CoFe2O4-Quantenpunkte für die synergistische photothermische/photodynamische Therapie von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs durch Auslösen der Apoptose durch Regulierung des PI3K/AKT-Pfads

Einführung

Krebs ist die häufigste Todesursache und bringt eine enorme Belastung für Familie und Gesellschaft mit sich, wobei Lungenkrebs im Jahr 2020 die zweithäufigste Krebserkrankung und die erste krebsbedingte Todesursache ist [1, 2]. Wie berichtet, zeichnet sich das nicht-kleinzellige Lungenkarzinom (NSCLC), das etwa 85 % aller Lungenkarzinome ausmacht, durch eine hohe Inzidenz und Mortalität aus [3, 4]. In letzter Zeit wurden trotz chirurgischer Optionen große Anstrengungen unternommen, um Chemotherapien oder Immuntherapien zur Behandlung von NSCLC zu entwickeln. Beispielsweise haben sich EGFR-mutierte Inhibitoren und KRAS-Inhibitoren als wirksam erwiesen und es werden noch weitere neue ALK-Inhibitoren entwickelt [5,6,7,8,9]. Anti-PDL1 und Anti-CLTA4, solche Immun-Checkpoint-Inhibitoren, bringen auch eine vielversprechende Wirksamkeit und verlängern den Überlebensvorteil [10,11,12]. Allerdings ist die Ansprechrate auf diese Medikamente von Patient zu Patient unterschiedlich und die Nebenwirkungen, insbesondere die Medikamentenresistenz, sollten nicht vernachlässigt werden [13, 14]. Daher ist die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien, die weniger invasiv sind, eine dringende und auch eine Notwendigkeit für die NSCLC-Forschung und klinische Behandlungen.

Basierend auf den jüngsten Fortschritten hat die Verwendung von Nanomaterialien zur Durchführung der photothermischen Therapie (PTT) und der photodynamischen Therapie (PDT) enorme Aufmerksamkeit erregt und eine große Entwicklung als Anti-Krebs-Strategie erreicht und könnte eine alternative Option in der klinischen Behandlung sein [15,16,17, 18]. PTT und PDT auf Nanomaterialbasis zeichnen sich durch eine geringere Invasion und geringe Toxizität aus, was mit geringer Wahrscheinlichkeit eine Arzneimittelresistenz hervorruft [19,20,21,22,23]. Durch die Zusammenarbeit von Licht, meist NIR, können lokalisierte Nanomaterialien die Temperatur im Tumor erhöhen und Sauerstoff in zytotoxizitätsreaktive Sauerstoffspezies (ROS) umwandeln, die den Zelltod verursachen, um Tumore zu eliminieren [24]. Dabei spielt das Nanomaterial eine Schlüsselrolle, um die Wirksamkeit zu beeinflussen und die Sicherheit zu gewährleisten. Obwohl solche Nanomaterialien Metallnanostrukturen [25], kohlenstoffbasierte Materialien [26, 27], polymere Nanopartikel (PNPs) [28] oder Halbleiterverbindungen [29] umfassten, haben sie ihre eigenen Grenzen. Materialien auf Kohlenstoffbasis sind beispielsweise teuer und haben eine unbefriedigende Suspensionseigenschaft, was ihre Anwendung im großen Maßstab und die klinische Möglichkeit einschränkt. Daher sollten mehr Versuche unternommen werden, um geeignetere Nanomaterialien für die weitere Verwendung zu generieren.

In den letzten Jahren haben Quantenpunkte (QDs) als neuartige Nanomaterialien aufgrund ihrer guten Biokompatibilität, Löslichkeit und vor allem ihrer überlegenen Photostabilität und leichten Oberflächenfunktionalisierungseigenschaft große Anziehungskraft in biomedizinischen Anwendungen erlangt [30,31,32, 33]. Diese Eigenschaften nutzend, haben mehrere Berichte QDs als neuartige PDT-Reagenzien verwendet und können so gestaltet werden, dass sie mit anderen Biomolekülen kombiniert werden, um die Wirksamkeit der PDT bei der Krebsbehandlung zu verbessern. Meng und Kollegen berichteten beispielsweise von einem multifunktionalen GQD@MnO₂ durch Zwei-Photonen-Anregung induziert, um die PDT-Wirksamkeit zu verbessern [34]. Darüber hinaus erzeugten Kuo und Kollegen stickstoffdotierte QDs, indem sie sie mit Aminomolekülen funktionalisierten, was ebenfalls die PDT-Effizienz steigerte [35]. Inspiriert von diesen interessanten Erkenntnissen versuchten wir, neuartige QDs in Kombination mit Nichtedelmetall-basierten Nanomaterialien zu entwickeln, die synergistische PTT- und PDT-Effekte in einem Nanosystem bringen können. Co-basierte Nanomaterialien sind beispielsweise gut untersuchte Nanomaterialien auf Nichtedelmetallbasis, die für ihre Verwendung als PTT-Wirkstoffe für die Tumortherapie oder Bildgebung bekannt sind [36]. Daher haben wir vorgeschlagen, dass das Design von Co-basierten QDs verbesserte PTT/PDT-Synergistikeffekte mit sich bringen kann.

