetom Trio Tim, Siemens, Germany). To study the T ₁ phantom images in vitro, the solution of HA-Gd₂ O₃ NPs with different concentrations ranging from 0 to 16 mM was added to a 96-well culture plate, using the Magnevist (commercial MR contrast agent, Gd-DTPA) as control. For MR imaging in vivo, we chose the normal BALB/c mice as the model (n =4). Animal experiments were strictly conformed to the Animal Management Rules of the Ministry of Health of the People’s Republic of China. Ten milligrams per kilogram of HA-Gd₂ O₃ NPs filtering through sterilized membrane filters (pore size 0.22 μm) were intravenously injected into the animals, then immediately investigated with a MRI scanner. These samples for MR imaging in vitro and animals in vivo were imaged with the following parameters:TR/TE =300/10 ms, 256 × 256 matrices, slices =5, thickness =2 mm, averages =2, FOV =80 × 80.

Radiosensitization Effect In Vitro

CCK-8 assay was used to evaluate radiosensitizing activity of HA-Gd₂ O₃ NPs in vitro. Cells were seeded in five 96-well plates at a density of 3 × 10 ³ cells/well, and each plate was treated at the same condition:cultured at 37 °C in 5% CO₂ incubator for 24 h, then using DMEM containing different concentrations of HA-Gd₂ O₃ NPs (0 μg/mL, 12.5 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, and 200 μg/mL) replacing the growth medium. After incubation for 4 h, five plates were irradiated at different X-ray doses (0 Gy, 3 Gy, 6 Gy, and 9 Gy), 300 cGy/min, respectively. After radiation, all the plates were incubated for 4 h, then measuring the absorbance under the same parameters.

Clonogenic survival assay was also conducted to study the radiosensitization effect in vitro. HepG2 cells were seeded in six-well plates at 4.0 × 10 ⁴ cells/well and allowed to grow for 16 h. The cells were incubated with HA-Gd₂ O₃ NPs diluted in cell culture medium for 6 h. The cells were then irradiated at 6 Gy using a clinical linear accelerator (Oncor, Siemens, Germany) with 6 MeV irradiation using a 10 cm × 10 cm radiation field at a source-to-skin distance (SSD) of 100 cm to cover the entire cells. Then, these irradiated cells were allowed to grow for 14 days, fixed with 4% paraformaldehyde at room temperature for 40 min, stained with a 1% crystal violet after washing the cells.

Live-Dead Staining Assay and Flow Cytometry

To study the radiosensitization effect of HA-Gd₂ O₃ NPs, HepG2 cells were seeded in six-well plates at a density of 4.0 × 10 ⁴ cells/well and allowed to grow for 12 h and set six groups (control, HA-Gd₂ O₃ NPs, radiation, radiation + 50 μg/mL HA-Gd₂ O₃ NPs, radiation + 100 μg/mL HA-Gd₂ O₃ NPs and radiation + 200 μg/mL HA-Gd₂ O₃ NP). When cells were grown to 80% in plates, the first group had no treatment, the second group was incubated with 100 μg/mL HA-Gd₂ O₃ NPs for 24 h, the third group was just irradiated, and the fourth group to the sixth group were irradiated and incubated with different concentrations of HA-Gd₂ O₃ NPs (50, 100, and 200 μg/mL) for 24 h, respectively. After that, FDA and PI working buffer were added for cell staining. The fluorescence of stained cells was observed under a fluorescence microscope (×20), and live cells showed green color and dead ones exhibited red color. Furthermore, cells by different treatments were washed three times with PBS, digested, collected, and centrifuged at a speed of 2000 rpm for 5 min, then fixed with 70% ethanol at − 20 °C overnight followed by PI staining. DNA fragmentation was quantified by the fluorescence intensity of PI on a flow cytometer (BD, Accuri, C6BD, Accuri, C6), analyzed by software (FLOWJO 7. 6. 2) to make clear the cell cycle distribution.

Radiosensitization Effect In Vivo

Female BALB/c mice with body weights of 19–21 g and ages of 6 weeks were obtained from the Yangzhou University Laboratory Animal Center under the standard conditions. Animal experiments were compliant with the Animal Management Rules of the Ministry of Health of the People’s Republic of China. A subcutaneous tumor model was established as the following procedures:First, 1 × 10 ⁶ HepS cells were inoculated into mice intraperitoneal, and the ascites were collected after 5 days. Then, these ascites were injected into subcutaneous. When the tumor sizes reached approximately 100 mm ³ , subcutaneous tumors models were established and applied to the following experiments.

Eight mice bearing subcutaneous tumors per group were treated with radiation at 3 Gy per fraction to a total dose of 9 Gy within 7 days. The radiotherapy was conducted after 3 h intravenous injection of HA-Gd₂ O₃ NPs (10 mg/Kg), on a Siemens Primus clinical linear accelerator (6 MeV) using a self-made device to cover the entire tumor. These mice were anesthetized by 1% pentobarbital (50 mg/kg) to assure immobility during irradiation. The volume was measured and recorded every day, determined from caliper measurement, and calculated by the formulae:V =0.5 × a × b ² , wobei V (mm ³ ) is the volume of the tumor, and a (mm) and b (mm) are the tumor length and tumor width, respectively. Relative tumor volumes were normalized to their initial sizes. Each group was conducted on eight mice, wherein statistical analysis was performed using Student’s two-tailed t test (*p <0.05, **p <0.001).

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

The data sets supporting the results of this article are included within the article.