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Wiederhergestellte microRNA-326-5p hemmt neuronale Apoptose und mildert mitochondriale Schäden durch Unterdrückung von STAT3 bei zerebraler Ischämie/Reperfusionsverletzung

Zusammenfassung

Studien haben die Rolle von microRNAs (miRNAs) bei zerebraler Ischämie/Reperfusionsverletzung (CI/RI) umfassend untersucht. Der spezifische Mechanismus von miR-326-5p bei CI/RI ist jedoch noch unklar. Daher sollte diese Studie den Mechanismus von miR-326-5p/Signaltransducer und Aktivator der Transkription-3 (STAT3)-Achse in CI/RI entlarven. Zwei Modelle (Sauerstoff- und Glukoseentzug [OGD] in primären kortikalen Neuronen der Ratte und Okklusion der mittleren Hirnarterie [MCAO] in Sprague-Dawley-Ratten) wurden entwickelt, um CI/RI in vitro bzw. in vivo nachzuahmen. Funktionsverlust- und Funktionsgewinn-Assays wurden mit OGD-behandelten Neuronen und mit MCAO-Ratten durchgeführt. Anschließend wurden Lebensfähigkeit, Apoptose, oxidativer Stress und mitochondriales Membranpotential in OGD-behandelten Neuronen sowie pathologische Veränderungen, Apoptose und mitochondriales Membranpotential in Hirngeweben von MCAO-Ratten getestet. Mitofusin-2 (Mfn2), miR-326-5p und STAT3-Expression in OGD-behandelten Neuronen und im Hirngewebe von MCAO-Ratten wurden nachgewiesen. Mfn2 und miR-326-5p waren reduziert und STAT3 war in OGD-behandelten Neuronen und Hirngeweben von MCAO-Ratten erhöht. miR-326-5p gezielte und negativ regulierte STAT3-Expression. Die Wiederherstellung von miR-326-5p oder die Reduzierung von STAT3 verstärkte die Lebensfähigkeit, hemmte Apoptose und oxidativen Stress, erhöhtes mitochondriales Membranpotential und erhöhte Mfn2-Expression in OGD-behandelten Neuronen. Das Hochregulieren von miR-326-5p oder Herunterregulieren von STAT3 linderte pathologische Veränderungen, hemmte die Apoptose und erhöhte das mitochondriale Membranpotential und die Mfn2-Expression in Hirngeweben von Ratten mit MCAO. Diese Studie zeigt, dass hochreguliertes miR-326-5p oder herunterreguliertes STAT3 vor CI/RI schützt, indem es die Mfn2-Expression erhöht.

Einführung

Die zerebrale Ischämie/Reperfusionsverletzung (CI/RI) ist eine Art von Hirnschädigung, gefolgt von einem ischämischen Schlaganfall [1]. Das charakteristischste Merkmal der zerebralen I/R ist die initiale vorübergehende zerebrale Ischämie nach Reperfusion [2]. CI/RI aktiviert die neuronale Apoptose und führt zu Schäden im Hippocampus und der Kortikalis [3]. Die derzeit häufigste klinische Anwendung ist die Thrombolyse bei CI/RI [4]. Eine Reperfusion würde jedoch die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) erhöhen, was zu intrazellulären DNA-Schäden, Schäden im Zusammenhang mit oxidativem Stress, Proteinoxidation und Lipidperoxidation führen würde, wodurch die Blut-Hirn-Schranke und Ödeme weiter verschlechtert würden [5]. Daher hat die Dringlichkeit, nach neuen gezielten Optionen zu suchen, für CI/RI oberste Priorität.

MicroRNAs (miRNAs) werden umfassend als potenzielle und prognostische Rollen bei CI/RI betrachtet [6, 7]. Ein Artikel hat beispielsweise gezeigt, dass miR-202-5p neuronale Schäden und neurologische Defizite sowie durch Sauerstoff- und Glukosemangel (OGD) induzierte Zellschäden bei Modellratten mit mittlerem Hirnarterienverschluss (MCAO) bei ischämischer Verletzung abschwächt [8] . Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Hochregulierung von miR-98 die neurologischen Ergebnisse bei Mäusen mit I/R-Schlaganfall verbessert [9] und die Überexpression von miR-451 die ischämische zerebrale Apoptose bei Mäusen mit CI/RI lindert [10]. Insbesondere hat miR-326-5p eine pro-angiogene Fähigkeit für endotheliale Vorläuferzellen und könnte die Herzfunktion nach einem akuten Myokardinfarkt verbessern [11]. Allerdings steckt die Studie mit miR-326-5p bei CI/RI noch in den Kinderschuhen. Signalwandler und Transkriptionsaktivator (STAT) sind eine einzigartige Familie von Proteinen, die durch CI/RI aktiviert werden [12]. STAT3 wurde auf der Bioinformatik-Website als Ziel von miR-326-5p vorhergesagt; Daher untersuchten wir die Rolle von miR-326-5p-vermitteltem STAT3 bei CI/RI. STAT3 verschlechtert ischämische neuroinflammatorische Prozesse und sekundäre Hirnschädigungen durch die Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren [13, 14]. Insbesondere spielt der Janus-aktivierte Kinase 2(JAK2)/STAT3-Weg eine funktionelle Rolle bei der Blockierung der durch CI/RI induzierten Zellapoptose [15]. Mitofusin-2 (Mfn2) ist ein mitochondrialer Fusionsfaktor, der vor kardiozerebrovaskulären I/RI schützen könnte [16] und Hypoxie-induzierte neuronale Apoptose bei ischämischen Hirnschäden lindern könnte [17]. Es wurde auch aufgezeichnet, dass Mfn2 eine schützende Wirkung auf CI/RI ausübt [18].

Kurz gesagt, eine weniger eingehende Untersuchung hat die kombinierte Rolle von miR-326-5p und STAT3 bei CI/RI entdeckt. Vor diesem Hintergrund wird diese Studie mit der Hypothese gestartet, dass miR-326-5p CI/RI durch Targeting auf STAT3 abschwächt.

Materialien und Methoden

Ethikerklärung

Die Experimente wurden vom Animal Care and Use Committee des angeschlossenen Krankenhauses der Yangzhou University genehmigt; Yangzhou University, und es wurde mit dem Guide to the Care and Use of Experimental Rats of Affiliated Hospital of Yangzhou University durchgeführt; Universität Yangzhou.

Versuchstiere

Männliche erwachsene Sprague-Dawley-Ratten (6–8 Wochen alt, 250 ± 30 g) vom Center of Comparative Medicine der Yangzhou University (Yangzhou, China) wurden in einer spezifischen pathogenfreien Umgebung mit freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten. (24 ± 1)°C, (50 ± 5)% Luftfeuchtigkeit und 12h Hell-/Dunkelzyklus.

Zellisolierung und -identifizierung

Die Ratten wurden durch Enthauptung euthanasiert und ihre Gehirne wurden in 1 mm 3 . geschnitten Zellsuspensionen zu konfigurieren, die mit 0,4% Trypanblau-Lösung bei 9:1 gemischt wurden (die Endkonzentration von Trypanblau betrug 0,04%) und die Zelldichte und Überlebensrate wurden mit einem Hämozytometer berechnet. Die Zellen (1 × 10 6 Zellen/ml) wurden in eine mit L-Polylysin (0,1 mg/ml) vorbeschichtete Zellkulturflasche bei 5 × 10 6 . ausgesät Zellen pro Flasche. Wenn die Zellen an den Wänden hafteten, wurden sie mit dem erneuerten Medium (NeurobasalA + B27 + L-Glutamin) inkubiert und kontinuierlich für 6–7 Tage kultiviert, wobei das Medium alle 2–3 Tage zur Hälfte gewechselt wurde.

Zellidentifikation:Kortikale Neuronen von Ratten wurden verwendet, um Neuronen-Objektträger herzustellen, die mit dem primären polyklonalen Kaninchen-Anti-Ratten-Nestin (NES)-Antikörper (1:200) sowie dem mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) markierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Immunglobulin inkubiert wurden G (1:50, beide von Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). Danach wurden die Zellen mit einem Anti-Fluoreszenz-Quencher versiegelt und durch ein Fluoreszenzmikroskop beobachtet.

OGD-Modelleinrichtung

Neuronen wurden in einer glukosefreien Earle-Lösung kultiviert und einem Mischgas von 95 % N2 . ausgesetzt und 5 % CO2 . Nach 30 min Überdruckbeatmung bildete sich eine hypoxische Umgebung, in der die Zellen inkubiert wurden (Ischämiesimulation durch OGD in vitro). Nach 90-minütiger Inkubation wurden die Zellen mit dem Erhaltungszellmedium inkubiert, nachdem die glukosefreie Earle-Lösung entfernt wurde. Die Zellen wurden routinemäßig für nachfolgende Experimente kultiviert (Reperfusionssimulation durch Sauerstoff-Glukose-Reperfusion in vitro). Als Kontrolle diente das Normalmedium unter Normoxie.

Neuronen wurden in die Kontrollgruppe eingeteilt; die OGD-Gruppe, die Negativkontrollgruppe (NC) (OGD-behandelte Neuronen transfiziert mit verschlüsselten Oligonukleotiden), die miR-326-5p-Agomir-Gruppe (OGD-behandelte Neuronen transfiziert mit miR-326-5p-Agomir), die sh-STAT3-Gruppe (OGD-behandelte Neuronen, transfiziert mit STAT3-shRNA) und die miR-326-5p-Agomir + Überexpression (oe)-STAT3-Gruppe (OGD-behandelte Neuronen, transfiziert mit miR-326-5p-Agomir und pcDNA-STAT3-Vektor). Oligonukleotide und Vektoren wurden alle von GenePharma (Shanghai, China) bereitgestellt.

Unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific) wurden verschlüsselte Oligonukleotide, miR-326-5p-Agomir, STAT3-shRNA oder miR-326-5p-Agomir und pcDNA-STAT3 in primäre Rattenneuronen transfiziert und die Transfektionswirksamkeit durch reverse Transkription quantitativ getestet Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) oder Western Blot nach 48 h.

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay

Neuronen wurden zu einer Suspension von 1 × 10 6 . gebracht Zellen/ml und kultiviert für 0, 24 bzw. 48 h. In einer sterilen Umgebung wurden die Neuronen 2–4 h in 10 % MTT-Lösung inkubiert und mit 150 μL gelöster Formanzan-Lösung (Dimethylsulfoxid) versetzt, bis die Kristalle ausreichend gelöst waren. Der Wert der optischen Dichte (OD) wurde auf einem Mikroplatten-Lesegerät bei 570 nm gemessen.

Durchflusszytometrie-Apoptose-Assay

Neuronen wurden mit 0,25% Trypsin abgelöst, bei 2000 U/min zentrifugiert und in PBS resuspendiert. Dann wurden die Neuronen bei 2000 U/min zentrifugiert, und das Pellet wurde durch Bindungspuffer resuspendiert und nacheinander mit 5 µl Annexin V-FITC und 5 µl Propidiumiodid (PI) inkubiert. Ein Durchflusszytometer wurde verwendet, um die Apoptoserate zu erkennen.

JC-1 mitochondriale Membranpotentialerkennung

Zellen in der 6-Well-Platte wurden mit PBS gespült, mit 1 ml Zellkulturmedium und 1 ml JC-1-Färbelösung (50 μl JC-1, 8 ml Reinstwasser und 2 ml JC-1-Färbepuffer) versetzt (SolarbioScience , Peking, China) und 15 min inkubiert. Der 1  × JC-1-Färbepuffer wurde aus 4 ml destilliertem Wasser und 1 ml JC-1-Färbepuffer konfiguriert. Nach der Inkubation wurden die Zellen trypsiniert, in JC-1-Puffer resuspendiert und auf einem Durchflusszytometer getestet. Der relative Anteil der grünen Fluoreszenz wurde berechnet.

Erkennung von oxidativem Stress

Die intrazellulären ROS-Spiegel wurden mit dem 2,7-Dichlorfluoresceindiacetat (DCF-DA) Detection Kit (Abcam) gemessen. Kurz gesagt wurden Neuronen mit 0,25% Trypsin abgelöst, resuspendiert und mit 10 µm DCF-DA für 30 min inkubiert. Danach wurde die DCF-Fluoreszenz mit Anregungs-/Emissionslicht bei 495 nm/529 nm durch Fluoreszenzspektroskopie (BD Biosciences) gemessen.

Der Nachweis von intrazellulärem Malondialchehyche (MDA), Glutathion (GSH)-Gehalt und Superoxiddismutase (SOD)-Aktivität wurde durch chemische Kolorimetrie unter Verwendung kommerzieller Assay-Kits (Beyotime Biotechnology Co., Shanghai, China) nachgewiesen. Der OD-Wert wurde mit einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen.

Rattenmodelleinrichtung

Ratten wurden durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natrium (50 μg/kg) anästhesiert. Am Hals wurde ein Mittellinienschnitt vorgenommen, die äußere Halsschlagader wurde ligiert und die gemeinsame Halsschlagader wurde mit einem Arterienclip verschlossen. Ein 3–0 silikonbeschichtetes Monofilament-Nylon-Nahtmaterial wurde vorsichtig in die A. carotis interna bis zum leichten Widerstand eingeführt. Nach 90 min vorübergehender zerebraler Ischämie wurde die Naht entfernt und eine Reperfusion für weitere 24 h durchgeführt. Die Scheingruppe erhielt die gleiche Behandlung, außer dass die Naht nicht in die A. carotis interna eindrang. Während der Operation wurde ein thermostatisches Bett verwendet, um die rektale Temperatur bei 37 ± 0,5 °C zu halten [19].

Die Ratten wurden in 6 Gruppen eingeteilt (n = 6) und vor der Etablierung von MCAO-Modellen, einschließlich der Scheingruppe, der MCAO-Gruppe (modellierte Ratten), der NC-Gruppe (modellierte Ratten mit seitlicher cerebroventrikulärer Injektion) mit Plasmid oder miR in die laterale zerebroventrikuläre Injektion injiziert von 5 µl verwürfelten Oligonukleotiden [100 µM]), die miR-326-5p-Agomir-Gruppe (modellierte Ratten mit lateraler zerebroventrikulärer Injektion von 5 µl miR-326-5p-Agomir [100 µM]), die sh-STAT3-Gruppe (modellierte Ratten mit laterale zerebroventrikuläre Injektion von 5 µL STAT3-Interferenzvektor [100 µM]) und die miR-326-5p-Agomir + oe-STAT3-Gruppe (modellierte Ratten mit lateraler zerebroventrikulärer Injektion von 5 µL miR-326-5p-Agomir [100 µM] und 5 µL STAT3-Überexpressionsvektor [100 μM]) [20, 21].

Probensammlung

Ratten wurden durch Anästhesie euthanasiert, die Herzen wurden perfundiert und das gesamte Gehirn wurde entnommen. Das hirnverletzte Gewebe wurde in 1 × 1 × 1 mm 3 . geschnitten Gewebemassen für die Paraffinschnittpräparation, RT-qPCR, Western-Blot-Analyse und den Nachweis des mitochondrialen Membranpotentials.

Nachweis des mitochondrialen Membranpotentials in der Großhirnrinde

Die Großhirnrinde von SD-Ratten wurde abgetrennt und in 1 mm 3 . geschnitten . Die Gewebeblöcke wurden auf ein 300 mesh-Nylonnetz gelegt und mit PBS versetzt. Dann wurde die Zellsuspension bei 1000 U/min zentrifugiert, mit 70 % Ethanol versetzt und erneut bei 1000 U/min zentrifugiert. Danach wurde die Probe in 1 ml PBS resuspendiert und die Suspension (1 × 10 6 Zellen, 100 μl) wurde mit Rhodamin123 Farbstofflösung (10 μl, 5 μg/ml) umgesetzt und auf einem Durchflusszytometer bei 488 nm analysiert.

HE-Färbung

Das Hirngewebe der Ratte wurde 24 h in 4% Paraformaldehyd getaucht, und Paraffinschnitte wurden hergestellt, in 4 µm geschnitten, in 40 °C Wasser ausgebreitet und bei 60 °C gebacken. Die Paraffinschnitte wurden routinemäßig entwachst und hydratisiert und mit HE-Färbelösung gefärbt. Nach der HE-Färbung zeigten die geschädigten Neuronen eine Kontraktion des Kerns, ein zelluläres Ödem, eine Vakuolisierung und dunkle Kerne. Das Lichtmikroskop (Nikon, Japan) wurde verwendet, um das Bild zu erhalten, und die Anzahl der überlebenden Neuronen (mm 2 ) des ischämischen Kortex wurde gezählt.

TUNEL-Färbung

Die Paraffinschnitte wurden entparaffiniert und mit 100 %, 95 %, 80 % und 70 % Alkohol entwässert. Dann wurden die Schnitte in 4% Paraformaldehyd eingetaucht, gefolgt von einer Inkubation mit 0,1% Triton X-100 Natriumcitratpuffer für 20 Minuten und TUNEL-Reaktionsmischung für 1–1,5 Stunden. Als nächstes wurden die Schnitte mit Peroxidaselösung und Diaminobenzidin (DAB) entwickelt, mit Hämatoxylin gegengefärbt, mit Gradientenalkohol dehydratisiert, permeabilisiert und in neutralem Gummi versiegelt. Die Schnitte wurden unter einem Lichtmikroskop betrachtet, um TUNEL-positive Zellen zu zählen. Bräunlich-gelbe Partikel im Zellkern wurden als TUNEL-positive Zellen (apoptotische Zellen) definiert.

Immunhistochemie

Die Schnitte wurden entwachst, hydratisiert und durch Citrat-Antigen wiedergewonnen, und die endogene Katalase wurde durch 3% H2 . blockiert O2 . Jeder Schnitt wurde mit Ziegenserum (50 μl) versetzt, mit dem primären Antikörper (50 μl) inkubiert und mit dem sekundären Antikörper (50 μl) und Meerrettich-Peroxidase-markiertem Streptavidin (50 μl) umgesetzt. Die Schnitte wurden mit DAB entwickelt und mit Hämatoxylin gegengefärbt, gefolgt von einer graduellen Alkoholdehydratisierung, Xylolpermeabilisierung und neutraler Gummiversiegelung. Die Schnitte wurden mit einem Mikroskop beobachtet (Zytoplasma oder Kern von ischämischen Hirngeweben waren gelbe oder bräunlich-gelbe Partikel). OD-Werte wurden gemessen und gemittelt.

RT-qPCR

Die Extraktion der gesamten RNA aus Geweben und Zellen wurde von Trizol (Invitrogen) durchgeführt. Die mRNA-Expression wurde durch qPCR unter Verwendung des SYBR Green PCR Mix (Applied Biosystems, CA, USA) und des QuantStudio TM 6Flex Echtzeit-PCR-Systems (Applied Biosystems) analysiert. Spezifische Stamm-Loop-Reverse-Transkriptions-Primer und Vorwärts-/Rückwärts-Primer (BioTNT, Shanghai, China) wurden entwickelt, um miRNA-Spiegel zu analysieren. Tabelle 1 listete alle Primer auf. Die 2 −△△CT Methode zur Berechnung der miRNA- oder mRNA-Spiegel übernommen.

Western Blot-Analyse

Die Proteinproben wurden durch 10 % Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran elektrogeblottet. Danach wurde die PVDF-Membran mit 5% Magermilchpulver in Tris-haltiger Kochsalzlösung blockiert, mit den primären Antikörpern sondiert und mit dem sekundären Antikörper für 2 h erneut sondiert. Dann wurden die Proteinbanden mit alkalischem Phosphatase-Puffer, der Nitroblue-Tetrazoliumchlorid und 5-Brom-4-Chloro-3-Indolylphosphat enthielt, analysiert und durch ImageJ-Software (NIH, Bethesda, MD, USA) quantifiziert. Die Hauptantikörper waren STAT3 (1:1000), Mfn2 (1:1000, Abcam, MA, USA) und Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA).

Dualer Luciferase-Reporter-Gen-Assay

Der STAT3 3′UTR, der miR-326-5p Wildtyp (WT) oder mutante (Mut) Bindungsstellen enthält, wurde in den pmirGLO-Vektor (Promega, WI, USA) kloniert, der als STAT3-WT und STAT3-Mut bezeichnet wird. Die Zellen wurden in einer 24-Well-Platte bei 2 × 10 4 . ausgesät Zellen/Vertiefung und co-transfiziert mit 100 ng STAT3-WT- oder STAT3-Mut-Luciferase-Vektor und 50 nM miR-326-5p-Agomir oder it-Agomir NC bei 70 % Konfluenz. Die Luciferase-Aktivität wurde unter Verwendung des Dual-Luciferase Reporter Assay Systems (Promega Corporation, WI, USA) gemessen.

Statistische Analyse

Zur Datenanalyse wurde die Statistiksoftware SPSS 21.0 (IBM, NY, USA) verwendet. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt. Der Unterschied zwischen zwei Gruppen wurde durch Student's t-Test analysiert, während Mehrfachvergleiche durch Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) analysiert wurden, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test. P repräsentierten zweiseitigen Test und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant erachtet.

Ergebnisse

Hochregulierung von miR-326-5p oder Herunterregulierung von STAT3 schwächt die Apoptose von OGD-behandelten kortikalen Neuronen ab

Eine Woche lang kultiviert, wurden die kortikalen Neuronen der Ratte differenziert und gereift. Mikroskopisch zeigten die Neuronen größere Neuronenkörper, transparenteres Zytoplasma, einen großen Kern mit geringer Dichte und einen starken Brechungsindex. Die Neuronenkörper waren konisch oder rund, und die Dendriten waren gestaffelt und hafteten an den Wänden (Abb. 1a, b). NES war ein spezifischer chemischer Marker für zerebrale Neuronen, um Neuronen mit hoher Spezifität durch Immunfluoreszenzassays zu lokalisieren. Es wurde festgestellt, dass Neuronen spezifisch an NES binden und grüne Fluoreszenz zeigten (Abb. 1c).

Die Hochregulierung von miR-326-5p oder die Herunterregulierung von STAT3 schwächt die Apoptose von OGD-behandelten kortikalen Neuronen ab. a Zerebrale Neuronen mit 2-d adhärenter Kultur (Skalenbalken:100 µm); b Zerebrale Neuronen mit 7-d adhärenter Kultur (Skalenbalken:100 µm); c Cerebrale Neuronen mit 7-d adhärenter Kultur, gefärbt durch NES-Immunfluoreszenz-Assay (Maßstab:50 µm); d Lebensfähigkeit von OGD-behandelten kortikalen Neuronen durch MTT-Assay; e Apoptose von OGD-behandelten kortikalen Neuronen, nachgewiesen durch Durchflusszytometrie; f Apoptoserate von OGD-behandelten kortikalen Neuronen; g Bcl-2- und Bax-mRNA-Expression in OGD-behandelten kortikalen Neuronen; *P <  0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe; #P < 0,05 im Vergleich zur NC-Gruppe; &P < 0,05 im Vergleich zur miR-326-5p-Agomir-Gruppe

Der MTT-Assay wurde angewendet, um die Lebensfähigkeit von kortikalen Neuronen nachzuweisen ( 1d ). Die Ergebnisse zeigten, dass die Lebensfähigkeit der kortikalen Neuronen der Ratte in der OGD-Gruppe und der miR-326-5p-Agomir + oe-STAT3-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe und der miR-326-5p-Agomir-Gruppe beeinträchtigt war, aber in der miR-326-5p .-Gruppe verbessert war agomir-Gruppe und sh-STAT3-Gruppe gegen die NC-Gruppe (alle P < 0.05).

Die Apoptose der kortikalen Neuronen der Ratte wurde durch Durchflusszytometrie bestimmt, während die Bcl-2- und Bax-mRNA-Expression durch RT-qPCR bestimmt wurde (Abb. 1e–g). Die Ergebnisse erklärten, dass im Vergleich mit der Kontrollgruppe und der miR-326-5p-Agomir-Gruppe die OGD-Gruppe und die miR-326-5p-Agomir + oe-STAT3-Gruppe eine erhöhte Apoptoserate, eine reduzierte Bcl-2-Expression und eine erhöhte Bax-Expression . zeigten (alle P < 0,05). Bei den NC-Gruppen hingegen war die Apoptoserate gesenkt, der Bcl-2-Spiegel erhöht und der Bax-Spiegel in der miR-326-5p-Agomir-Gruppe und der sh-STAT3-Gruppe (alle P < 0.05).

Hochregulierung von miR-326-5p oder Herunterregulierung von STAT3 erhöht Mfn2- und Mitochondrienmembran-Potenzialniveau in kortikalen Neuronen nach OGD-Verletzung

Die Mfn2-Expression in OGD-behandelten kortikalen Neuronen wurde durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen ( 2a , b). In Bezug auf die Kontrollgruppe und die miR-326-5p-Agomir-Gruppe verringerte sich die Mfn2-Proteinexpression in der OGD-Gruppe und der miR-326-5p-Agomir + oe-STAT3-Gruppe, während sie in der miR-326-5p-Agomir-Gruppe und sh . erhöht war -STAT3-Gruppe gegen die NC-Gruppe (alle P < 0.05).

Eine Hochregulierung von miR-326-5p oder eine Herunterregulierung von STAT3 erhöht das Mfn2- und das mitochondriale Membranpotenzialniveau in OGD-behandelten kortikalen Neuronen. a , b Mfn2-Proteinexpression in OGD-behandelten kortikalen Neuronen; c JC-1-Durchflusszytometrie des mitochondrialen Membranpotentialniveaus in OGD-behandelten kortikalen Neuronen; d ROS-Gehalt in OGD-behandelten kortikalen Neuronen nach Hochregulierung von miR-326-5p oder Herunterregulierung von STAT3; e GSH-Aktivität in OGD-behandelten kortikalen Neuronen nach Hochregulierung von miR-326-5p oder Herunterregulierung von STAT3; f MDA-Gehalt in OGD-behandelten kortikalen Neuronen nach Hochregulierung von miR-326-5p oder Herunterregulierung von STAT3; g SOD-Aktivität in Neuronen nach Hochregulierung von miR-326-5p oder Herunterregulierung von STAT3; *P <  0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe; #P < 0,05 im Vergleich zur NC-Gruppe; &P < 0,05 im Vergleich zur miR-326-5p-Agomir-Gruppe

Mit JC-1 nachgewiesenes mitochondriales Membranpotential (Abb. 2c, d) in Bezug auf die Kontrollgruppe und die miR-326-5p-Agomir-Gruppe, das mitochondriale Membranpotential-Niveau in der OGD-Gruppe und der miR-326-5p-Agomir-Gruppe abnahm + oe-STAT3 Gruppe (alle P < 0,05). Im Vergleich zu den NC-Gruppen erhöhte sich das mitochondriale Membranpotential in der miR-326-5p-Agomir-Gruppe und in der sh-STAT3-Gruppe (alle P < 0.05).

ROS- und MDA-Gehalte sowie GSH- und SOD-Aktivitäten in OGD-behandelten kortikalen Neuronen wurden bestimmt und die Ergebnisse zeigten, dass gegenüber der Kontrollgruppe und der miR-326-5p-Agomir-Gruppe die OGD-Gruppe und die miR-326-5p-Agomir + oe -STAT3-Gruppe zeigte erhöhte ROS- und MDA-Gehalte und beeinträchtigte GSH- und SOD-Aktivitäten (alle P < 0,05). Im Vergleich zu den NC-Gruppen zeigten die miR-326-5p-Agomir-Gruppe und die sh-STAT3-Gruppe reduzierte ROS- und MDA-Gehalte und verstärkte GSH- und SOD-Aktivitäten (alle P < 0,05) (Abb. 2e–g).

Hochregulierung von miR-326-5p oder Herunterregulierung von STAT3 verhindert pathologische Schäden kortikaler Neuronen und hemmt Apoptose bei Ratten mit CI/RI

Die HE-Färbung wurde verwendet, um die pathologische Schädigung von Hirngeweben zu beobachten (Abb. 3a, b), was zeigt, dass die Neuronen in der Scheingruppe eine normale Struktur aufwiesen und sauber mit blassrotem Zytoplasma, blauem Kern und klarem Nukleolus angeordnet waren. In der MCAO-Gruppe, der NC-Gruppe und der miR-326-5p-Agomir + oe-STAT3-Gruppe wurde mit Ausnahme von Nekrose beobachtet, dass Neuronen ungeordnet angeordnet und dunkler gefärbt waren, mit Kernmembranruptur, Verschwinden der Zellstruktur, Karyopyknose, tiefer gefärbter Kern und Lyse in großer Menge. In der miR-326-5p-Agomir-Gruppe und der sh-STAT3-Gruppe wurde die Neuronenschwellung gelindert und die Neuronen wurden geordnet angeordnet, und die nekrotischen Zellen wurden reduziert, was auf einen besseren Status in Bezug auf die MCAO-Gruppe und die NC-Gruppe hinweist.

Eine Hochregulierung von miR-326-5p oder eine Herunterregulierung von STAT3 verhindert eine pathologische Schädigung kortikaler Neuronen und hemmt die Apoptose bei Ratten mit CI/RI. a Pathologische Schädigung von Hirngewebe bei MCAO-Ratten, beobachtet durch HE-Färbung (Maßstab:50 µm); b Die Anzahl intakter Neuronen von MCAO-Rattenhirngewebe nach der Hochregulierung von miR-326-5p oder Herunterregulierung von STAT3; c Neuronale Apoptose in MCAO-Rattenhirngewebe, nachgewiesen durch TUNEL-Färbung (Maßstab:50 µm); d TUNEL-positive Raten in MCAO-Rattenhirngewebe nach Hochregulierung von miR-326-5p oder Herunterregulierung von STAT3; e Bcl-2- und Bax-mRNA-Expression in MCAO-Rattenhirngewebe nach Hochregulierung von miR-326-5p oder Herunterregulierung von STAT3; *P <  0,05 im Vergleich zur Scheingruppe; #P < 0,05 im Vergleich zur NC-Gruppe; &P < 0,05 im Vergleich zur miR-326-5p-Agomir-Gruppe

Die TUNEL-Färbung wurde zum Nachweis von neuronaler Apoptose und RT-qPCR für die Bcl-2- und Bax-mRNA-Expression in Hirngeweben verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass (Abb. 3c–e) im Vergleich zur Sham-Gruppe und der miR-326-5p-Agomir-Gruppe die TUNEL-positive Rate zunahm, die Bcl-2-mRNA-Expression abnahm und die Bax-mRNA-Expression in der MCAO-Gruppe anstieg und die miR-326-5p agomir + oe-STAT3 Gruppe (alle P < 0,05). Niedrigere TUNEL-positive Rate und Bax-mRNA-Expression und höhere Bcl-2-mRNA-Expression zeigten sich in der miR-326-5p-Agomir- und der sh-STAT3-Gruppe als in der NC-Gruppe (alle P < 0.05).

Hochregulierung von miR-326-5p oder Herunterregulierung von STAT3 erhöht das Potential der Mitochondrienmembran im Hirngewebe von Ratten mit CI/RI

Der Nachweis der Mfn2-Proteinexpression in Rattenhirngewebe wurde durch Immunhistochemie durchgeführt, und die Ergebnisse zeigten, dass (Abb. 4a, b) eine niedrigere Mfn2-Proteinexpression in der Scheingruppe und der miR-326-5p-Agomir-Gruppe im Vergleich zur MCAO-Gruppe und dem . getestet wurde miR-326-5p-Agomir + oe-STAT3-Gruppe, während eine höhere Mfn2-Proteinexpression in der miR-326-5p-Agomir-Gruppe und der sh-STAT3-Gruppe anstelle der NC-Gruppe gemessen wurde (alle P < 0.05).

Eine Hochregulierung von miR-326-5p oder eine Herunterregulierung von STAT3 erhöht das Potential der Mitochondrienmembran im Hirngewebe bei Ratten mit CI/RI. a Mfn2-Expression immunhistochemisch in Rattenhirngewebe nachgewiesen (Maßstab:50 µm); b Anzahl Mfn2-positiver Zellen in MCAO-Rattenhirngewebe nach Hochregulierung von miR-326-5p oder Herunterregulierung von STAT3; c Mitochondriale Transmembranpotentiale in Neuronen von MCAO-Rattenhirngewebe nach Hochregulierung von miR-326-5p oder Herunterregulierung von STAT3; *P <  0,05 im Vergleich zur Scheingruppe; #P < 0,05 im Vergleich zur NC-Gruppe; &P < 0,05 im Vergleich zur miR-326-5p-Agomir-Gruppe

Der Nachweis des mitochondrialen Membranpotentials ergab, dass (Abb. 4c) im Vergleich mit der Scheingruppe und der miR-326-5p-Agomir-Gruppe das mitochondriale Membranpotential in der MCAO-Gruppe und dem miR-326-5p-Agomir + oe-STAT3 . abnahm Gruppe, während sie in der miR-326-5p-Agomir-Gruppe und der sh-STAT3-Gruppe im Gegensatz zur NC-Gruppe (alle P < 0.05).

miR-326-5p zielt auf STAT3

miR-326-5p- und STAT3-Expression in kortikalen Neuronen und Hirngeweben wurden durch RT-qPCR und Western-Blot-Analyse nachgewiesen. In kortikalen Neuronen in vitro deutete eine Abnahme der miR-326-5p-Expression und eine Zunahme der STAT3-Expression in der OGD-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (beide P < 0,05). In Bezug auf die NC-Gruppe war die miR-326-5p-Expression erhöht und die STAT3-Expression verringert in der miR-326-5p-Agomir-Gruppe (beide P <0,05); STAT3-Ausdruck verringert (P < 0,05) in der sh-STAT3-Gruppe. Im Gegensatz zur miR-326-5p-Agomir-Gruppe wurde die STAT3-Expression in der miR-326-5p-Agomir + oe-STAT3-Gruppe (P < 0,05) (Abb. 5a–c).

miR-326-5p zielt auf STAT3 ab. a miR-326-5p- und STAT3-mRNA-Expression in OGD-behandelten kortikalen Neuronen in vitro; b , c STAT3-Proteinexpression in OGD-behandelten kortikalen Neuronen in vitro; d miR-326-5p- und STAT3-mRNA-Expression in MCAO-Rattenhirngewebe; e , f STAT3-Proteinexpression in MCAO-Rattenhirngeweben; g Vorhergesagte Bindungsstelle von miR-326-5p und STAT3 durch Bioinformatik-Software; h Die Targeting-Beziehung zwischen miR-326-5p und STAT3 wurde durch einen dualen Luciferase-Reportergen-Assay validiert; In Abbildung ac , *P <  0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe; #P < 0,05 im Vergleich zur NC-Gruppe; &P < 0,05 im Vergleich zur miR-326-5p-Agomir-Gruppe. In Abbildung df , *P <  0,05 im Vergleich zur Scheingruppe; #P < 0,05 im Vergleich zur NC-Gruppe; &P < 0,05 im Vergleich zur miR-326-5p-Agomir-Gruppe

In Hirngeweben in vivo traten im Vergleich zur Scheingruppe niedrigere miR-326-5p und höhere STAT3 in der MCAO-Gruppe auf (beide P < 0,05). Im Vergleich zur NC-Gruppe stieg die miR-326-5p-Expression an, während die STAT3-Expression in der miR-326-5p-Agomir-Gruppe abnahm (beide P < 0,05). Die STAT3-Expression nahm in der sh-STAT3-Gruppe ab (P < 0,05). Bei der miR-326-5p-Agomir-Gruppe hingegen erhöhte sich die STAT3-Expression in der miR-326-5p-Agomir + oe-STAT3-Gruppe (P < 0,05) (Abb. 5d–f).

Die potentiellen Zielstellen von miR-326-5p auf STAT3 3′UTR wurden von DIANA und miRDB-Software gefunden (Abb. 5g). STAT3 3'UTR, das die WT miR-326-5p-Bindungsstelle und die Mut-Bindungsstelle enthielt, wurden konstruiert und in das pmirGLO-Plasmid eingefügt. Die Bindung von miR-326-5p an STAT3 3′UTR wurde durch den Luciferase-Reporter-Assay weiter validiert. Der Luciferase-Reporter-Assay zeigte, dass miR-326-5p-Agomir die relative Luciferase-Aktivität von STAT3-WT reduzierte, jedoch nicht STAT3-Mut (Abb. 5h), was darauf hindeutet, dass STAT3 ein direktes Zielgen von miR-326-5p war.

Diskussion

CI/RI ist die häufigste Ursache für zerebrovaskuläre Todesfälle [22]. miRNAs sollen an CI/RI beteiligt sein [23]. Allerdings ist das umfassende Verständnis des miR-326-5p-bezogenen Mechanismus bei CI/RI noch unzureichend. Daher zielt diese Studie darauf ab, die konkrete Rolle von miR-326-5p bei CI/RI aufzudecken, wobei der Schwerpunkt auf dem kombinierten Kehrwert von miR-326-5p und STAT3 liegt. Produktiv hat diese Studie erklärt, dass die Hochregulierung von miR-326-5p CI/RI abschwächt und die Mfn2-Expression über die STAT3-Hemmung erhöht.

Zu Beginn wurde festgestellt, dass die Expression von miR-326-5p in CI/RI in vivo und in vitro reduziert. Anschließend arrangierten wir eine Reihe von Assays und stellten fest, dass die Hochregulierung von miR-326-5p die Lebensfähigkeit von Neuronen und die mitochondriale Funktion verbesserte, die Mfn2-Expression erhöhte und oxidativen Stress und Apoptose zurückhielt. Furthermore, in vivo experiments in rats further verified the functional roles of restored miR-326-5p in CI/RI. As a matter of fact, high miR-326 is proved to correlate with long overall survival of patients with glioblastoma, the common type of brain tumor [24]. Also, miR-326 expression has been further evidenced to reduce in Parkinson's disease and miR-326 could suppress apoptosis of dopaminergic neurons and reduce inflammatory response [25]. Except for that, the reduction in miR-326-5p is manifested in endothelial progenitor cells in the course of myocardial infarction, and introduction of endothelial progenitor cells overexpressing could promote cardiac function recovery [11]. There has been a study illustrating that up-regulation of miR-326 improves the behavioral function, enhances neuronal viability and depresses neuronal apoptosis in mice with Alzheimer's disease [26]. Furthermore, it is documented that up-regulation of miR-326 by miR-326 mimic could suppress inducible nitric oxide synthase in dopaminergic neurons in Parkinson's disease [27].

In this study, we found that STAT3 was a target gene of miR-326-5p. Supported by an advanced study, it is indicated that STAT3 expression is negatively regulated by miR-326 in human endometrial carcinoma stem cells [28]. In the present study, we measured that STAT3 expression was enhanced in CI/RI. Currently, it has been found that I/R injury and OGD would induce STAT3 expression to increase [29]. Intriguingly, STAT3 mRNA expression trends to an increment in I/R animals [30]. Additionally, STAT3 protein expression is reported to up-regulate in CI/RI [31]. Next, our study revealed that down-regulating STAT3 had the therapeutic effects on CI/RI rats and OGD-treated neurons. As supported by a study, it is concluded that miR-31 induction discourages oxidative stress by inactivation of JAK/STAT3 pathway in ischemic stroke [32]. Also, inhibition of JAK2/STAT3 pathway is beneficial to oxidative stress impairment in CI/RI [31]. Furthermore, knockdown of JAK/STAT3 pathway is identified to enhance cell viability, and reduce oxidative stress and neuron apoptosis in ischemic brain injury [33]. Lately, inhibited JAK/STAT3 signaling pathway is witnessed to relieve myocardial infarction in myocardial I/R injury [34]. As demonstrated, depleted STAT3 undermines neuronal apoptosis in rats with white matter injury [35]. Moreover, the suppression of neuronal apoptosis, and alleviation of cerebral infarct size are attributed to JAK2/STAT3 inhibition in rats with CI/RI [36].

Finally, we focused on the effects of miR-326-5p and STAT3 on Mfn2 expression and discovered that the reduced level Mfn2 in rats with CI/RI and OGD-treated neurons could be elevated by either restoring miR-326-5p or silencing STAT3. As implicated by a previous study, it is documented that Mfn2 is decreased in the lately phase of reperfusion and poorly expressed of Mfn2 exacerbates CI/RI via restrained autophagosome formation and autophagosome and lysosome fusion [18]. Additionally, Mfn2 is implied to reduce even disappear in I/R injury in old hepatocytes [37]. However, few researches have discussed the regulatory mechanism of miR-326-5p and STAT3 for Mfn2.

Conclusion

In general, this study has elucidated the mechanisms that elevated miR-326-5p inhibits neuronal apoptosis, attenuates pathological damage of neurons and increases the expression of Mfn2 via STAT3 downregulation in CI/RI. The study may update the potential mechanism of miR-326-5p and STAT3 in CI/RI. However, more studies are still needed for further development of the molecular mechanism in CI/RI.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Nicht zutreffend.

Abkürzungen

miRNAs:

MicroRNAs

STAT3:

Signal transducer and activator of transcription-3

OGD:

Oxygen and glucose deprivation

MCAO:

Middle cerebral artery occlusion

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies

STAT:

Signal transducers and transcriptional activator

Mfn2:

Mitofusin-2

FITC:

Fluoresceinisothiocyanat

NES:

Nestin

NC:

Negative control

Ö:

Overexpression

RT-qPCR:

Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction

OD:

Optische Dichte

PI:

Propidium iodide

MDA:

Malondialchehyche

GSH:

Glutathione

SOD:

Superoxide dismutase

DAB:

Diaminobenzidine

PVDF:

Polyvinylidenfluorid

WT:

Wild-type

Mut:

Mutant

SD:

Standardabweichung

ANOVA:

One-way analysis of variance


Nanomaterialien

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