microRNA-18a aus M2-Makrophagen hemmt TGFBR3, um die Progression des Nasopharynxkarzinoms und das Tumorwachstum über den TGF-β-Signalweg zu fördern

Einführung

Das Nasopharyngealkarzinom (NPC) ist ein epithelialer maligner Tumor, der zur lokalen Infiltration und frühen Fernmetastasierung neigt [1]. NPC-Patienten klagen häufig über Lähmung des sechsten Nervs und Horner-Syndrom [2]. Die angewandte Therapie besteht derzeit überwiegend aus Strahlentherapie und integrierter Strahlen- und Chemotherapie [3]. Leider werden Strahlentherapie und Chemotherapie unerwartet von Komplikationen begleitet, und erworbene Resistenzen gegen Strahlentherapie behindert die Ergebnisse der NPC [3]. Angesichts der Tatsache, dass die Aufgabe, potenzielle zielgerichtete Therapien auszuloten, eine Priorität hat.

Es ist dokumentiert, dass fehlregulierte microRNAs (miRNAs) an der Tumorentstehung, Metastasierung, Invasion und Resistenz gegen Strahlentherapie und Chemotherapie von NPC beteiligt sind [1]. Als Unterfamilie von miRNAs wurde festgestellt, dass miR-18a die NPC-Progression durch Suppressor der Morphogenese bei der Hemmung der Genitalien 1 und der Aktivierung des mTOR-Signalwegs erleichtert [4]. Darüber hinaus wird weiterhin bestätigt, dass miR-18a die Proliferation und Metastasierung von NPC-Zellen über die DICER1-Regulierung aktiviert [5]. Darüber hinaus wird nachgewiesen, dass die NPC-Zellprogression durch miR-18a durch eine Beeinträchtigung der miRNA-Biogenese angetrieben wird [6]. Darüber hinaus wurde dokumentiert, dass miR-18a bei der Metastasierung von NPC eine entscheidende Rolle spielt [7]. Alternativ aktivierte (M2) Makrophagen sind wichtige Bestandteile solider und hämatologischer Malignome und werden mit Progression, Metastasierung und Therapieresistenz in Verbindung gebracht [8]. M2-polarisierte tumorassoziierte Makrophagen sind mit einer schlechten Prognose von NPC assoziiert [9]. Es ist faszinierend, die Unterschiede von M2-Makrophagen in Epstein-Barr-Virus-negativen und Epstein-Barr-Virus-positiven NPCs festzuhalten [10]. Es gibt eine Studie, die darlegt, dass miR-18a die Lebermetastasierung von Dickdarmkrebszellen hemmt, indem es M1-Makrophagen induziert [11]. Der transformierende Wachstumsfaktor-beta-III-Rezeptor (TGFBR3) ist ein TGF-β-Korezeptor, der den Typ-II-TGF-β-Rezeptorliganden bereitstellt, um die Signalübertragung und das Gleichgewicht der Zelloberfläche zu stimulieren, und löslicher TGFBR3 ist ein Regulator während der Krebsprogression [12]. Von schwach exprimiertem TGFBR3 wird berichtet, dass es eine immuntolerante Tumormikroumgebung induziert [13]. Im Gegensatz dazu induziert eine vorübergehende Überexpression von TGFBR3 die Apoptose in menschlichen NPC-Zellen [14]. Nach unserem besten Wissen fördert die durch miR-181a induzierte M2-Makrophagen-Polarisierung die M2-Makrophagen-vermittelte Tumorzellmetastasierung über den Kruppel-ähnlichen Faktor 6 und die CCAAT/Enhancer-bindende Protein-α-Achse [15].

Obwohl viele Studien die unabhängige Rolle von miR-18a-, TGFBR3- und M2-Makrophagen bei NPC entdeckt haben, sind die kombinierten Wechselwirkungen zwischen diesen drei Faktoren insgesamt noch immer schwer fassbar. In Anbetracht dessen, dass diese Studie gestartet wurde, um die Mechanismen und die Beteiligung dieser Faktoren an NPC zu entschlüsseln.

Materialien und Methoden

Ethikerklärung

Das Experiment wurde von der Ethikkommission des Third Xiangya Hospital der Central South University genehmigt und entsprach den medizinethischen Standards. Diese Studie wurde mit schriftlicher Zustimmung aller Spender durchgeführt. Tierversuche entsprachen den Anforderungen der National Laboratory Animal Management and Use Regulations.

Sammlung peripherer mononukleärer Blutzellen

Die Monozyten wurden aus peripherem Blut gesunder Spender nach einem adhärenten Verfahren gewonnen. Periphere Blutproben wurden von gesunden Spendern der Abteilung für Hämatologie des dritten Xiangya-Krankenhauses der Central South University entnommen. Von Monozyten abgeleitete Makrophagen wurden durch Plastikadhäsion von peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMCs) erhalten, die zuvor durch Dichtegradientenzentrifugation (Ficoll-Paque, GE Healthcare) aus Buffy-Coat-Präparaten von Blut von gesunden Spendern isoliert wurden. Dann 2,0 × 10 ⁶ PBMCs wurden in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % Humanserum (Millipore, Bedford, MA, USA) und Penicillin/Streptomycin auf 12-Well-Platten (NalgeNunc, NY, USA) kultiviert. Wenn PBMCs für 2–3 Stunden an der Wand anhafteten, wurden der Überstand und die suspendierten PBMCs wiederholt entfernt, um anhaftende Monozyten zu erhalten.

Makrophagen-Polarisation

Monozyten wurden durch den humanen Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) zur Differenzierung in Makrophagen induziert und durch Interleukin (IL)-4 in M2-Makrophagen polarisiert.

Induktion von Makrophagen

Monozyten wurden in 20 % fötalem Rinderserum (FBS)-DMEM kultiviert und mit M-CSF (100 &mgr;g, Peprotech, NJ, USA) bis zur Endkonzentration von 100 ng/ml versetzt. Das Medium wurde alle 3 Tage zur Hälfte erneuert und dann mit 100 ng/ml M-CSF ergänzt. Bis zum 7.–8. Tag kultiviert, wurde ein Teil der Zellen geerntet und die Makrophagen-Oberflächenmarker CD68 [16], CD163 [17] und CD206 [18] mittels Immunfluoreszenzassay [19] getestet, um Makrophagen zu identifizieren.

Polarisierung von Makrophagen

Makrophagen wurden zu M2-Makrophagen polarisiert, indem dem Differenzierungsmedium für weitere 24 Stunden 20 ng/ml IL-4 (Peprotech) zugesetzt wurden. Ein Teil der M2-Makrophagenproben wurde für den durchflusszytometrischen Nachweis verwendet. Die Proben wurden in 3 Röhrchen aufgeteilt:Röhrchen 1 war die gleiche Charge anhaftender Makrophagen ohne IL-4-Stimulation; Röhrchen 2 und 3 waren die anhaftenden Makrophagen, die durch IL-4 stimuliert wurden. Die Proben wurden beim Laden auf etwa 10.000 Zellen verdünnt und mit unspezifischem Immunglobulin G versetzt, um den Fc-Rezeptor zu blockieren. Dann wurden den Proben nicht-spezifische Isotyp-Antikörper, PE-markierter CD68-Antikörper und PE-markierter CD163-Antikörper (beide von Biolegend, CA, USA) zugesetzt. 30 min inkubiert und mit 0,5 % Rinderserumalbumin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült, die Proben wurden zentrifugiert und mit 500 μL PBS zum Nachweis in Zellsuspension überführt.

Quantitative Reverse Transkription der Polymerase-Kettenreaktion

Die quantitative Polymerase-Kettenreaktion der reversen Transkription (RT-qPCR) wurde zum Nachweis von miR-18a, CCL22, Peroxisom-Proliferator-aktiviertem Rezeptor γ (PPAR-γ) und TGFBR3-mRNA-Expression in den gesammelten Zellen eingesetzt.

Gesamt-RNA wurde mit Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) aus Zellen extrahiert und mit dem Mir-X miRNA First Strand Synthesis Kit (Clontech, Mountain View, CA, USA) für miR-18a und PrimeScriptTM RT . revers in komplementäre RNA transkribiert Master Mix Kit (Takara, Dalian, China) für CCL22, PPAR-γ und TGFBR3. U6 und Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) waren Ladekontrollen für miR-18a, CCL22, PPAR-γ und TGFBR3. SYBR ^@ Bei der PCR wurde eine Vormischung von Ex Taq TM II (Perfect Real Time) (Takara) in einem LightCycler 480 II-System (Roche Diagnostics, Indiana, USA) verwendet. Die Datenberechnung wurde von 2 ^-△△CT . ausgewertet Methode. PCR-Primer sind in Tabelle 1 dargestellt.

Western Blot Assay

Der Western-Blot-Assay wurde zum Nachweis von TGFBR3-, Gesamt-(t)-Smad1-, phosphoryliertem (p)-Smad1-, t-Smad3- und p-Smad3-Protein in den gesammelten Zellen angewendet.

Das Gesamtprotein der Zellen wurde extrahiert und die Proteinkonzentration wurde basierend auf dem Bicinchoninsäure-Kit bestimmt. Die Proteinprobe wurde in Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese in die Vertiefungen geladen und auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran übertragen. Die PVDF-Membran wurde mit Magermilch blockiert und mit den Primärantikörpern TGFBR3 (1:2000, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), t-Smad1 (1:1000), p-Smad1 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology) inkubiert. , t-Smad3 (1:1000), p-Smad3 (1:1000) und GAPDH (1:1000, alle von Abcam, Cambridge, MA, UK), gefolgt von einer Inkubation mit dem Meerrettichperoxidase-markierten sekundären Antikörper ( 1:500, Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA, USA). Dreimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 gewaschen, wurde die Membran durch verstärkte Chemilumineszenz entwickelt. Die Quantifizierung der Signale wurde von den National Institutes of Health ImageJ Imaging abgeschlossen. Processing Analysis Software mit auf GAPDH normierter Signalintensität.

Zellkultur und Screening

Die humanen NPC-Zelllinien CNE2, TW03, C666-1 und SUNE-1 und die normale humane Nasopharynx-Zelllinie NP96 (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) wurden im Roswell Park Memorial Institute (RPMI) kultiviert. 1640-Medium (Gibco, CA, USA), das FBS (Gibco), 100 µg/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin enthält und bei 80 % Konfluenz passagiert wurde. RT-qPCR wurde verwendet, um die Expression von miR-18a nachzuweisen. Unter diesen NPC-Zelllinien zeigten CNE2- und SUNE-1-Zellen den größten und kleinsten Unterschied in der miR-18a-Expression von NP96-Zellen, daher wurden sie für miR-18a-Herunter- oder Hochregulierungsassays ausgewählt.

Zellgruppierung und -behandlung

Unter allen NPC-Zelllinien wurden SUNE-1-Zellen mit dem geringsten Unterschied zu NP96-Zellen in der miR-18a-Expression ausgewählt. Geleitet von den Spezifikationen von Lipofectamine 2000 (Invitrogen) wurden SUNE-1-Zellen mit miR-18a-Mimetika, miR-18a-Mimetika-Negativkontrolle (NC), si-TGFBR3 oder si-TGFBR3 NC transfiziert.

Unter allen NPC-Zelllinien wurden CNE2-Zellen mit dem größten Unterschied zu NP96-Zellen in der miR-18a-Expression selektiert und mit miR-18a-Inhibitoren, miR-18a-Inhibitoren NC, Überexpression (OE)-TGFBR3 oder OE-TGFBR3 NC durch Lipofectamine 2000 . transfiziert (Invitrogen).

Geleitet von den Spezifikationen von Lipofectamine 2000 (Invitrogen) wurden M2-Makrophagen mit miR-18a-Nachahmern, miR-18a-Nachahmern NC, si-TGFBR3, si-TGFBR3 NC, miR-18a-Inhibitoren, miR-18a-Inhibitoren NC, OE-TGFBR3 transfiziert, oder OE-TGFBR3 NC.

Kokultur von M2-Makrophagen und NPC-Zellen

Zell-Co-Kultur in der Transwell-Kammer wurde verwendet, um die Auswirkungen von miRNA aus M2-Makrophagen auf NPC-Zellen zu untersuchen. Die obere Kammer war mit M2-Makrophagen mit einer Porengröße von 0,4 µm gefüllt, die nur die Zellen der oberen Kammer am Durchtreten hinderte, nicht jedoch die von den Zellen abgesonderten kleinen Moleküle wie Vesikel, Wachstumsfaktoren, Nährstoffe usw. Die untere Kammer wurde mit NPC-Zellen gestreut.

SUNE-1 und CNE2 wurden in normalem FBS (Gibco) inkubiert. Die Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden für Experimente verwendet.

SUNE-1- und CNE2-Zellen wurden mit M2-Makrophagen in 10 % FBS-RPMI-1640-Medium (beide von Gibco) in einer Transwell-Insert-Zellkulturschale (Coring, Corning, NY, USA) mit einer Porengröße von 0,4 µm . cokultiviert .

SUNE-1-Zellen wurden nicht mit M2-Makrophagen co-kultiviert, oder co-kultiviert mit M2-Makrophagen, miR-18a imitiert transfizierte M2-Makrophagen, miR-18a imitiert NC-transfizierte M2-Makrophagen, si-TGFBR3-transfizierte M2-Makrophagen oder si -TGFBR3 NC-transfizierte M2-Makrophagen.

CNE2-Zellen wurden nicht mit M2-Makrophagen kokultiviert oder mit M2-Makrophagen, miR-18a-Inhibitoren-transfizierten M2-Makrophagen, miR-18a-Inhibitoren NC-transfizierten M2-Makrophagen, OE-TGFBR3-transfizierten M2-Makrophagen oder OE-TGFBR3 NC-transfizierte M2-Makrophagen.

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-Diphenyltetrazoliumbromid-Assay

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay getestet, einem kolorimetrischen Assay, der angewendet wurde, um die Aktivität der mitochondrialen Dehydrogenase zu bestimmen, die MTT zu Formazan reduzierte.

Trypsinisiert und in 96-Well-Platten bei 4 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen/Vertiefung, Zellen wurde das Kulturmedium an der 0, 12., 24., 36. bzw. 48. Stunde entzogen und mit MTT-Lösung (500 &mgr;l, 0,5 g/l) ergänzt. 4 h inkubiert, der Überstand wurde verworfen und die Zellen wurden mit 200 µl Dimethylsulfoxid-Lösung inkubiert. Die Werte der optischen Dichte (OD, 490 nm) wurden auf einem Mikroplattenlesegerät (ELX808IU, BioTek, VT, USA) gemessen. Jede Gruppe wurde mit 6 parallelen Wells eingerichtet.

Kolonie-Bildungs-Assay

Die Fähigkeit zur Koloniebildung von NPC-Zellen wurde durch einen Koloniebildungsassay getestet, der die Abhängigkeit von der Zellpopulation und die Zellklonalproliferation widerspiegelte.

Für 24 h kultiviert und mit 0,25% Trypsin abgelöst, wurden 300 Zellen in eine 35-mm-Schale mit 3 parallelen Vertiefungen in jeder Gruppe ausgesät. Mit Kulturmedium, das alle 3 Tage erneuert wurde, wurden die Zellen eine Woche lang kultiviert und mit 5 ml 4% Paraformaldehyd fixiert. Danach wurden die Zellen mit Kristallviolett-Färbelösung gefärbt und luftgetrocknet. Die Schale wurde umgedreht, auf die ein transparenter Gitterfilm gelegt wurde, und die Anzahl der Kolonien (mehr als 50 Zellen) wurde unter einem Mikroskop (Olympus, Tokio, Japan) gezählt.

Kratztest

Die Zellmigration wurde durch einen Kratztest getestet. Die Zellen wurden trypsiniert, in Platten mit 6 Vertiefungen mit 3 parallelen Vertiefungen für jede Gruppe ausgesät und bis zu einer Konfluenz von 90% kultiviert. Dann wurden die Zellen im Medium mit 2% FBS inkubiert und vertikale Kratzer wurden mit einer 100-μl-Spitze gezeichnet. Die Zellen wurden um 0 und 24 Uhr unter einem umgekehrten Mikroskop fotografiert, um die Zellmigrationsstrecke zu messen.

Transwell-Assay

Die Zellinvasion und -migration wurden durch den Transwell-Assay getestet. Die obere Kammer der Transwell-Kammer wurde vorgetaucht und mit 100 &mgr;L Matrigel (Coring) versetzt, das mit serumfreiem RPMI 1640-Medium bei 1:100 verdünnt worden war. Die obere und untere Kammer wurden nacheinander mit 200 &mgr;l und 600 &mgr;l serumfreiem RPMI 1640-Medium befüllt. Anschließend wurde die untere Kammer mit 600 μl RPMI 1640-Medium mit 10 % FBS gefüllt, während die obere Kammer mit 200 μl Zellsuspension (12,5 × 10 ⁴ Zellen/ml). Nach 40 h Inkubation wurden die Zellen mit Kristallviolett-Färbelösung gefärbt und mit einem Wattestäbchen abgewischt, um die Zellen, die durch das Matrigel passierten, unter einem Mikroskop zu zählen.

Durchflusszytometrie

Zellapoptose und Zellzyklusverteilung wurden durch Durchflusszytometrie bestimmt.

Die Zellzyklusverteilung wurde durch Propidiumiodid (PI)-Färbung bewertet. Die Zellen wurden in 6-Well-Platten bei 4 × 10 ⁵ . ausgesät Zellen/Vertiefung und kultiviert bis 70–80% Konfluenz. Über Nacht in vorgekühltem 70 % Ethanol fixiert, wurden die Zellen zentrifugiert (der Überstand wurde verworfen), mit RNAase (1 g/l, 200 μl) und Triton X-100 (2 μl) versetzt und mit PI-Färbelösung für 30 Minuten. Danach wurde die Zellzyklusverteilung mit einem Durchflusszytometer (BD Bioscience, NJ, USA) bei 488 nm entsprechend den unterschiedlichen Zellfluoreszenzintensitäten bei jedem Satz (G0/G1-Satz, S-Satz und G2/M-Satz) nachgewiesen.

Die Zellapoptose wurde durch Annexin V-Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und PI-Doppelfärbung gemessen. Die Zellen wurden in 500 μl Bindungspuffer resuspendiert und mit 5 μl Annexin V-FITC-Färbelösung und 10 μl PI-Lösung gefärbt. Die Zellapoptose wurde auch mit einem Durchflusszytometer (BD Bioscience) innerhalb von 30 Minuten ohne Lichtexposition getestet. Im Streudiagramm waren lebende Zellen im unteren linken Quadranten (Q4) FITC ⁻ /PI ⁻ , apoptotische Zellen im frühen Stadium im unteren rechten Quadranten (Q3) waren FITC ⁺ /PI ⁻ , und nekrotische und apoptotische Zellen im späten Stadium im oberen rechten Quadranten (Q2) waren FITC ⁺ /PI ⁺ . Apoptoserate =Prozentsatz der frühen Apoptose (Q3) + Prozentsatz der späten Apoptose (Q2).

Tumor-Xenotransplantate bei Nacktmäusen

Das Tumorwachstum wurde durch Etablieren eines NPC-Modells in Nacktmäusen beobachtet. Abgelöst durch 0,25 % Trypsin wurden die SUNE-1- und CNE2-Zellen in der logarithmischen Phase zu einer Einzelzellsuspension von 5 × 10 ⁷ . konfiguriert Zellen/ml. Die Zellsuspension (0,2 ml) wurde mit einem Mikroinjektor in die rechte Achselhöhle von Mäusen injiziert, um Mausmodelle zu erstellen. Die modellierten Mäuse wurden in einer spezifischen pathogenfreien Umgebung aufgezogen. Ab dem 4. Tag wurde Tumorwachstum beobachtet und die Mäuse alle 4 Tage gewogen. Nackte Mäuse wurden am 20. Tag nach der Injektion euthanasiert und die Tumoren wurden reseziert, mit einer elektronischen Waage gewogen und fotografiert.

Dualer Luciferase-Reporter-Gen-Assay

Das duale Luciferase-Reportergensystem wurde verwendet, um die Bindungsstellen von miR-18a und der 3′untranslatierten Region (UTR) der TGFBR3-mRNA zu bestätigen. Eine Website zur biologischen Vorhersage (http://www.microrna.org/microrna/home.do) wurde verwendet, um das Zielgen von miR-18a zu analysieren und die Existenz der komplementären Bindungsstelle von miR-18a am 3′ zu entdecken. UTR von TGFBR3. Ein dualer Luciferase-Reportergen-Assay wurde verwendet, um weiter zu überprüfen, ob TGFBR3 direkt von miR-18a angegriffen wurde. Ein pmirGLO-TGFBR3-Wildtyp (WT) und ein pmirG-LO-TGFBR3-mutanter Typ (MUT) der TGFBR3- 3′UTR-Bindungsstelle wurden konstruiert. TGFBR3-WT oder TGFBR3-MUT und miR-18a-Mimetika oder Mimetika NC wurden mit Lipofectamine 2000 (Invitrogen) in SUNE-1- und CNE2-Zellen cotransfiziert und für 48 h inkubiert. Zur Analyse der Zellen wurde ein Luciferase-Assay-Kit (Promega, Madison, WI, USA) verwendet.

Statistische Analyse

Zur Analyse wurde die Statistiksoftware SPSS21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA) verwendet. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Unterschiede zwischen zwei Gruppen wurden von t . analysiert Test während Unterschiede zwischen mehreren Gruppen durch Einweg-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test. Ein signifikanter Unterschied wurde bei P . berücksichtigt <0.05.

Ergebnisse

Identifizierung von M2-Makrophagen

Die durch das adhärente Verfahren angereicherten Monozyten und die durch M-CSF induzierten Monozyten wurden aus peripherem Blut von gesunden Spendern gewonnen. Der Immunfluoreszenz-Nachweis von CD68, CD206 und CD163 bestätigte, dass PBMCs, die durch M-CSF in vitro induziert wurden, zu Makrophagen mit typischen molekularen Eigenschaften wurden, die unsere Anforderungen erfüllten (Abb. 1a).

Identifizierung von M2-Makrophagen. a . CD68, CD206 und CD163 wurden auf der Oberfläche von Makrophagen exprimiert, die nach Monozyteninduktion in vitro erhalten wurden. b Durch IL-4 polarisierte Makrophagen waren M2-Makrophagen. c CD163 wurde stark exprimiert und CD68 wurde in M2-Makrophagen, polarisiert durch IL-4, schwach exprimiert. d CCL22 wurde in M2-Makrophagen stark exprimiert. e PPAR-γ wurde in M2-Makrophagen stark exprimiert. f miR-18a wurde in M2-Makrophagen stark exprimiert; *P <0,05; **P <0,01. Die Messdaten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt, N =3. Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden von t . analysiert testen

Die erhaltenen Makrophagen wurden durch IL-4 polarisiert und unter einem Mikroskop auf Morphologie untersucht. Es zeigte sich, dass Makrophagen (M0) ohne IL-4-Stimulation vielfältig und unregelmäßig waren und eine runde, ovale oder spindelförmige Form aufwiesen. Durch IL-4 stimuliert, wurden M2-Makrophagen größer und nahmen überwiegend eine runde Form an, die den morphologischen Eigenschaften von M2-Makrophagen entsprach, wie zuvor beschrieben [20] (Abb. 1b).

Die Durchflusszytometrie testete die Oberflächenantigene der adhärenten Zellen, die 24 Stunden lang mit 20 ng/ml IL-4 stimuliert wurden, und stellte fest, dass CD68 zu 21,16% exprimiert wurde, während CD163 zu 98,69% der Gesamtzahl der Zellen ausmachte (Abb. 1c). wobei die anhaftenden Zellen M2-Makrophagen sind. RT-qPCR zeigte, dass im Gegensatz dazu bei M0-Zellen CCL22 und PPAR-γ (typische polarisierende Moleküle) in M2-Makrophagen anstiegen (Abb. 1d, e), was auf die erfolgreiche Induktion von M2-Makrophagen hinweist.

RT-qPCR zeigte auch, dass die miR-18a-Expression in M2-Makrophagen im Gegensatz zu den M0-Makrophagen (P ˂ 0,05) (Abb. 1f).

MiR-18a wird in NPC-Zellen stark exprimiert und TGFBR3 wird in NPC-Zellen schlecht exprimiert

Die Bioinformatik-Website (miRanda) sagte die potenziellen Ziele von miR-18a voraus und TGFBR3 wurde als ein Ziel von miR-18a angesehen (Abb. 2a). Ein dualer Luciferase-Reportergen-Assay wurde implementiert, um zu bestätigen, dass miR-18a auf 3′UTR von TGFBR3 abzielte. TGFBR3-WT oder TGFBR3-MUT wurden in den pmirGLO-Vektor kloniert und mit miR-18a-Mimetika oder NC in SUNE-1- und CNE2-Zellen cotransfiziert. miR-18a-Mimetika hatten keinen Einfluss auf die Luciferase-Aktivität von TGFBR3 3′UTR-MUT, beeinträchtigten jedoch die von TGFBR3 3′UTR-WT in SUNE-1- und CNE2-Zellen, was darauf hindeutet, dass TGFBR3 ein von miR-18a reguliertes Zielgen war (Abb . 2b).

MiR-18a wird in NPC-Zellen stark exprimiert und TGFBR3 wird schwach exprimiert. a miRanda sagte voraus, dass miR-18a auf TGFBR3 abzielt. b Dualer Luciferase-Reportergen-Assay bestätigte, dass miR-18a auf TGFBR3 abzielt. c Die miR-18a-Expression war erhöht und die TGFBR3-Expression war in miR-18a-Mimics-transfizierten M2-Makrophagen verringert. d In miR-18a-Inhibitoren transfizierten M2-Makrophagen war die miR-18a-Expression verringert und die TGFBR3-Expression erhöht. e Die miR-18a-Expression war erhöht und die TGFBR3-Expression war in NPC-Zelllinien im Vergleich zu NP96-Zellen verringert. f Die miR-18a-Expression war erhöht und die TGFBR3-Expression war in miR-18a-Nachahmer-transfizierten SUNE-1-Zellen verringert. g In miR-18a-Inhibitoren transfizierten CNE2-Zellen war die miR-18a-Expression verringert und die TGFBR3-Expression erhöht. h Die miR-18a-Expression war erhöht und die TGFBR3-Expression war in SUNE-1-Zellen, die mit miR-18a nachahmenden transfizierten M2-Makrophagen cokultiviert wurden, verringert. ich In CNE2-Zellen, die mit miR-18a-Inhibitoren transfizierten M2-Makrophagen cokultiviert wurden, war die miR-18a-Expression verringert und die TGFBR3-Expression erhöht; *P <0,05; **P <0,01. Die Messdaten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt, N =3. Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden von t . analysiert Prüfung. Vergleiche zwischen mehreren Gruppen wurden durch Einweg-ANOVA analysiert, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test

Die Transfektionseffizienz von miR-18a-Mimetika oder miR-18a-Inhibitoren in M2-Makrophagen wurde durch die Bestimmung der miR-18a- und TGFBR3-Expression in M2-Makrophagen durch RT-qPCR und Western-Blot-Assay manifestiert. Es war offensichtlich, dass (Fig. 2c, d) eine miR-18a-Überexpression die miR-18a-Expression erhöhte und die TGFBR3-Expression in M2-Makrophagen reduzierte. Im Gegensatz dazu reduzierte die miR-18a-Hemmung die miR-18a-Expression und erhöhte die TGFBR-Expression in M2-Makrophagen. Es wurde kein Unterschied in der miR-18a-Expression beobachtet, während die TGFBR3-Expression abnahm, wenn M2-Makrophagen mit si-TGFBR3 transfiziert wurden. Es wurde kein Unterschied in der miR-18a-Expression beobachtet, während die TGFBR3-Expression nach der OE-TGFBR3-Transfektion auf M2-Makrophagen wuchs.

miR-18a- und TGFBR3-Expression in CNE2-, TW03-, C666-1-, SUNE-1- und NP96-Zelllinien wurden durch RT-qPCR und Western-Blot-Assay getestet. In NPC-Zellen erhöhte sich im Vergleich zu NP96-Zellen die miR-18a-Expression und die TGFBR3-Expression nahm ab ( 2e ). Da sich CNE2-Zellen und SUNE-1-Zellen mit den größten und den kleinsten Unterschieden in der miR-18a-Expression von NP96-Zellen manifestierten, wurden sie für die fortschreitenden miRNA-Herunter- bzw. Hochregulierungsassays ausgewählt.

Um die Auswirkungen von miR-18a und TGFBR3 auf NPC-Zellen zu identifizieren, wurden SUNE-1-Zellen mit miR-18a-Mimetika oder si-TGFBR3 transfiziert, während CNE2-Zellen mit miR-18a-Inhibitoren oder OE-TGFBR3 transfiziert wurden. RT-qPCR- und Western-Blot-Assays zeigten, dass miR-18a eine erhöhte miR-18a-Expression nachahmt und die TGFBR3-Expression in SUNE-1-Zellen reduziert. Die Transfektion von si-TGFBR3 hatte keinen Einfluss auf die miR-18a-Expression, während die TGFBR3-Expression in SUNE-1-Zellen reduziert wurde. miR-18a-Inhibitoren verringerten die miR-18a-Expression und erhöhten die TGFBR3-Expression in CNE2-Zellen. Die OE-TGFBR3-Transfektion in CNE2-Zellen beeinflusste die miR-18a-Expression nicht, aber erhöhte die TGFBR3-Expression (Fig. 2f, g).

Um die Auswirkungen von miR-18a aus M2-Makrophagen auf NPC-Zellen zu untersuchen, wurden miR-18a-Mimetika- oder si-TGFBR3-transfizierte M2-Makrophagen oder miR-18a-Inhibitoren- oder OE-TGFBR3-transfizierte M2-Makrophagen mit SUNE-1 . kokultiviert bzw. CNE2-Zellen in der Transwell-Kammer. RT-qPCR- und Western-Blot-Assays testeten miR-18a- und TGFBR3-Expression in SUNE-1- oder CNE2-Zellen. SUNE-1-Zellen, die mit untransfizierten oder miR-18a-transfizierten M2-Makrophagen cokultiviert wurden, zeigten eine erhöhte miR-18a-Expression und eine verminderte TGFBR3-Expression. In SUNE-1-Zellen, die mit si-TGFBR3-transfizierten M2-Makrophagen kokultiviert worden waren, wurde kein Unterschied in der miR-18a-Expression und der reduzierten TGFBR3-Expression festgestellt (Fig. 2h). Nach Kokultur mit untransfizierten M2-Makrophagen zeigten CNE2-Zellen eine erhöhte miR-18a-Expression und eine verringerte TGFBR3-Expression. Eine reduzierte miR-18a-Expression und eine erhöhte TGFBR3-Expression zeigten sich jedoch in CNE2-Zellen, die zuvor mit miR-18a-Inhibitoren transfizierten M2-Makrophagen cokultiviert wurden. In der miR-18a-Expression wurde kein Unterschied festgestellt, und die TGFBR3-Expression erhöhte sich in CNE2-Zellen, die mit OE-TGFBR3-transfizierten M2-Makrophagen cokultiviert wurden (Fig. 2i).

miR-18a aus M2-Makrophagen fördert die Lebensfähigkeit von NPC-Zellen und die Fähigkeit zur Koloniebildung

MTT-Assay und Koloniebildungs-Assay wurden angewendet, um die Auswirkungen von miR-18a und TGFBR3 auf die Lebensfähigkeit und die Koloniebildungsfähigkeit von SUNE-1-Zellen und CNE2-Zellen zu identifizieren. miR-18a-Mimetika, miR-18a-Inhibitoren, si-TGFBR3 oder OE-TGFBR3 wurden in SUNE-1-Zellen oder CNE2-Zellen transfiziert. Es wurde angezeigt, dass in SUNE-1-Zellen eine miR-18a-Hochregulierung oder eine TGFBR3-Herunterregulierung die Lebensfähigkeit der Zellen und eine erhöhte Koloniezahl erhöht ( 3a , e). In CNE2-Zellen war die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigt und die Anzahl der Kolonien wurde durch miR-18a-Hemmung oder TGFBR3-Überexpression verringert (Abb. 3b, f).

miR-18a aus M2-Makrophagen induziert die Lebensfähigkeit von NPC-Zellen und die Fähigkeit zur Koloniebildung. a miR-18a imitiert oder si-TGFBR3 erhöhte die Lebensfähigkeit von SUNE-1-Zellen. b miR-18a-Inhibitoren oder OE-TGFBR3 verringerten die Lebensfähigkeit von CNE2-Zellen. c Co-Kultur mit miR-18a imitiert- oder si-TGFBR3-transfizierten M2-Makrophagen erhöhte die Lebensfähigkeit von SUNE-1-Zellen. d Die Kokultur mit miR-18a-Inhibitoren oder OE-TGFBR3-transfizierten M2-Makrophagen verringerte die Lebensfähigkeit von CNE2-Zellen. e miR-18a imitiert oder si-TGFBR3 erhöhte die Koloniezahl von SUNE-1-Zellen. f miR-18a-Inhibitoren oder OE-TGFBR3 verringerten die Koloniezahl von CNE2-Zellen. g Die Co-Kultur mit miR-18a imitiert oder si-TGFBR3-transfizierten M2-Makrophagen erhöhte die Koloniezahl von SUNE-1-Zellen. h Co-Kultur mit miR-18a-Inhibitoren oder OE-TGFBR3-transfizierten M2-Makrophagen verringerte die Koloniezahl von CNE2-Zellen; *P <0,05; **P <0,01. Die Messdaten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt, N =3. Vergleiche zwischen mehreren Gruppen wurden durch Einweg-ANOVA analysiert, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test

Um die Auswirkungen von miR-18a aus M2-Makrophagen auf die Lebensfähigkeit und Koloniebildungsfähigkeit von NPC-Zellen zu untersuchen, wurden miR-18a-Mimetika, miR-18a-Inhibitoren, si-TGFBR3- oder OE-TGFBR3-transfizierte M2-Makrophagen cokultiviert mit SUNE-1-Zellen oder CNE2-Zellen in der Transwell-Kammer. MTT- und Koloniebildungsassays zeigten, dass SUNE-1-Zellen, die mit nicht transfizierten oder miR-18a-transfizierten oder si-TGFBR3-transfizierten M2-Makrophagen kokultiviert wurden, eine verstärkte Zelllebensfähigkeit und eine erhöhte Anzahl von Kolonien zeigten (Abb. 3c, g). .

CNE2-Zellen, die mit nicht transfizierten M2-Makrophagen cokultiviert wurden, wurden mit einer verstärkten Zelllebensfähigkeit und erhöhten Kolonien hervorgehoben. CNE2-Zellen, die entweder mit miR-18a-Inhibitoren-transfizierten oder OE-TGFBR-transfizierten M2-Makrophagen cokultiviert wurden, zeigten jedoch eine verminderte Zelllebensfähigkeit und verminderte Kolonien (Abb. 3d, h).

miR-18a von M2 Macrophages fördert die Invasion und Migrationsfähigkeit von NPC-Zellen

Um besser zu verstehen, wie miR-18a und TGFBR3 die Migration und Invasion von NPC-Zellen beeinflussten, wurden ein Scratch-Test und ein Transwell-Assay implementiert. Die Ergebnisse zeigten, dass mit miR-18a-Mimetika oder si-TGFBR3 transfizierte SUNE-1-Zellen durch eine erhöhte Zellmigrationsstrecke und Invasionszellen gekennzeichnet waren ( 4a und 5a ).

miR-18a aus M2-Makrophagen fördert die Migrationsfähigkeit von NPC-Zellen. a miR-18a imitiert oder si-TGFBR3 erhöhte die Migration von SUNE-1-Zellen. b miR-18a-Inhibitoren oder OE-TGFBR3 verringerten die Migration von CNE2-Zellen. c Co-culture with miR-18a mimics- or si-TGFBR3-transfected M2 macrophages increased migration of SUNE-1 cells. d Co-culture with miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages decreased migration of CNE2 cells; *P <0.05; **P <0.01. Measurement data were expressed as mean ± standard deviation, N =3. Comparisons among multiple groups were analyzed by one-way ANOVA, followed by Tukey’s post hoc test

miR-18a from M2 macrophages promotes NPC cell invasion ability. a miR-18a mimics or si-TGFBR3 increased invasion of SUNE-1 cells. b miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3 decreased invasion of CNE2 cells. c Co-culture with miR-18a mimics- or si-TGFBR3-transfected M2 macrophages increased invasion of SUNE-1 cells. b Co-culture with miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages decreased invasion of CNE2 cells; *P <0.05; **P <0.01. Measurement data were expressed as mean ± standard deviation, N =3. Comparisons among multiple groups were analyzed by one-way ANOVA, followed by Tukey’s post hoc test

In CNE2 cells transfected with miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3, the reductions appeared in cell migration distance and invasion cells (Figs. 4b and 5b).

How miR-18a from M2 macrophages influenced invasion and migration abilities of NPC cells were deciphered by miR-18a mimics-, miR-18a inhibitors-, si-TGFBR3-, or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages co-culturing with SUNE-1 or CNE2 cells. The results highlighted that SUNE-1 cells co-cultured with untransfected, or miR-18a mimics-transfected or si-TGFBR3-transfected M2 macrophages were manifested with increased cell migration distance and invasion cells (Figs. 4c and 5c).

Both cell migration distance and invasion cells increased in CNE2 cells co-cultured with untransfected M2 macrophages. Upon co-culture with miR-18a inhibitors-transfected or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages, CNE2 cells were showed with reduced migration distance and invasion cells (Figs. 4d and 5d).

miR-18a from M2 Macrophages Arrests Fewer NPC Cell at G0/G1 Phase and Suppresses Apoptosis

Cell cycle distribution and apoptosis were tested by flow cytometry to stratify the effects of miR-18a and TGFBR3 on NPC cells. It was indicated that transfection of miR-18a mimics or si-TGFBR3 reduced SUNE-1 cells arrested in the G0/G1 phase, increased cells in the S and G2/M phases, and reduced cell apoptosis rate (Figs. 6a and 7a).

miR-18a from M2 macrophages arrests fewer NPC cell at G0/G1 phase. a miR-18a mimics or si-TGFBR3 decreased SUNE-1 cells in the G0/G1 phase, and increased SUNE-1 cells in the S and G2/M phases. b miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3 increased CNE2 cells in the G0/G1 phase, and decreased CNE2 cells in the S and G2/M phases. c Co-culture with miR-18a mimics- or si-TGFBR3-transfected M2 macrophages decreased SUNE-1 cells in the G0/G1 phase, and increased SUNE-1 cells in the S and G2/M phases. d Co-culture with miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages increased CNE2 cells in the G0/G1 phase, and decreased CNE2 cells in the S and G2/M phases; *P <0.05; **P <0.01. Measurement data were expressed as mean ± standard deviation, N =3. Comparisons among multiple groups were analyzed by one-way ANOVA, followed by Tukey’s post hoc test

miR-18a from M2 macrophages inhibits NPC cell apoptosis. a miR-18a mimics or si-TGFBR3 decreased apoptosis of SUNE-1 cells. b miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3 increased apoptosis of CNE2 cells. c Co-culture with miR-18a mimics- or si-TGFBR3-transfected M2 macrophages decreased apoptosis of SUNE-1 cells. d Co-culture with miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages increased apoptosis of CNE2 cells; *P <0.05; **P <0.01. Measurement data were expressed as mean ± standard deviation, N =3. Comparisons among multiple groups were analyzed by one-way ANOVA, followed by Tukey’s post hoc test

Upon transfection with miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3, CNE2 cells in the G0/G1 phase trended toward an elevation while those in the S and G2/M phases toward a reduction, and cell apoptosis rate raised (Figs. 6b and 7b).

With the purpose to decode the mechanism of miR-18a from M2 macrophages in NPC cell cycle distribution and apoptosis, M2 macrophages transfected with miR-18a mimics, miR-18a inhibitors, si-TGFBR3, or OE-TGFBR3 were co-cultured with SUNE-1 cells or CNE2 cells in the Transwell chamber. Co-cultured with untransfected, or miR-18a mimics-transfected or si-TGFBR3-transfected M2 macrophages, reduced SUNE-1 cells were displayed in the G0/G1 phase and increased cells in the S and G2/M phases, and SUNE-1 cell apoptosis rate decreased (Figs. 6c and 7c).

Co-cultured with untransfected M2 macrophages, CNE2 cells in the G0/G1 phase reduced, cells in the S and G2/M phases increased, and apoptosis rate declined. On the contrary, co-cultured with miR-18a inhibitors-transfected or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages, CNE2 cells in the G0/G1 phase elevated while those in the S and G2/M phases decreased, and apoptosis rate elevated (Figs. 6d and 7d).

miR-18a from M2 Macrophages Reduces p-Smad1/t-Smad1 and Elevates p-Smad3/t-Smad3 in NPC Cells

Western blot assay detected TGF signaling pathway-related proteins in NPC cells to further explain the effects of miR-18a and TGFBR3 on TGF signaling pathway.

It was explained that transfection of miR-18a mimics or si-TGFBR3 reduced p-Smad1/t-Smad1 and elevated p-Smad3/t-Smad3 in SUNE-1 cells (Fig. 8a).

miR-18a from M2 macrophages decreases p-Smad1/t-Smad1 and increases p-Smad3/t-Smad3 in NPC cells. a miR-18a mimics or si-TGFBR3 in SUNE-1 cells decreased p-Smad1/t-Smad1 and elevated p-Smad3/t-Smad3. b miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3 in CNE2 cells increased p-Smad1/t-Smad1 and decreased p-Smad3/t-Smad3. c Co-culture with miR-18a mimics- or si-TGFBR3-transfected M2 macrophages decreased p-Smad1/t-Smad1 and elevated p-Smad3/t-Smad3. d Co-culture with miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages increased p-Smad1/t-Smad1 and decreased p-Smad3/t-Smad3; *P <0.05; **P <0.01. Measurement data were expressed as mean ± standard deviation, N =3. Comparisons among multiple groups were analyzed by one-way ANOVA, followed by Tukey’s post hoc test

Transfection with miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3 led to declined p-Smad3/t-Smad3 and increased p-Smad1/t-Smad1 in CNE2 cells (Fig. 8b).

miR-18a from M2 macrophages influencing TGF signaling pathway in NPC cells was determined by Western blot assay through testing TGF signaling pathway-related proteins in SUNE-1 cells and CNE2 cells which had co-cultured with miR-18a mimics-, miR-18a inhibitors-, si-TGFBR3-, or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages in the Transwell chamber.

SUNE-1 cells co-cultured with untransfected, miR-18a mimics-transfected, or si-TGFBR3-transfected M2 macrophages were manifested with reduced p-Smad1/t-Smad1 and incremental p-Smad3/t-Smad3 (Fig. 8c).

Co-cultured with untransfected M2 macrophages, CNE2 cells trended toward declined p-Smad1/t-Smad1 and elevated p-Smad3/t-Smad3. In an opposite way, CNE2 cells were demonstrated with increased p-Smad1/t-Smad1 and decreased p-Smad3/t-Smad3 when co-cultured with miR-18a inhibitors-transfected or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages (Fig. 8d).

miR-18a from M2 Macrophages Induces Tumor Growth in Nude Mice with NPC

Tumor xenografts were conducted on nude mice to further elucidate the impacts of miR-18a and TGFBR3 on tumor growth of NPC.

It was indicated that injected with miR-18a mimics-transfected or si-TGFBR3-transfected SUNE-1 cells, mice were manifested with enlarged tumor volume and heavier tumor weight (Fig. 9a).

miR-18a from M2 macrophages promotes tumor growth in nude mice with NPC. a miR-18a mimics or si-TGFBR3 in SUNE-1 cells increased tumor volume and weight. b miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3 in CNE2 cells decreased tumor volume and weight. c Co-culture with miR-18a mimics- or si-TGFBR3-transfected M2 macrophages increased tumor volume and weight. d Co-culture with miR-18a inhibitors or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages decreased tumor volume and weight; *P <0.05; **P <0.01. Measurement data were expressed as mean ± standard deviation, three nude mice in each group. Comparisons among multiple groups were analyzed by one-way ANOVA, followed by Tukey’s post hoc test

Reduced tumor volume and weight were presented in mice with injection of miR-18a inhibitors-transfected or OE-TGFBR3-transfected CNE2 cells (Fig. 9b).

Tumor growth was observed in mice which had injected with miR-18a mimics-, miR-18a inhibitors-, si-TGFBR3-, or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages to illustrate the mechanism of miR-18a from M2 macrophages in NPC.

After co-culture with untransfected, miR-18a mimics-transfected or si-TGFBR3-transfected M2 macrophages, SUNE-1 cells were injected into mice and mice were observed with larger tumor volume and heavier tumor weight (Fig. 9c).

CNE2 cells were co-cultured with M2 macrophages and injected into mice with the results suggesting growing tumor volume and weight. Both tumor volume and weight were inclined to reduce when mice were injected with CNE2 cells which had co-cultured with miR-18a inhibitors-transfected or OE-TGFBR3-transfected M2 macrophages (Fig. 9d).

Discussion

NPC refers to a polygenic disease threatened by a wide range of factors [21]. MiRNAs are previously implied to participate in the pathogenesis of NPC via regulation of their target genes which are indicators of cellular processes and pathways [22]. Concretely, miR-18a advances NPC progression by miRNA biogenesis impairing [6]. Given that this study goes forward to decipher the combined interactions of miR-18a from M2 macrophages and TGFBR3 in NPC with the conclusion elucidating that miR-18a from M2 macrophages stimulates NPC progression via TGFBR3 inhibition (Fig. 10).

Schematic representation of macrophage-derived exosomal miR-18a in NPC and the involvement of TGFBR3-mediated TGF-β signaling pathway

At the start of this study, macrophages are stimulated by IL-4 to differentiate to M2 macrophages which are found to enrich the expression of miR-18a. As we know, during macrophage polarization, miRNA’s expression was altered [23]. In addition, M2 polarization enriches genes which are involved in the cell cycle and metabolic processes, and the M2 phenotype is conducive to tumor growth and angiogenesis in neoplastic tissues [24]. Based on the M2 macrophages-enriched miR-18a, a series of experiments were successfully conducted.

Initially, our study has uncovered that miR-18a is highly expressed while TGFBR3 is poorly expressed in NPC cells. Drawn from a previous study, it is concluded that miR-18a is overexpressed in NPC tissues with its association with lymph node metastasis and clinical stage [5]. Besides that, miR-17-92 cluster members including miR-18a are documented to be overexpressed in NPC tissues [25]. Furthermore, upregulated miR-18a is reported to demonstrate in NPC tissues which is connected with tumor node metastasis stage and tumor size [4]. Experimentally, except for the downregulated TGFBR3 in tongue squamous cell carcinoma [26], there has been another study depicting reduced TGFBR3 in clear-cell renal cell carcinomas accompanied by unwanted prognosis [27]. Anyhow, the results in this study are consistent with these study findings to some extent.

In order to explore the roles of miR-18a and TGFBR3 in NPC cell progression, we have conducted a series of assays with the results indicating that upregulated miR-18a or downregulated TGFBR3 triggers NPC cell progression while miR-18a repression or TGFBR3 elevation has the opposite effects on NPC cells. Widely, suppression of miR-18a is evidenced to hamper cell progression in malignancies including ovarian cancer, colitis-associated colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma [28,29,30]. Narrowly, an existed study has pronounced that upregulated miR-18a promotes NPC cell progression via mediation of DICER1 [6]. In addition, it is noticed that overexpressed miR-18a in NPC is believed to connect with NPC metastasis and repressed miR-18a partially contributes to better prognosis of NPC patients [31]. Lately, it is surveyed that downregulation of miR-18a is capable of discouraging NPC proliferation, invasion, and migration [4]. Additionally, a decrease in TGFBR3 expression is regarded to link with laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC) invasion and miR-223/TGFBR3 axis regulation takes part in LSCC progression inhibition [32]. TGFBR3 elevation is documented to restrict NPC cell viability, induce apoptosis, and activate pro-apoptosis signaling pathways [14]. Previously, a study has indicated that upregulation of TGFBR3 promotes apoptosis and cells arrested in the G2/M phase, resulting in impaired cell viability and migration in salivary gland adenoid cystic carcinoma [33]. Intriguingly, it is formerly described that induction of TGFBR3 contributes to disrupt intrahepatic cholangiocarcinoma progression [34].

Despite the protective role of lowly expressed miR-18a and overexpressed TGFBR3 in NPC cell in vitro, we have performed tumor xenografts in nude mince in vivo for further verification with the results explaining that miR-18a knockdown or TGFBR3 elevation restrains tumor growth in nude mice. As demonstrated in a prior study, miR-18a-injected nude mice show with enhanced tumor growth [5] and conversely, the miR-18a antagomir-injected nude mice are displayed with suppressed tumor growth in NPC [4]. In the light of the TGFBR3 reduction in tumor growth, it is suggested that poorly expressed TGFBR3 provokes tumor formation in clear-cell renal cell carcinoma [27]. In the opposite way, an increase in TGFBR3 is recognized to hinder tumor growth in lung cancer with the presence of long non-coding RNA ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 9 antisense RNA 2 elevation, and miR-223-3p suppression [35]. This study has also predicted and verified that TGFBR3 is a target gene of miR-18a. But, more studies still need to be conducted for further verification.

Conclusion

Generally speaking, this study elaborates the concrete mechanisms that miR-18a from M2 macrophages inhibits TGFBR3 expression to exacerbate the progression of NPC via TGF-β signaling pathway, the results of which is abrogated by miR-18a knockdown or TGFBR3 elevation. This study updates the therapeutic target for NPC. However, a large cohort researches are still in need for in-depth explorations.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Not applicable.