Regulierte Oberflächenmorphologie von zusammengesetzten Nanofasern aus Polyanilin/Polymilchsäure durch Dotierung verschiedener anorganischer Säuren zur Verbesserung der Biokompatibilität in der Gewebezüchtung

Einführung

Extrazelluläre Matrix (ECM) ist eine Art makromolekulares Netzwerk, das von Zellen in das extrazelluläre Stroma sezerniert wird. Es stellt die Grundlage von Zellen, Geweben und Organen dar, begleitet von Organen und zeichnet sich durch eine komplexe Gitterstruktur aus [1, 2]. Darüber hinaus bietet es einen geeigneten Ort für das Überleben und die Aktivität von Zellen, indem es ihre Form bestimmt, ihre Differenzierung kontrolliert, an ihrer Migration und ihrem Stoffwechsel teilnimmt und letztendlich ihr Überleben, Wachstum und ihren Tod beeinflusst [3, 4]. Elektrospinnende Nanofasern können aufgrund ihrer hohen spezifischen Oberfläche, geeigneten mechanischen Eigenschaften und biologischen Abbaubarkeit die Wirkung der extrazellulären Matrix simulieren, um das Zellverhalten zu regulieren. Darüber hinaus können elektrospinnende Nanofasern durch Oberflächenmodifizierung auf der Grundlage der Beibehaltung ihrer porösen Struktur multifunktional sein. Daher sind elektrospinnende Nanofasern zu einem vielversprechenden Materialkandidaten in der Gewebezüchtung geworden, das in der Wirkstoffabgabe, orthopädischen Regeneration, Nervenregeneration und -reparatur weit verbreitet ist [5,6,7,8,9,10].

Leitfähige Polymere (z. B. Polypyrrol [PPy], Polythiophen [PTH] und Polyanilin [PANI]) haben eine gute In-vitro- und In-vivo-Biokompatibilität, die die Zelladhäsion, -proliferation und -differenzierung sowie die Geweberegeneration signifikant beeinflussen kann [11,12 ,13]. Unter diesen leitfähigen Polymeren gilt PANI aufgrund seiner guten Verarbeitbarkeit, hervorragenden Leitfähigkeit, guten Redoxstabilität und Biokompatibilität als potenzielles Material für das Tissue Engineering und die regenerative Medizin [14, 15]. Unter elektrischer Stimulation kann PANI die Zelladhäsion, -proliferation, -migration und -differenzierung regulieren [16, 17]. Tatsächlich kamen zahlreiche Berichte zu dem Schluss, dass leitfähige, abbaubare Verbundnanofasern auf PANI-Basis das Zellverhalten unter einem elektrischen Feld fördern [18,19,20,21]. Dies bringt jedoch ein entscheidendes Problem mit sich, dass die Leitfähigkeit von PANI in physiologischer Umgebung (pH = 7,4) aufgrund der Dedotierung von PANI geschwächt wird, was, wie frühere Studien gezeigt haben, seine Vorteile der elektrischen Aktivität bei der Förderung der Zellproliferation und -differenzierung verringert [22] . Dies stellt zwar eine klare Einschränkung von PANI-basierten leitfähigen abbaubaren Nanofasern beim Knochengewebe-Engineering unter externer elektrischer Stimulation dar, sie können jedoch dennoch die Zellproliferation und das Zellwachstum in erheblichem Maße fördern [23, 24]. Hier spekulierten wir, dass die Oberflächenmorphologie von PANI die Rauheit der zusammengesetzten Nanofasern erhöht, was der Zelladhäsion, dem Wachstum und der Proliferation förderlich ist.

Mit anorganischen Säuren dotiertes Polyanilin weist im Allgemeinen eine gute elektrische Leitfähigkeit auf. Die Anionen, die durch verschiedene anorganische Säure-Dotierstoffe eingeführt werden, beeinflussen jedoch die Leitfähigkeit und Struktur von Polyanilin [25,26,27]. In diesem Papier werden drei gängige anorganische Säuren, nämlich Salzsäure (HCl, HA), Schwefelsäure (H₂ SO₄ , SA) und Perchlorsäure (HClO₄ , PA), wurden als Dotierstoffe in einer PANI-in-situ-oxidativen Polymerisation ausgewählt. Anschließend wurden die mechanischen Eigenschaften, Benetzbarkeit, Oberflächenmorphologie, Biokompatibilität und Zelladhäsion von PANI/Polymilchsäure (PLA)-Nanofasern unter verschiedenen Säuredotierungen untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die Zellproliferation umso besser ist, je höher die Oberflächenrauhigkeit des PANI ist, was eine bessere Biokompatibilität zeigt.

Methoden/Experimental

Chemikalien

Anilin (AN) wurde von Sigma, PLA (M =60.000) wurde von Solarbio bezogen, Dichlormethan (DCM) wurde von Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. bezogen, und N,N-Dimethylformamid (DMF) wurde von Macklin bezogen. Inzwischen wurde Ammoniumpersulfat (APS) von Aladdin, HCl und H₂ . gekauft SO₄ wurden von Guangzhou Chemical Co., Ltd. gekauft, und HClO₄ wurde von Macklin gekauft.

Herstellung von Polyanilin/Polymilchsäure-Nanofasern

Herstellung elektrospinnender Polymilchsäure-Nanofasern

PLA-Partikel mit einer spezifischen Masse wurden in eine Mischlösung aus DCM und DMF (Volumenverhältnis von 7:3) gegeben, bevor sie gerührt wurden, bis sie sich auflösten, und eine Mischlösung von 10 % PLA wurde erhalten. Anschließend wurde die PLA-Lösung in eine Spritze abgefüllt und an eine Hochspannungsstromversorgung angeschlossen. Die Elektrospinnmaschine (DP-30, Tianjin Yunfan Technology Co., Ltd.) wurde auf eine Spannung von 15 kV und einen Abstand von 15 cm eingestellt. Die erhaltenen PLA-Nanofasern wurden über Nacht bei 40 °C vakuumgetrocknet.

Herstellung von Polyanilin/Polymilchsäure-Nanofasern, die mit verschiedenen anorganischen Säuren dotiert sind

Die PLA-Nanofasern wurden in die Kammer der Plasmareinigungsmaschine (PCE-6, MTI Corporation, USA) gelegt und 2 min bei 30 W HF-Leistung entladen. In diesem Artikel werden drei gängige anorganische Säuren, nämlich HCl, H₂ SO₄ , und HClO₄ , wurden als Dotierstoffe für die oxidative In-situ-Polymerisation bei der Herstellung von PANI/PLA-Nanofasern verwendet [24], und die entsprechenden PANI-Nanofasern wurden als PANI-HA, PANI-SA bzw. PANI-PA bezeichnet, während die PANI/PLA Nanokomposit-Nanofasern wurden als PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA bzw. PANI/PLA-PA bezeichnet. Der Herstellungsprozess von PLA- und PANI/PLA-Komposit-Nanofasern ist in Abb. 1 dargestellt.

Schematische Darstellung des Herstellungsprozesses von PLA- und PANI/PLA-Komposit-Nanofasern

PANI/PLA-Nanokomposit-Nanofasern wurden unter Eisbadbedingungen hergestellt [16, 28]. APS und AN wurden in einem Molverhältnis von 1:1 zu einer 1 M Säurelösung gegeben. Hier nehmen wir das HCl als Beispiel, um den Herstellungsprozess von PANI/PLA-Nanofasern zu veranschaulichen. Unter Eisbadbedingungen wurde das AN (930 mg, 0,01 mol) tropfenweise in APS (2.280 mg, 0,01 mol) gegeben und in 50 ml 1 M HCl gelöst. Sofort wurde die plasmabehandelte PLA-Nanofasermembran in die Lösung eingetaucht und 2 h bei 0 °C gerührt. Nach der Reaktion wurde die PLA-Nanofasermembran mehrmals mit HCl und Ethanol gereinigt, um das nicht angelagerte PANI zu entfernen, bevor sie über Nacht bei 40 °C getrocknet wurde, um PANI/PLA-HA-Nanofasern zu erhalten, die zur späteren Verwendung beiseite gelegt wurden. Die zusammengesetzten Nanofasern PANI/PLA-SA und PANI/PLA-PA wurden nach einem ähnlichen Ansatz hergestellt.

Charakterisierung

Die einachsigen Zugversuche für die PLA-Nanofasern und PANI/PLA-Komposit-Nanofasern wurden über einen Dehnungs-Belastungs-Test (Shimadzu AGX-PLUS, Japan) durchgeführt. Hier wurde die Probe in eine hantelähnliche Form geschnitten, wobei die Zuggeschwindigkeit konstant bei 3 mm/min gehalten wurde. Der Elastizitätsmodul wurde aus dem linearen Bereich von 0–15 % der Dehnung in der Spannungs-Dehnungs-Kurve berechnet, und die Zugfestigkeit und Bruchzugrate der Kurve wurden aus dem Bruch der Nanofasermembran bestimmt.

Die Morphologie der Nanofasergerüste wurde mittels Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie (FE-SEM) (Hitachi-SU8220, Japan) charakterisiert, um die unterschiedlichen Morphologien des mit verschiedenen anorganischen Säuren dotierten PANI zu beobachten. Vor der REM-Beobachtung wurden die Nanofaserproben 60 s lang mit Gold besprüht, um eine klarere Beobachtung der Morphologie zu ermöglichen. Währenddessen wurde die Oberflächenrauheit der PANI/PLA-Komposit-Nanofasern mit Rasterkraftmikroskopie (AFM, Bruker Dimension Edge) gemessen. Um zu bestätigen, dass PANI vollständig auf die PLA-Nanofasern geladen war, wurde Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) (Thermo Nicolet iS50) verwendet, um die Wellenlängenänderung von 2000 ~ 500 cm ⁻¹ . zu messen . Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS; Thermo ESCALAB 250) und Al-Kα wurden als Röntgenemissionsquellen verwendet, um die Oberflächenzusammensetzung der PANI/PLA-Nanofasern weiter zu bestimmen, während ihre Benetzbarkeit als Kontaktwinkel von . gemessen wurde die Wassertröpfchen bei Umgebungstemperatur mittels Kontaktwinkelanalyse (OCA 15 plus, Deutschland). Der Abbau der Nanofasern wurde mit einer Massenverlustmethode bewertet [29, 30]. Die Nanofasermembranen wurden in 16-mm-Scheiben geschnitten und in 20 ml Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) mit einem pH-Wert von 7,4 gelegt, bevor die Gerüste bei 37 °C für 7, 14 und 21 Tage inkubiert und auf ein konstantes Gewicht getrocknet wurden .

Biokompatibilität von Nanofaser-Gerüsten aus PANI/PLA-Komposit

Biokompatibilität

In diesem Artikel wurde die Biokompatibilität von Nanofasergerüsten aus PANI/PLA-Verbundstoffen durch ein Zellaktivitätsexperiment mit humanem Osteosarkom (HOS) charakterisiert. HOS-Zellen wurden von der Zellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften in Shanghai bezogen. Die HOS-Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit niedrigem Glukosegehalt kultiviert, das 10 % fötales Rinderserum, 100 E/ml Penicillin und 100 E/ml Streptomycin enthielt, bevor sie bei 37 °C und 5 % CO_{2 . inkubiert wurden} . Als das Zellwachstum einen Fusionsgrad von 90 % erreichte, wurden die Zellen im Verhältnis 1:3 passagiert.

Die HOS-Zellen mussten vor dem Zellproliferationstest auf die PANI/PLA-Nanofasern ausgesät werden. Hier wurden die Nanofasern so in eine 96-Well-Platte eingebracht, dass sie den Plattenboden vollständig bedeckten, bevor sie 30 min über UV und 30 min über eine 75%ige Ethanollösung sterilisiert wurden. Sie wurden dann mit PBS gewaschen. Die Nanofasern wurden dann mit einem 1 × 10 ⁴ Well-Dichte, während gleichzeitig eine Blind- und eine Kontrollgruppe aufgestellt wurden. Die Zellen wurden dann in einem Zellinkubator bei 37 °C für einen, drei und fünf Tage inkubiert, wobei das Medium alle zwei Tage aufgefrischt wurde.

Die Zelllebensfähigkeit der PANI/PLA-Nanofasern wurde mit einem 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromid (MTT)-Assay bewertet. Nach einer Inkubation nach einem, drei und fünf Tagen wurde das Medium von der 96-Well-Platte entfernt und dreimal mit PBS gewaschen, bevor 1 ml DMEM, das 10 % 5 mg/ml MTT enthielt, zugegeben wurde. Das Medium wurde dann 4 h bei 37 °C inkubiert und dann entfernt, bevor DMSO zugegeben wurde, um das Methylprednisolon aufzulösen. Das Medium wurde 10 min vibriert und dann wurde die Extinktion bestimmt (BioTek Synergy HTX, USA).

Fluoreszierende Immunfärbung

Die HOS-Zellen wurden 24 h im PANI/PLA-Nanofaser-Inkubator inkubiert und dreimal mit PBS gewaschen. Dann wurden die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 10 min bei Raumtemperatur fixiert. Die fixierten Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen (jeweils 10 min) und 10 μL 100 nM FITC-markiertes Peptid wurden zugegeben, bevor die Zellen 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und dann dreimal mit PBS gewaschen wurden (jeweils 5 min). ). Das extrazelluläre Aktin der HOS-Zellen wurde mit konfokaler Mikroskopie (Typ A1, Nikon, Japan) gefärbt, um die Zellfärbung bei einer 20 -fachen Vergrößerung zu beobachten.

Zellenhaftung

Die Adhäsion der HOS-Zellen auf den Nanofasergerüsten aus PANI/PLA-Komposit wurde mittels SEM beobachtet. Hier wurde das Kulturmedium nach der 24-h-PANI/PLA-Nanofaser-HOS-Zellkultur entfernt und anschließend dreimal mit PBS gewaschen, bevor 4% PFA zugegeben wurden. Das Medium wurde über Nacht bei 4 °C fixiert, dreimal mit PBS gewaschen, mit einer Gradienten-Ethanollösung (30 %, 50 %, 70 %, 85 %, 90 % bzw. 100 %; jeweils 20 min) dehydratisiert und dann 24 h gefriergetrocknet. Vor der REM-Beobachtung wurden die Nanofasern 120 s lang mit Platin besprüht, um eine bessere Beobachtung zu ermöglichen.

Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP)

ALP ist einer der häufig verwendeten Marker für die frühe Osteoblastendifferenzierung, die von der Expression des Enzyms alkalische Phosphatase abhängen. Hier wurde die ALP-Aktivität unter Verwendung des ALP-Assay-Kits (Beyotime Biotechnology, P0321S) durchgeführt. Die HOS-Zellen wurden auf verschiedenen PANI/PLA-Verbundgerüsten für die bezeichneten 7 Tage kultiviert. Die Zellen wurden unter Verwendung von 50 µl Tris-HCl (0,1 M, pH 8) mit 0,1% (v/v) Triton X-100 lysiert. Die ALP-Aktivität wird durch Quantifizierung der Konzentration von p . analysiert -Nitrophenol aus p -Nitrophenylphosphat (PNPP), das durch Aufzeichnung der Absorption bei 405 nm geschätzt wird. Die prozentuale ALP-Aktivität der entlang der PANI/PLA-Nanofasern kultivierten Zellen wird berechnet, indem die ALP-Aktivität der auf unberührten PLA-Nanofasern kultivierten Zellen verglichen wird.

Statistische Analyse

Die statistische Signifikanz der Ergebnisse wurde mittels Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) mit GraphPad Prism (Version 8.02) bewertet. Hier wurden die Unterschiede in den mechanischen Eigenschaften, der biologischen Abbaubarkeit in vitro und der Zelllebensfähigkeit zwischen den verschiedenen PANI/PLA-Komposit-Nanofasergerüsten analysiert. Die Ergebnisse wurden als signifikant erachtet, wenn p < 0,05 (∗) und sehr signifikant, wenn p <0,005 (∗∗).

Ergebnisse und Diskussion

Die mechanischen Eigenschaften von Tissue-Engineering-Scaffolds sind wichtige Indikatoren bei der Bewertung, ob die Scaffolds der Fluiddynamik standhalten. Die Anwesenheit von anorganischen Säuren kann die physikalischen und chemischen Eigenschaften der PLA-Matrix von PANI/PLA-Komposit-Nanofasern im in situ-chemischen Oxidationspolymerisationsprozess von PANI beeinflussen. Daher ist es notwendig, die mechanischen Eigenschaften von mit anorganischen Säuren dotierten PANI/PLA-Komposit-Nanofasern zu untersuchen. Hier wurden die mechanischen Eigenschaften von PANI/PLA-Komposit-Nanofasern über einen Zugversuch bewertet, der in Abb. 2 dargestellt ist, einschließlich Spannung-Dehnung, Elastizitätsmodul, Zugfestigkeit und Bruchdehnung. Wie in Abb. 2a gezeigt, zeigten die PLA-Nanofasern ein linear-elastisches Verhalten, und die PANI/PLA-HA- und PANI/PLA-SA-Verbund-Nanofasern zeigten ein klares Fließverhalten, während die PANI/PLA-PA-Verbund-Nanofasern unmittelbar nach der elastischen Verformung brachen . Der Elastizitätsmodul (Abb. 2b) der PANI/PLA-Komposit-Nanofasern war höher als der der PLA-Nanofasern. Im Vergleich zu PLA betrug der Anstieg des Elastizitätsmoduls von PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA und PANI/PLA-PA 53,5 ± ± 9,09, 60,00 ± ± 9,47 bzw. 28,43 ± ± 8,34 MPa. In Bezug auf Zugfestigkeit (Abb. 2c) und Bruchzugverhältnis (Abb. 2d) nahmen die von PANI/PLA-HA und PANI/PLA-PA ab, während die von PANI/PLA-SA leicht zunahmen; die Zugfestigkeit und Bruchdehnung von PANI/PLA-PA waren am niedrigsten. Im Vergleich zu den PLA-Nanofasern nahm die Zugfestigkeit von PANI/PLA-HA und PANI/PLA-PA um 0,15 ± ± 0,01 bzw. 0,64 ± ± 0,03 MPa ab, während die von PANI/PLA-SA um 0,13 ± ± 0,05 MPa leicht zunahm. Die Bruchdehnung von PANI/PLA-HA und PANI/PLA-PA nahm um 16,93 ± 1,38% bzw. 35,42 ± 3,94 % ab, während die von PANI/PLA-SA um 3,32 ± 0,13 % zunahm.

Mechanische Eigenschaften von PLA-Nanofasern und PANI/PLA-Komposit-Nanofasern. a Repräsentative Zugspannungs-Dehnungs-Kurven, b Elastizitätsmodul, c Reißfestigkeit, d Bruchdehnung

Wie in Abb. 2 gezeigt, können die ausgewählten anorganischen Säuren durch die Verbindung der PANI-Beschichtung den Elastizitätsmodul von PLA-Nanofasern erhöhen. Die mechanischen Eigenschaften von PANI/PLA-HA und PANI/PLA-SA variierten hinsichtlich Zugfestigkeit und Bruchdehnung im Vergleich zu PLA-Nanofasern unterschiedlich stark, während die von PANI/PLA-PA am deutlichsten abnahmen und sobald Da die Belastung während des Tests aufgebracht wurde, trat ein Bruch in weniger als 5 s auf. Diese Ergebnisse können auf die Oxidation von HClO₄ . zurückzuführen sein , was zur Spaltung der Esterbindung in der PLA-Molekülkette und zur oxidativen Zersetzung der Carboxylgruppe führte, was in der Folge zu schlechteren mechanischen Eigenschaften führte [31]. Unterdessen können die unterschiedlichen mechanischen Eigenschaften von PANI/PLA-HA und PANI/PLA-SA mit der unterschiedlichen Dichte des mit HCl und H₂ . dotierten PANI zusammenhängen SO₄ , während die Einführung des APS in den Reaktionsprozess auch einen leichten Einfluss auf die PLA-Nanofasern gehabt haben kann, wobei die umfassende Wirkung dieser Faktoren unterschiedliche mechanische Eigenschaften aufweist [32].

Zelladhäsion, -proliferation und -differenzierung werden durch die Morphologie beeinflusst, wobei allgemein angenommen wird, dass eine raue Oberfläche der Zelladhäsion förderlich ist [33]. Die Hydrophobie von PLA-Nanofasern impliziert, dass die gleichmäßige Polymerisation von PANI eine Barriere darstellt, während die Oberflächenbehandlung von PLA-Nanofasern mit Plasma die Benetzbarkeit deutlich verbessern kann [34]. Nach der PANI-basierten In-situ-Polymerisation mit verschiedenen anorganischen Säure-Dotierstoffen wurden PANI/PLA-Komposit-Nanofasern mit einer gleichmäßigen Oberflächenabscheidung erhalten.

Die PANI-Morphologie auf der Oberfläche der verschiedenen PANI/PLA-Fasern wurde mittels FE-REM beobachtet (Abb. 3). Die Abbildung zeigt deutlich, dass die Oberfläche der PLA-Nanofasern von vielen unregelmäßigen Nanopartikeln bedeckt war und dass die mit anorganischen Säuren dotierten PANI/PLA-Komposit-Nanofasern eine gute Fasermorphologie und poröse Nanofaserstruktur beibehalten konnten. Die morphologischen Beobachtungen zeigten, dass die PANI/PLA-Komposit-Nanofasern erfolgreich mit PANI beladen wurden, das eine Grundlage für die Zelladhäsion und -proliferation lieferte. Währenddessen wurde AFM verwendet, um die Oberflächenrauheit der PANI/PLA-Verbundnanofasern zu messen, wie in Abb. 4 gezeigt. Ra, der Mittelwert der Oberflächenrauheit an drei verschiedenen Positionen jeder Probe, wird im Allgemeinen verwendet, um die Oberflächenrauheit der Probe zu bewerten. Darüber hinaus war der Ra der PANI/PLA-Verbundnanofasern größer als der der PLA-Nanofasern, und der Ra von PANI/PLA-PA war am höchsten. Diese Zunahme der Oberflächenrauheit beschleunigte die Oberfläche und Polarität, wodurch möglicherweise mehr Wachstumsstellen für Zellen geschaffen und die Zelladhäsion gefördert wurde.

Morphologie von a PLA-Nanofasern, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA und d PANI/PLA-PA-Komposit-Nanofasern

AFM-Bild und Oberflächenrauheit (Ra) von a PLA-Nanofasern, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA und d PANI/PLA-PA-Komposit-Nanofasern

Zelladhäsion, Migration und Proliferation werden maßgeblich durch die Benetzbarkeit der Gerüste beeinflusst [35, 36]. Im Allgemeinen wird die Benetzbarkeit anhand des Kontaktwinkels zwischen Gerüst und Wasser bewertet. Da PLA hydrophob ist, haben wir den Kontaktwinkel der Wassertröpfchen auf der Nanofasermembran innerhalb von 1 s gemessen, wie in Abb. 5 gezeigt, und es wurde festgestellt, dass die Kontaktwinkel der PANI/PLA-Nanofasern nach der Behandlung signifikant abnahmen. Die entsprechenden Kontaktwinkel von PLA, PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA und PANI/PLA-PA betrugen 112°, 61,6°, 36,7° bzw. 37,2°. Die PANI-Morphologie von PANI/PLA erhöhte die Oberflächenenergie des Systems, wobei die Kontaktfläche beim ersten Kontakt mit dem Wasser zunahm, was zu einer Verringerung des Kontaktwinkels und einer Verbesserung der Benetzbarkeit führte. Der Kontaktwinkel der Komposit-Nanofasern änderte sich nach 5 s Kontakt mit Wasser auf 0°, was eine gute Hydrophilie demonstriert. Dieses hydrophile Gerüst bot auch günstige Bedingungen für die Zelladhäsion und -diffusion [37], da die sauerstoffhaltigen funktionellen Gruppen (z. B. –OH und –COOH) auf der PLA-Oberfläche nach der Plasmabehandlung stärker an die Nanofaseroberfläche gebunden waren und die PANI Morphologie und sauerstoffhaltige funktionelle Gruppen arbeiteten zusammen, um sicherzustellen, dass die PANI/PLA-Komposit-Nanofasern letztendlich vollständig benetzt wurden [38, 39].

Kontaktwinkel von a PLA-Nanofasern, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA und d PANI/PLA-PA-Komposit-Nanofasern

Die FTIR-Spektren von reinen PANI- und PANI/PLA-Komposit-Nanofasern, die mit verschiedenen anorganischen Säuren dotiert sind, sind in Abb. 6 dargestellt. Im rein dotierten PANI-Spektrum (Abb. 6a) sind die starken charakteristischen Peaks bei 1.565, 1.485, 1.298 und 1.125 cm ⁻¹ entsprechen einer C=C-Streckung der chinoiden Ringe und einer C = C-Streckung, C–N-Streckung bzw.  = C–H-Streckung der benzenoiden Ringe. Im rein dotierten PANI-Spektrum (Abb. 6b) ist neben dem charakteristischen PANI-Peak auch ein PLA-Peak zu erkennen (C–O-Streckschwingungspeaks von 1092 und 1184 cm ⁻¹ , C=O-Streckschwingungspeak von 1757 cm ⁻¹ ). Diese Ergebnisse zeigen, dass PANI erfolgreich auf die Oberfläche der mit anorganischen Säuren dotierten PANI/PLA-Nanofasern geladen wurde. Um die chemische Zusammensetzung der PANI/PLA-Nanofasern weiter zu untersuchen, wurde XPS verwendet, um ihre Oberflächenzusammensetzung zu analysieren. Außerdem waren in den XPS-Spektren (Abb. 7a) klare N1s-Peaks bei  ~ 400 eV in PANI/PLA-Komposit-Nanofasern sichtbar. Darüber hinaus waren Cl2p-Peaks bei  ~ 200 eV in PANI/PLA-HA und PANI/PLA-PA sichtbar, während die Peakintensität von Cl2p bei PANI/PLA-PA höher war als bei PANI/PLA-HA. Ein Peak von S2p erschien bei  ~ 210 eV in den XPS-Spektren in PANI/PLA-SA. XPS-Spektren zeigten, dass Cl ⁻ , SO₄ ²⁻ , und ClO₄ ⁻ wurden auf die entsprechenden PANI/PLA-Nanofasern dotiert. Darüber hinaus wurden die Imin-Stickstoffatome von PANI vollständig oder teilweise oxidiert, um eine Reihe von Oxidationsstufen zu erzeugen, die von unterschiedlichen Protonierungsgraden begleitet wurden. Die Änderungen der Oxidationsstufe und des Protonierungsniveaus von PANI wurden in Form von N1s-Kernniveauspektren gemessen (Abb. 7b–d). Jedes N1s-Spektrum kann in vier Hauptkomponenten mit Bindungsenergien von ungefähr 398,7, 399,6, 400,4 und 401,8 eV entfaltet werden, die dem chinonoiden Imin (–N=), Benzenoid-Amin (–NH–), protoniertem Amin (– N ⁺ ) und protoniertes Imin (=N ⁺ ) bzw. [40, 41]. In Bezug auf Kumars Studie [42] wurde angenommen, dass der passende Peak des N1s-Spektrums durch die Ladung der Anionen beeinflusst wird, die von den protonierten N-Atomen gebunden sind, was zu einer Delokalisierung und einer leichten Verschiebung führte.

FTIR-Spektren von a PANI, b PLA- und PANI/PLA-Komposit-Nanofasern

XPS-Spektren (a ) von vorbereiteten Nanofasergerüsten aus PANI/PLA-Komposit und dem PANI/PLA-HA (b ), PANI/PLA-SA (c ) und PANI/PLA-PA (d ) des Kernpegelsignals von N1s

Als Vorlage für die Gewebereparatur und -regeneration werden bioaktive Gerüste nach induzierter Zell- und Gewebereparatur abgebaut und aus dem Körper ausgeschieden [43]. In dieser Veröffentlichung wurden die Abbaueigenschaften der Nanofasergerüste mit einer Massenverlustmethode bewertet, wie in Abb. 8 gezeigt. Der Massenverlust aller Proben nahm nach 7, 14 und 21 Tagen zu und die Massenverlustraten des PLA Nanofasern betrugen 4,34 ± 0,41 %, 7,84 ± 1,57 % bzw. 12,65 ± 0,83 %. In der Zwischenzeit nahm der Massenverlust der PANI/PLA-PA-Komposit-Nanofasern nach der oxidativen In-situ-Polymerisation allmählich zu, mit Massenverlustraten von 31 ± 2,15 %, 34 ± 1,86 % und 40 ± ± 2,54 % bei 7, 14 und 21 Tage, die signifikant höher waren als die der PANI/PLA-HA- und PANI/PLA-SA-Nanofasern. Im PANI-Prozess der oxidativen In-situ-Polymerisation könnte die Anwesenheit des Oxidationsmittels APS die Esterbindung in PLA zerstört und eine Hydrolysereaktion induziert haben, die zu Mikrorissen in den PLA-Nanofasern führte. Mit der Verlängerung der PBS-Eintauchzeit häuften sich die Mikrorisse allmählich an und die PLA-Matrix begann sich allmählich abzubauen. Das oberflächenbeladene PANI fiel ebenfalls ab, was zu einer Verlustrate an Nanofaserqualität führte. Mit zunehmender Zeit wurde das Massenverlustverhältnis deutlicher. Hier die starke Oxidation von HClO₄ verschlimmerten den Abbau von PLA und beschleunigten den Massenverlust der PANI/PLA-PA-Nanofasern, was mit den in Abb. 2 dargestellten mechanischen Eigenschaften übereinstimmt.

Abbaueigenschaften von PLA- und PANI/PLA-Nanofasern

Die Biokompatibilität bioaktiver Gerüste ist die Grundlage für die Förderung von Zelladhäsion, -wachstum und -proliferation [44]. Hier haben wir die Zellproliferation von HOS auf PLA- und PANI/PLA-Komposit-Nanofasern untersucht, um die damit verbundene Adhäsion und Biokompatibilität zu veranschaulichen. Bei der chemischen Behandlung und Funktionalisierung [45] könnten bei der Herstellung bioaktiver Gerüste eine Reihe potenzieller Einflussfaktoren ins Spiel kommen. Daher ist die Untersuchung ihrer Biokompatibilität der Schlüssel zur Bewertung ihrer praktischen Anwendung.

Um die Biokompatibilität von PANI/PLA-Komposit-Nanofasern zu untersuchen, wurde deren Zelllebensfähigkeit mit einer MTT-Methode bewertet. Abbildung 9 zeigt die Zellaktivität, die auf PLA- und PANI/PLA-Komposit-Nanofasern nach 1, 3 und 5 Tagen inkubiert wurde. Die Abbildung zeigt deutlich, dass mit der Verlängerung der Inkubationszeit die Zellaktivität der Nanofasern allmählich zunahm; die PANI/PLA-PA-Zellen zeigten die beste Aktivität und die Zellaktivität nach einer fünftägigen Kultur war die höchste.

Zellviabilität HOS, kultiviert für 1, 3 und 5 Tage auf PLA-Nanofasern und PANI/PLA-Komposit-Nanofasern (*p <0,05; **p <0,005)

PLA ist biologisch abbaubar, aber hydrophob, was bedeutet, dass es der Zelladhäsion, dem Wachstum und der Proliferation nicht förderlich ist. Nach der Plasmabehandlung war die Oberfläche der PANI/PLA-Komposit-Nanofasern mit sauerstoffhaltigen Gruppen beladen und die funktionelle Oberfläche zeigte eine gute Hydrophilie. Die obigen Morphologie- und AFM-Ergebnisse zeigen, dass das mit verschiedenen anorganischen Säuren dotierte PANI unterschiedliche Morphologien und Rauhigkeitsniveaus auf der Oberfläche der PLA-Nanofasern aufwies. Unterdessen zeigten die PANI/PLA-Verbundnanofasern eine ausgezeichnete Benetzbarkeit. Daher waren wir der Ansicht, dass die unterschiedlichen Morphologien von mit anorganischen Säuren dotiertem PANI zu einer Verbesserung der Oberflächenenergie und Polarität der PANI/PLA-Komposit-Nanofasern führten, was folglich das Zellwachstum, die Migration und die Proliferation beeinflusste, was zu einer verbesserten Leistung in Bezug auf der Zellaktivität [46].

Um das Zellverhalten der PANI/PLA-Komposit-Nanofasern weiter zu untersuchen, wurden das Wachstum und die Adhäsion auf den Nanofasern mittels Fluoreszenz-Immunfärbung (Abb. 10) und SEM (Abb. 11) beobachtet. Hier haben wir die Aktin- und Zellmorphologie auf der Oberfläche verschiedener Nanofasern verglichen. Wenn die Zellen auf den PLA-Fasern und PANI/PLA-Nanofasern wuchsen, zeigten die Aktinbündel einen guten Dehnungszustand. Unterdessen war die Zelldichte der PANI/PLA-Komposit-Nanofasern höher als die der PLA-Nanofasern der Kontrollgruppe, wobei die Zellwachstumsdichte der Reihenfolge PANI/PLA-PA > PANI/PLA-SA > PANI/PLA-HA folgte. Die HOS-Zellen wuchsen auf den PANI/PLA-Nanofasern und hafteten in einer flachen multipolaren Form. Offensichtlich waren viele Zellen in die Poren der PANI/PLA-Fasern eingebettet, aber auf den PLA-Nanofasern schlecht gedehnt und konnten nicht vollständig expandiert werden. These results indicate that PANI/PLA composite nanofibers could promote the adhesion and proliferation of HOS cells.

Fluorescence micrographic images on a PLA nanofibers, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, and d PANI/PLA-PA composite nanofibers after the incubation of 24 h

SEM micrographs of HOS seeded on a PLA nanofibers, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, and d PANI/PLA-PA composite nanofibers after 24 h

Meanwhile, the cell immunofluorescence staining and cell adhesion results indicated that the different PANI morphologies on the surface of the PANI/PLA composite nanofibers affected the growth, adhesion, and proliferation of the HOS cells, which was consistent with the above results.

As an early osteogenic marker, the ALP test was conducted on PLA and PANI/PLA composite nanofibers scaffolds for 7 days. Compared to the pure PLA nanofibers, the result (Fig. 12) showed that the ALP activity was significantly improved in of PANI/PLA composite nanofibers. Obviously, the ALP activity of PANI/PLA-PA composite nanofibers is the best. These results proved that PANI/PLA composite nanofibers exhibited better biocompatible, which is consistent with the above results of cell adhesion, growth, and proliferation.

Alkaline phosphatase activity on PANI/PLA composite nanofibers scaffolds (ns = no significance)

Schlussfolgerungen

In this paper, PANI/PLA composite nanofibers of different surface morphologies were prepared by three types of inorganic acid as dopant in in situ polymerization. We confirmed that PANI could be successfully loaded on the surface of PLA without changing the porous structure of the nanofibers. The mechanical properties and in vitro degradation experiments demonstrated that oxidizing acids can significantly weaken the mechanical properties and accelerate the degradation of polyester nanofibers. Meanwhile, the rougher surface resulted in a better wettability and promoted the cells adhesion, growth, and proliferation, which indicated a better biocompatibility. In conclusion, the regulated PANI morphology via different acids doping has positive effect on biocompatibility in tissue engineering.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

The authors declare that the materials and data are promptly available to readers without undue qualifications for material transfer agreements. Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem Artikel enthalten.

Abkürzungen

PANI:

Polyanilin

PLA:

Polylactic acid

ECM:

Extracellular matrix

PPy:

Polypyrrol

PTH:

Polythiophene

AN:

Aniline

DCM:

Dichlormethan

DMF:

N ,N -Dimethylformamide

APS:

Ammoniumpersulfat

HOS:

Human osteosarcoma cells

DMEM:

Dulbeccos modifizierte Eagle medium

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

MTT:

3–2,5-Diphenyl-2-H-tetrazolium bromide

FITC:

Fluoresceinisothiocyanat

FTIR:

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie

FE-REM:

Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie

XPS:

Röntgenphotoelektronenspektroskopie

ALP:

Alkaline phosphatase