In dieser Studie synthetisierten wir neuartige Nanomaterialien CoFe₂ O₄ -QDs, die verstärkte synergistische PTT- und PDT-Wirkungen bei der Abtötung von NSCLC ohne toxische Wirkungen in vitro und in vivo aufweisen, was ein vielversprechender Photosensibilisator für die NSCLC-Therapie sein könnte.

Material und Methoden

Synthese von CoFe₂ O₄ -QDs

Das CoFe₂ O₄ -QDs wurden durch hydrothermale Methode synthetisiert. Normalerweise 0,238 g CoCl₂ ·6H₂ O und 0,808 g Fe(NO₃ .) )₃ ·9H₂ O wurden in 10 ml H₂ . gelöst O und 10 ml Propylenglykol-Lösungsmittelgemisch und dann 10 Minuten gerührt. Dann wurden 4 ml Dithranolamin tropfenweise in die Lösung gegeben, gefolgt von 30 Minuten Rühren. Dann wurde die erhaltene Aufschlämmung in einen rostfreien, mit Teflon ausgekleideten 50 ml-Autoklaven überführt. Der Autoklav wurde 3 h in einem Ofen bei 160 °C gehalten. Das CoFe₂ O₄ -QDs wurden durch Zentrifugieren bei 8500 U/min für 10 Minuten gesammelt und dann nacheinander mit entionisiertem Wasser und Ethanol gespült. Reagenzien und Materialien, die in dieser Studie verwendet wurden, finden Sie in Tabelle 1.

Charakterisierung von CoFe₂ O₄ -QDs

Morphologie und Größe von präpariertem CoFe₂ O₄ -QDs wurden durch TEM- und EDS-System bestimmt. Die Kristallstruktur wurde mit einem Röntgendiffraktometer (Bruker Deutschland) mit Cu Ka-Strahlung (k = 0,15406 nm). Das Absorptionsspektrum von CoFe₂ O₄ -QDs wurde mit dem SHIMADZU UV-2600 Spektrophotometer nachgewiesen. Die Elementvalenzzustände von CoFe₂ O₄ -QDs wurden durch Röntgenphotoemissionsspektroskopie-Messungen (XPS, VG ESCALAB 220I-XL, USA) bestimmt. Das Wärmebild wurde mit einer IR-Wärmebildkamera (FLIR E50, USA) aufgenommen.

Zellkultur

Die NSCLC-Zelllinien NCI-H460 (H460) und A549 und menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) wurden von ATCC bezogen und auf Mikroplasma-Negativ getestet. H460- und A549-Zellen wurden in RPMI-1640, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin (Gibco), kultiviert. HUVECs wurden in Endothelzell-Wachstumsmedium (Sigma, #211-500) kultiviert. Alle Zellen wurden in einem 37 ℃ Inkubator mit dunkler Feuchtigkeit und 5% CO₂ . gehalten .

Zytotoxizitätsnachweis

Verschiedene Arbeitskonzentrationen (0,1, 0,5, 1,0, 2,0 mg/ml) von CoFe₂ O₄ -QDs wurden hinzugefügt und mit HUVECs für 24 Stunden kultiviert. Nach der Inkubation wurde das Kulturmedium gewechselt und CCK-8 Regent zu jeder Vertiefung zugegeben, gefolgt von einer 1-stündigen Inkubation. Dann wurden die Platten bei 450 nm mit dem EnSpire™ Multimode Plate Reader gemessen. Das Verhältnis der Zelllebensfähigkeit wurde in Kontroll-HUVECs als 100 % angenommen.

Apoptose-Analyse

H460- und A549-Zellen (2 × 10 ⁵ ) wurden über Nacht in 6-Well-Platten kultiviert, bevor sie mit 1,0 mg/ml CoFe₂ . behandelt wurden O₄ -QDs kombiniert mit NIR-Laser von 808 nm für 5 Minuten. Dann wurden die Zellen gewaschen und mit dem Annexin-V/PI-Apoptose-Kit (BD; #556547) gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt. Wie für HUVECs Apoptose-Assay wurden HUVECs mit unterschiedlichen Konzentrationen von CoFe₂ . inkubiert O₄ -QDs. Das Apoptoseverhältnis wurde wie oben beschrieben bestimmt.

Mobile ROS-Erkennung

H460- und A549-Zellen wurden über Nacht in Platten mit 6 Vertiefungen kultiviert. Die Zellen wurden mit oder ohne 1,0 mg/ml für 1 h inkubiert und mit einem NIR-Laser von 808 nm für 5 Minuten behandelt. Nach den Behandlungen wurde DCFH-DA zugegeben und für 30 Minuten inkubiert, gefolgt von einer FACS-Detektion mit Anregung/Emission bei 485 nm/535 nm. Wie beim ROS-Hemmtest wurde der ROS-Inhibitor NAC (Sigma; A7250) gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzugefügt. Die Daten wurden mit der Flow-jo-Software weiter quantifiziert.

Western Blot-Analyse

H460- und A549-Zellen wurden als Apoptose-Assay behandelt und das Gesamtzellprotein wurde unter Verwendung von RIPA-Lysepuffer extrahiert. Der Western-Blot-Nachweis wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [37]. Die in dieser Studie verwendeten Antikörper waren unten aufgeführt:polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen Bcl-2 (abcam; ab59348), monoklonaler Kaninchen-Antikörper gegen Bax (abcam; ab32503), polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen P -PI3K (Bio-Vision; 3152-100), Kaninchen monoklonaler Anti-P -AKT-S473 (CST; 4060S), monoklonaler Kaninchen-Anti-β-Actin (CST; 4970S), Anti-Kaninchen-IgG-HRP-gebundener Antikörper (CST; 7074S). Die Quantifizierung wurde unter Verwendung der Image-J-Software bestimmt.

In-vivo-Studie zur Anti-NSCLC-Wirkung der Kombination von CoFe₂ O₄ und NIR-Behandlung

Um die Tumorabtötungsfähigkeit von CoFe₂ . zu bestimmen O₄ -QDs, H460-Zellen wurden subkutan mit 50% MatriGel in NSG-Mäuse (N = 8 jede Gruppe). Für alle In-vivo-Experimente wurden 4–6 Wochen alte männliche M-NSG-Mäuse von Shanghai Model Organisms (#NM-NSG-001) erhalten. Als der Tumor sichtbar wurde und das Volumen fast 5 mm × 5 mm erreichte, wurden alle Mäuse nach dem Zufallsprinzip in vier Gruppen eingeteilt, die als Kontrolle, nur NIR, CoFe₂ . bezeichnet wurden O₄ -Nur QDs und CoFe₂ O₄ -QDs + NIR-Gruppe. Dann Mäuse in CoFe₂ O₄ -Nur QDs und CoFe₂ O₄ -QDs + NIR-Gruppe wurden intratumoral 50 μL CoFe₂ . injiziert O₄ (5,0 mg/kg) basierend auf unserer früheren Arbeit [37], während der Kontroll- und NIR-Gruppe 50 μl PBS injiziert wurden. Nach der Injektion NIR-808 nm-Laser (1 W/cm ² .) ) wurde in NIR und CoFe₂ . durchgeführt O₄ -QDs + NIR-Gruppe für 10 Minuten, die mit Infrarot-Wärmebildgeräten überwacht wurde. Das Tumorvolumen wurde jeden Tag aufgezeichnet und mit der Formel V . berechnet = Länge × Breite ² /2. Sobald der Durchmesser der Tumor-Xenotransplantate bei den verbleibenden Mäusen fast 15 mm erreicht hatte, wurden die Mäuse getötet und die Tumor-Xenotransplantate wurden fotografiert und zur weiteren Detektion aufbewahrt. Alle Tierversuche und Protokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) und dem Animal Welfare Committee des Peking University Shenzhen Hospital genehmigt.

H&E und Immunhistopathologie-Färbungsanalyse

Zur pathologischen Beurteilung werden die Tumor-Xenotransplantate (N = 3) wurden einen Tag nach der Behandlung in jeder Gruppe geerntet und dann in 10 % gepuffertem Formalin fixiert, gefolgt von Einbetten in Paraffin für die H&E-Färbung und den IHC-Nachweis. Zur in-vivo-Toxizitätsbewertung wurden Niere, Leber, Lunge, