Synthese von gelb fluoreszierenden Kohlenstoff-Nanopunkten durch Mikroplasma zur Bildgebung und photokatalytischen Inaktivierung von Krebszellen

Einführung

Krebs bleibt weltweit eine der häufigsten Todesursachen [1]. Multifunktionale Nanopartikel mit sowohl diagnostischen als auch therapeutischen Funktionen haben vielversprechende Anwendungen in der Nanomedizin. Die simultane bildgeführte Therapie ist ein neues Konzept in der Krebsbehandlung und zeigt große Aussichten hinsichtlich der Optimierung der therapeutischen Effizienz. Es kann nützliche Informationen über die Größe und Lokalisation von Tumoren, das optimale Zeitfenster für die Phototherapie und die therapeutische Wirksamkeit liefern [2,3,4]. Die photodynamische Therapie (PDT) wurde aufgrund ihrer räumlich-zeitlichen Selektivität und ihrer nicht-invasiven Natur zur Behandlung vieler Arten von Krebs und anderen Erkrankungen eingesetzt [5, 6]. Ideale Photosensibilisatoren besitzen im Allgemeinen die folgenden Eigenschaften:(1) hocheffiziente Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), (2) gute Biokompatibilität und (3) Wasserlöslichkeit [7]. Aktuelle Anwendungen der PDT sind jedoch durch die schlechte Wasserlöslichkeit, Instabilität und suboptimale Anregungswellenlängen von Photosensibilisatoren begrenzt. Daher ist die Erzeugung von Photosensibilisator-Ersatzstoffen mit guter Wasserlöslichkeit und Biokompatibilität durch umweltfreundliche und kostengünstige Methoden erforderlich.

Kohlenstoffquantenpunkte (CQDs) haben aufgrund ihrer einzigartigen vorteilhaften Eigenschaften wie einfache und umweltfreundliche Synthese, geringe Toxizität, bemerkenswerte Biokompatibilität, ausgezeichnete Wasserlöslichkeit und Lichtstabilität enorme Aufmerksamkeit erlangt [8]. CQDs haben potenzielle Anwendungen in der zellulären Bildgebung, der Biosensorik, der gezielten Wirkstoffabgabe und anderen biomedizinischen Anwendungen [9,10,11,12,13]. Es gibt zwei Hauptansätze für die Synthese von Kohlenstoffpunkten, Bottom-Up- und Top-Down-Ansätze. Top-down-Verfahren umfassen elektrochemische Oxidation, Laserablation, chemische Oxidation und Ultraschallsyntheseverfahren. Bottom-up-Methoden bestehen aus Hydrothermalbehandlung, Mikrowellensynthese und thermischer Zersetzung [14,15,16,17]. Die erforderliche hohe Temperatur, hoher Druck und starke Säuren führen jedoch immer zu einem erheblichen Energieverbrauch, komplizierten Prozessen und unvermeidlichen Umweltschäden. Daher entstehen neue umweltfreundliche Synthesemethoden, wie es die Zeit erfordert. Wie berichtet, können CQDs innerhalb weniger Minuten mit einem Mikroplasma-Flüssigkeits-Verfahren ohne Hochtemperaturbedingungen, großen Energieeinsatz und aufwendige Verfahren hergestellt werden [18,19,20]. Mikroplasmen bieten eine einzigartige physikalisch-chemische Umgebung sowohl für grundlegende Studien als auch für Anwendungen mit fortschrittlichen Materialien. Die von den Mikroplasmen bereitgestellten chemischen und elektronischen Umgebungen sind stark ungleichgewichtig und können Energie speichern. In dieser Umgebung kann eine Vielzahl von Elektronen, Ionen, freien Radikalen und anderen angeregt-ionisierten Wirkstoffen produziert werden [21, 22]. Obwohl o -Phenylendiamin ist ein Rohstoff für die Synthese von Kohlenstoff-Nanopunkten, es wurde nicht in der Mikroplasma-Synthese verwendet [23,24,25].

In dieser Studie o -Phenylendiamin wurde als Rohstoff verwendet, um CQDs durch Mikroplasmabehandlung zu synthetisieren. Die mit dieser Methode erzeugten CQDs hatten eine einheitliche Größe (etwa 3,2 nm Durchmesser) und zeigten einen Emissionspeak bei etwa 550 nm. Wir zeigten, dass die neu synthetisierten CQDs unter Lichtbedingungen eine große Menge an ROS produzieren können. In vitro konnten CQDs von HeLa-Tumorzellen absorbiert werden und bei einer blauen Wellenlängenanregung bei 420–500 nm mit geringer Toxizität gelbes Licht emittieren. Wir beobachteten auch die Inaktivierung von HeLa-Tumorzellen unter Bestrahlung bei 460 nm. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die neu hergestellten CQDs vielversprechende Materialien für die In-vivo-Biobildgebung, bildgebungsgesteuerte oder gezielte Krebstherapie sein könnten.

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung von CQDs

Die gelb-emittierenden CQDs in dieser Studie werden auf einfache und umweltfreundliche Weise durch ein Mikroplasma-Verfahren unter Verwendung von o . hergestellt -Phenylendiamin als Kohlenstoffvorläufer. Obwohl berichtet wurde, dass das Verfahren der Mikroplasmaverarbeitung für die Synthese von Kohlenstoff-Nanopunkten verwendet wird, gibt es seltene relative Forschungen. Abbildung 1A zeigt Transmissionselektronenmikroskop(TEM)-Bilder der CQD-Partikel. Die durch Mikroplasma erzeugten Partikel waren zykloscharf oder oval mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 3,2 nm. Wie im hochauflösenden Bild Abb. 1A (Einschub) gezeigt, beträgt der Gitterabstand in den CQDs 0,21 nm und gehört zur (1,1,0)-Ebene von Graphit. Das Raman-Spektrum zeigt, dass der D-Modus, der als störungsinduzierter Modus bezeichnet wird, bei etwa 1342 cm ⁻¹ . liegt und G-Modus zentriert um 1507 cm ⁻¹ , bzw. aufgrund des Ergebnisses von sp ³ und sp ² -Hybridisierung von Kohlenstoff (Abb. 1E). Es ist bekannt, dass die Intensität des D-Modus im Vergleich zum G-Modus von der Größe der Graphitmikrokristalle in der Probe abhängt. Die höhere Unordnung der Probe führt zu einem höheren Intensitätsverhältnis von ID/IG und einem kleineren Graphitmikrokristall. Darüber hinaus kann der D- und G-Modus von CQD-Pulvern auch als kleine Graphitflocken mit einem relativ hohen Intensitätsverhältnis von ID/IG (0,77) angesehen werden.

Charakterisierungen von CQDs. A TEM-Bilder von CQDs (eingefügte, hochauflösende TEM-Bilder); B Größenverteilungen von CQDs; C UV-Vis-Absorptionsspektren der CQDs; D Das FL-Spektrum der CQDs mit Anregungswellenlängen von 400 bis 500 nm in 20 nm-Schritten; E , F Raman-Spektrum von CQDs und FTIR-Spektrum von CQDs

FTIR und XPS sind leistungsstarke Werkzeuge zur Charakterisierung der chemischen Zusammensetzung und Struktur von kohlenstoffbasierten Materialien. FTIR-Daten für CQDs wurden im Bereich von 400–4000 cm ⁻¹ . aufgezeichnet , wie in Abb. 1F gezeigt. Das FTIR-Spektrum zeigte, dass die CQDs hauptsächlich Amin (3052 und 3324 cm ⁻¹ .) enthalten ), OH (3200 cm ⁻¹ ), C=O (1595 cm ⁻¹ ), C–N/C–O (1200 cm ⁻¹ .) ), C=C (1500 cm ⁻¹ ) und CH (748 cm ⁻¹ ) funktionelle Gruppen oder chemische Bindungen [26, 27]. Die durch XPS bestimmten Oberflächenkomponenten der CQDs stimmten mit den FTIR-Ergebnissen überein. Das in Abb. 2A dargestellte Vollspektrum zeigte drei typische Peaks:C 1s (285 eV), N 1s (400 eV) und O 1s (531 eV).

XPS-Spektren von CQDs. A Full-Scale XPS-Spektren der CQDs; B Hohe Auflösung von C 1s Spektrum; C hohe Auflösung von N 1s Spektrum; D Hohe Auflösung von O 1s Spektrum

Wie in Abb. 2B–D gezeigt, ist ein C 1s Analyse ergab das Vorhandensein von sp ² /sp ³ Kohlenstoffe (C–C/C=C, 284,8 eV), nitrose Kohlenstoffe (C–O/C–N, 285,9 eV) und Carbonylkohlenstoffe (C=O, 287,7 eV). Die N 1s Bande wurde in drei Peaks bei 399,3, 400,3 und 401,7 eV entfaltet, die Pyrrol-N, Graphit-N bzw. Amino-N entsprechen. Die O 1s Bande enthielt Peaks bei 531,6 und 533,1 eV für C–O bzw. C=O [28, 29]. Wichtig ist, dass die Existenz dieser obigen funktionellen Gruppen den CQDs eine günstige Löslichkeit verleiht. Darüber hinaus wurden die optischen Eigenschaften von CQDs mit Fluoreszenzspektroskopie und UV-Vis-Absorption untersucht. Die Fluoreszenzemissionsspektren von CQDs sind in Abb. 1C gezeigt. Die hergestellten CQDs zeigen ein anregungsabhängiges Fluoreszenzemissionsverhalten. Bei Anregung mit Wellenlängen von 400 bis 500 nm wurde der maximale Fluoreszenzemissionspeak von 473 auf 519 nm rotverschoben und die Fluoreszenzintensität nahm stark ab [30]. Wie in Abb. 1D gezeigt, zeigten die UV-Vis-Spektren von CQD einen starken Absorptionspeak im Wellenlängenbereich von 400–490 nm. Die CQDs zeigten zwei charakteristische Absorptionspeaks bei 280 und 420 nm, die sich auf -π*- (aromatische C=C) bzw. n-π*-Übergänge (Carboxyl und/oder C-N) bezogen [31, 32]. Daher ermöglichten diese optischen Eigenschaften von CQDs die gleichzeitige biologische Bildgebung und photodynamische Inaktivierung.

Bioimaging und Zytotoxizität von CQDs

Um die Fähigkeit von CQDs für Bioimaging und Zellmarkierung zu bewerten, wurde die in vitro zelluläre Bildgebung unter Verwendung von CQDs an HeLa-Zellen mit einem konfokalen Laserscanningmikroskop (CLSM) untersucht. Hela-Zellen wurden mit 200 μg mL ⁻¹ . inkubiert CQDs für 6 Stunden und dann für die CLSM-Erkennung vorbereitet. Als Ergebnis zeigten HeLa-Zellen eine hellgelbe Fluoreszenz, die gleichmäßig über die Zelle verteilt war (Abb. 3A). Noch wichtiger ist, dass eine niedrige CQD-Konzentration von 200 μg ml ⁻¹ reichte aus, um Hela-Zellen mit gelber Fluoreszenz zu markieren, was die Möglichkeit von CQDs in der Zellbildgebung weiter spezifizierte. Wie berichtet wurde, zeigten Kohlenstoff-Nanopartikel immer nur im Blaulichtbereich eine starke Emission, während die langwelligen Emissionen normalerweise schwach waren. Unter UV-Anregung zeigten biologische Gewebe häufig blaue Autofluoreszenz und waren anfällig für Lichtschäden, was die Anwendungen der biologischen Bildgebungsanalyse von Kohlenstoffnanopartikeln mit kurzwelligen Emissionen ernsthaft behindert [33]. Daher war die Entwicklung von Kohlenstoff-Nanopartikeln mit langwelligen Emissionen breit gefächert. In der vorliegenden Studie zeigten die so hergestellten CQDs bei Anregung mit 400–450 nm Licht eine leuchtend gelbe Fluoreszenz. Die angeregte gelbe Fluoreszenz könnte dabei die Verwendung von CQDs zum Nachweis tief sitzender Tumoren ermöglichen. Bis zur praktischen Anwendung in der Krebsbildgebung beim Menschen ist es jedoch noch ein weiter Weg.

Anwendung von CQDs. A CLSM-Bildgebung von mit CQDs markierten HeLa-Zellen; B In-vitro-Zytotoxizitätstest von CQDs; C Relative Lebensfähigkeit von HeLa-Zellen, die mit Kontrolllösung oder CQDs inkubiert wurden (200 μg ml ^–1 ) und blauem Licht ausgesetzt (460 nm, 30 mW cm ⁻² .) ) für 5 Minuten, 10 Minuten und 15 Minuten; D Die IC50 von angeregten CQDs auf Hela-Zellen nach 10 und 15 min blauem Licht (*P < 0.05)

Neben der Lumineszenzeigenschaft sind immer eine hohe Biokompatibilität und geringe Toxizität erforderlich, wenn CQDs als potenzielles Biomarkierungsreagenz entwickelt werden sollen. Für biomedizinische Anwendungen müssen Materialien bei empfohlenen Dosierungen hoch biokompatibel sein. Zur Untersuchung der Zytotoxizität wurden HeLa-Zellen mit CQDs in Endkonzentrationen von 0 bis 400 μg ml ^-1 . behandelt für 24 Std. Wie in Abb. 3B gezeigt, überlebten mehr als 95 % der Zellen, wie durch MTT-Tests (3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) bestimmt wurde. giftig.

Diese Daten legen nahe, dass die neu generierten CQDs mit angeregter gelber Fluoreszenz eine geringe Zytotoxizität und hohe Biokompatibilität aufweisen, was ihre vielversprechende Aussicht auf eine biologische Bildgebung erleichtert.

Wirksamkeit der photodynamischen Therapie

Inaktivierung von Krebszellen

Wie in Fig. 3C gezeigt, unterschied sich die Lebensfähigkeit nicht zwischen HeLa-Zellen, die mit CQDs oder blauem Licht allein behandelt wurden. Die gleichzeitige Behandlung mit CQDs und blauem Licht reduzierte die Lebensfähigkeit der Hela-Zellen in Abhängigkeit von der Dauer der Belichtung deutlich. Nach 15-minütiger Bestrahlung bei 460 nm zeigten die CQDs eine bemerkenswerte Antitumoraktivität; die Lebensfähigkeit von HeLa-Zellen nahm bei einer Konzentration von 200 μg ml ⁻¹ . um etwa 40 % ab . Um die Effekte der angeregten CQDs weiter nachzuweisen, wurden MTT-Assays implementiert, um die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) von angeregten CQDs auf Hela-Zellen zu bewerten. Als Ergebnis betrug die IC50 von CQDs nach Anregung auf Hela-Zellen etwa 427,5 μg mL ⁻¹ (95 %-KI 366,7–498,7 μg ml ^–1 .) ) nach einer 10-minütigen Bestrahlung und betrug ungefähr 255,1 μg ml ⁻¹ (95 %-KI 220,9–249,8 μg ml ^–1 .) ) nach 15 Minuten blauem Licht.

Diese Ergebnisse zeigten, dass die angeregten CQDs Tumorzellen effektiv abtöten könnten, wie einige klinische Krebsmedikamente wie Photofrin [34], was den vielversprechenden Wert von CQDs in der bildgebenden Antitumortherapie begründete.

ROS-Generierung von CQDs

Während der PDT können Krebszellen durch zytotoxische ROS abgetötet werden, die durch den endozytosierten Photosensibilisator unter geeigneten Bestrahlungsbedingungen erzeugt werden [35, 36]. ROS kann Zielzellen durch Apoptose oder Nekrose mit geringen Nebenwirkungen über PDT bei mehreren Erkrankungen inaktivieren [37,38,39,40]. Die Untersuchung von Fig. 4A zeigte, dass das ROS-Reagens rote Fluoreszenz emittiert, was auf die Bildung von ROS hinweist. Darüber hinaus überlappte das rote Signal von ROS gut mit der Fluoreszenz von CQDs, was bedeutet, dass die Bildung von ROS eng mit der Aufnahme von CQDs durch Tumorzellen verbunden war. Wie in Abb. 4B gezeigt, zeigten die experimentellen Gruppen unter 460 nm-Laserbestrahlung für 15 Minuten im Vergleich zu den Kontrollgruppen und den Gruppen ohne Laserbestrahlung eine offensichtliche ROS-Erzeugung. Unsere Ergebnisse zeigten, dass CQDs die Produktion des intrazellulären ROS unter der Bestrahlung mit einem 460-nm-Laser signifikant fördern könnten und ein großes Potenzial für die Anwendung bei der PDT haben. Im Prinzip können die CQDs vom Grundzustand (S0 in Abb. 4C) in einen angeregten Zustand (Sn in Abb. 4C) angeregt werden, und die Effizienz dieses Prozesses wird durch die Intensität der Lichtquelle und den Extinktionskoeffizienten bestimmt . Nach lösungsmittelvermittelter Relaxation verbleiben CQDs auf dem niedrigsten Schwingungsniveau des ersten angeregten Singulettzustands. Aufgrund der schnellen Schwingungsrelaxation nach der Anregung ist die Energie des Photons, das vom ersten angeregten Singulett-Zustand (S1 in Fig. 4C) emittiert wird, niedriger als die Energie des Anregungsphotons, was zu einer Wellenlängenerhöhung führt. Die Fluoreszenzbildgebung nutzt den CQDs-Übergang von S0 zu Sn zu S1 [41]. Die CQDs wurden von HeLa-Tumorzellen aufgenommen und emittierten Fluoreszenz, wenn sie mit einer geeigneten Wellenlängenquelle beleuchtet wurden, wodurch die Zellen markiert werden konnten. S1 kann durch Fluoreszenz oder durch Intersystem-Crossing in einen nicht fluoreszierenden angeregten Triplett-Zustand (T1 in Abb. 4C) in den S0-Zustand zurückkehren [7, 42]. Die fluoreszierende Gruppe von T1 ist besonders aktiv bei Elektronentransferreaktionen, wodurch freie Superoxid-Radikale erzeugt werden, die anschließend zum Abbau der fluoreszierenden Gruppe führen. Die Energie von T1, die auf molekularen Sauerstoff übertragen wird, würde ein angeregtes Singulett-Sauerstoff-Oxidationsmittel erzeugen, das stärker ist als molekularer Sauerstoff im Grundzustand. Die Superoxidradikale und Singulett-Sauerstoff sowie andere ROS, einschließlich OH und H₂ O₂ , reagieren mit benachbarten biologischen Molekülen, um Phototoxizität auszuüben, was zum Zelltod führt. Nachdem die CQDs von HeLa-Zellen aufgenommen wurden, führte die Beleuchtung zum Übergang des Singulett-Zustands in den Triplett-Zustand durch das Intersystem, und der Prozess der Energieübertragung erzeugte ROS und führte schließlich zum Zelltod. Unter der geeigneten Wellenlängenquelle durchlaufen die CQDs zwei Arten von Energieübertragungen. Fluoreszenz wurde emittiert, um HeLa-Tumorzellen zu markieren, und HeLa-Zellen wurden durch ROS abgetötet. Unsere experimentellen Daten zeigten die gute Biokompatibilität der neu produzierten CQDs im Dunkeln und die tumortötende Effizienz unter Lichtbedingungen. Daher könnten die CQDs als Photosensibilisator für Tumorzellen und -gewebe verwendet werden.

Intrazelluläre ROS-Erzeugung. A Fluoreszenzbilder von HeLa, (a) Hellfeld-Transmissionsbild, (b) CQDs-Fluoreszenzbild aufgenommen im Bereich von 400–450 nm, (c) ROS-Detektionsreagenz-Fluoreszenzbild aufgenommen im Bereich von 510–530 nm und (d ) das zusammengeführte Bild; B Die intrazelluläre ROS-Produktion für verschiedene Konzentrationen von CQDs mit oder ohne Bestrahlung für 15 Minuten; C ein vereinfachtes Energieniveaudiagramm zeigt mögliche Energieübertragungswege für Fluoreszenz und Zelltod. (S0, Grundzustand des Fluorophormoleküls; S1, erster angeregter Singulettzustand; Sn (n> 1); T1, erster angeregter Triplettzustand; Bsp. Anregung durch Photonenabsorption; FL, Fluoreszenz)

Darüber hinaus ist es immer noch ein ungelöstes Problem, wie CQDs gezielt auf Tumoren abzielen und Tumorzellen effektiver abtöten können. Die vorhandene Fülle an oberflächenfunktionellen hydrophilen Gruppen (Carboxyl, Carbonyl, Epoxy, Hydroxyl, Hydroxyl usw.) ermöglicht es Kohlenstoffpunkten, mit spezifischen Antikörpern zu konjugieren, die genau auf Tumore abzielen könnten, und dies erfordert, dass Tumore spezifische Biomarker aufweisen. Gleichzeitig könnten Kohlenstoffpunkte aufgrund ihres hohen Oberflächen-Volumen-Verhältnisses auch als Werkzeug für die Wirkstoff- und Genabgabe dienen [43]. In Anbetracht der ausgezeichneten Biokompatibilität, der geringen Größe für die Internalisierung durch Tumorzellen, des Reichtums an funktionellen Oberflächeneinheiten und der Bioimaging-Potenziale wird angenommen, dass Kohlenstoffpunkte (einschließlich CQDs) vielversprechende theranostische Kandidaten für die Tumortherapie werden. Es gibt jedoch noch Herausforderungen und viele ungelöste Probleme für die Anwendung von Kohlenstoffpunkten in der Nanomedizin und Biobildgebung. Es sollten mehr Anstrengungen unternommen werden, um in Zukunft die Übertragung der Kohlenstoffpunkt-bezogenen Nanomedizin von der Laborbank auf das Krankenbett zu fördern.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend haben wir photolumineszente CQDs mit o . synthetisiert -Phenylendiamin nach der Plasmamethode. Von einem blauen Laser angeregt, emittierten CQDs mit einem Durchmesser von etwa 3,2 nm gelbe Fluoreszenz. Raman-, UV-vis-, FTIR- und XPS-Ergebnisse zeigten, dass mehr Kohlenstoffatome an sp . beteiligt waren ² Hybridisierung, Bildung einer neuen organischen Gruppe. Mit der Plasmamethode synthetisierte CQDs erwiesen sich als wirksame Sonde in Zell-Imaging-Experimenten, und die von CQDs emittierte gelbe Fluoreszenz kann HeLa-Zellen deutlich markieren. Darüber hinaus zeigten die synthetisierten CQDs eine günstige Löslichkeit, Ungiftigkeit und eine hohe Biokompatibilität, was ihre Fähigkeit zur Bio-Bildgebung beschleunigen könnte. Darüber hinaus konnten die angeregten CQDs Hela-Zellen durch ROS-Erzeugung effektiv abtöten, was eindeutig eine zufriedenstellende photodynamische Zytotoxizität von CQDs in vitro zeigte und ihre Anwendungen in der PDT unterstützte.

Experimentelle Methoden

Synthese von Kohlenstoffquantenpunkten

Das Mikroplasma-Verarbeitungssystem ist in Zusatzdatei 1 zusammengefasst:Abbildung S1. Ein hohles rostfreies Rohr mit einem Innendurchmesser von 180 μm wurde an eine Hochspannungs-Gleichstromquelle (Tianjin Dongwen High-Voltage Supply Co., Ltd., Tianjin, China) angeschlossen und in einer Höhe von 2 mm über der Oberfläche des Lösung. Eine Pt-Elektrode (DJS-1; Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China) wurde an die Kathode der Stromquelle angeschlossen und in die Lösung eingetaucht. Dann 400 mg o -Phenylendiamin (Shanghai, China) wurde in 40 ml entionisiertem Wasser und 20 ml des o -Phenylendiaminlösung wurde in eine Petrischale gegeben und unter Verwendung eines Magnetrührers gerührt. Während der Mikroplasmabehandlung strömte Argon (Ar)-Gas mit einer Flussrate von 60 sccm durch das Rohr, und der Gleichstrom wurde bei 17 mA gehalten. Nach 10 min Plasmabehandlung wurde das bräunlich-schwarze Produkt mit einer Dialysemembran (Molekulargewichtsgrenzwert, 500 Da) gegen 2 L entionisiertes Wasser für 12 h dialysiert und anschließend durch eine 0,22 μm-Ultrafiltrationsmembran filtriert. Schließlich wurden reine CQDs durch Gefriertrocknung erhalten.

Charakterisierung der Struktur, Zusammensetzung und optischen Eigenschaften von CQDs

Die Größe und Morphologie der CQDs wurden durch TEM unter Verwendung eines JEM-2100F-Systems (JEOL, Tokio, Japan) charakterisiert. Fluoreszenzspektroskopie wurde unter Verwendung eines Perkin Elmer LS 55 Lumineszenzspektrometers (Waltham, MA, USA) durchgeführt. Die UV/Vis-Absorptionsspektren wurden mit dem Varian Cary 50 UV-VIS-Spektrophotometer (Palo Alto, CA, USA) gemessen. FTIR-Spektren wurden unter Verwendung eines Nicolet 6700-Spektroskops (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) erhalten, und die Raman-Spektroskopie wurde unter Verwendung des 800-UV-Mikro-Raman-Spektrometers (Invia-reflex, UK) durchgeführt. XPS-Experimente wurden mit einem Axis Ultra DLD-System (Shimadzu/Kratos Analytical Ltd., Kyoto, Japan) durchgeführt.

Zellkultur- und Zytotoxizitäts-Assay

HeLa-Zellen (ATCC, Manassas, VA, USA) wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO₂ . kultiviert Atmosphäre. Für Zytotoxizitätsstudien von CQDs wurden die Zellen gezählt und in 96-Well-Platten mit 200 μl Komplettmedium mit einer Dichte von 6000 Zellen pro Well ausgesät. Nach 24 Stunden Kultur wurden die Zellen mit CQDs in Konzentrationen von 0, 25, 50, 100, 200 und 400 μg ml ⁻¹ . inkubiert für weitere 24 Stunden, und dann wurden die Zelllebensfähigkeiten mit MTT-Assays nachgewiesen, um die Zytotoxizität von CQDs zu beurteilen. Kurz gesagt, diese Lösungen wurden durch 100 μl MTT-Testlösung (0,5 mg ml ^-1 ) und 4 h in einem Brutschrank im Dunkeln inkubiert. Der Überstand wurde entfernt und die Kristalle wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Schließlich wurde die Absorption jeder Vertiefung bei 490 nm gemessen. Die optische Dichte wurde mit der Lebensfähigkeit der Zellen in Beziehung gesetzt, indem eine Lebensfähigkeit von 100 % für die Kontrollprobe ohne CQDs angenommen wurde.

Der MTT-Assay wurde auch verwendet, um die IC50 von angeregten CQDs auf Hela-Zellen zu bestimmen. Kurz gesagt, Hela-Zellen in 96-Well-Platten wurden mit CQDs in Konzentrationen von 0, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1600, 3200 und 6400 μg ml ^-1 für 24 h im Inkubator, mit Licht bei 460 nm für 10 min oder 15 min separat behandelt und dann für weitere 24 h kultiviert. Die Zelllebensfähigkeit jedes Wells wurde unter Verwendung des MTT-Assays nachgewiesen und die Daten wurden für die IC50-Bewertung verwendet.

Zellbildgebung

Zellen mit einer Konzentration von 2 × 10 ⁴ ml ⁻¹ wurden in eine konfokale Schale (Durchmesser = 15 mm) ausgesät, für 24 h kultiviert und zweimal mit PBS gewaschen, um sicherzustellen, dass keine toten Zellen vorhanden sind. Eine CQD-Lösung (200 μg ml ⁻¹ ; pH 7) wurde zugegeben und die Zellen wurden 6 h lang inkubiert. Die Zellen wurden anschließend dreimal mit PBS gewaschen, um ungebundene CQDs zu entfernen, und mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Dann wurden die Proben mit einem CLSM (LSM510, Zeiss, Deutschland) mit Anregung bei Wellenlängen im Bereich von 400 bis 450 nm beobachtet.

Photodynamische Therapie und ROS-Messung

Um Antitumorwirkungen zu untersuchen, wurden HeLa-Zellen mit 200 μg ml ⁻¹ . inkubiert CQDs für 24 h bei 37 °C im Dunkeln und mit Licht bei 460 nm (30 mW cm ⁻² . behandelt) ) für 5, 10 und 15 Minuten. Nach 24 Stunden Inkubation wurde ein Standard-MTT-Assay durchgeführt, um die relative Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Die intrazelluläre Bildung von ROS wurde chemisch unter Verwendung der spektrophotometrischen Methode mit dem Fluorometric Intracellular Ros Assay Kit (Sigma, USA) nachgewiesen. Die Zellen wurden in einer konfokalen Schale (Durchmesser =  15 mm) über Nacht zur Zellanhaftung kultiviert. Dann wurden die Zellen mit 200 μg mL ^–1 . inkubiert CQDs für 4 Stunden. Anschließend wurden 100 μl/Well des Master-Reaktionsmixes hinzugefügt. Nach 1 h Inkubation wurden die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 10 Minuten fixiert und Fluoreszenzbilder der Zellen wurden durch CLSM beobachtet. Zum Nachweis der ROS-Produktion wurden Zellen in 96-Well-Platten mit 200 μl Kulturmedium kultiviert. Nach 24 Stunden Inkubation wurde das Medium durch 100 μl CQDs-Lösung in den Konzentrationen 0, 100, 200 μg ml ⁻¹ . ersetzt , und die Zellen wurden weitere 4 h inkubiert. Anschließend wurden die Proben dreimal mit PBS gewaschen, 15 min oder nicht bestrahlt und 1 h mit 100 μL/Well Master Reaction Mix inkubiert. Schließlich wurde die Fluoreszenzintensität mit einem Fluoreszenzlesegerät (520 nm Anregung, 605 nm Emission) erfasst.

Statistische Analysen

Die an dieser Studie beteiligten Experimente wurden dreimal wiederholt und statistische Analysen wurden mit SPSS19.0 durchgeführt. Die Unterschiede zwischen den beiden Gruppen wurden mit Mann-Whitney U . verglichen Prüfung. Der IC50 von angeregten CQDs auf Hela-Zellen wurde unter Verwendung nichtlinearer Regression bewertet. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle Daten und Materialien der aktuellen Studie sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Abkürzungen

PDT:

Photodynamische Therapie

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies

CQDs:

Kohlenstoff-Quantenpunkte

TEM:

Transmissionselektronenmikroskop

CLSM:

Konfokales Laser Scanning Mikroskop

DMEM:

Dulbeccos modifiziertes Adlermedium

MTT:

3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid

DMSO:

Dimethylsulfoxid

IC50:

Halbmaximale Hemmkonzentration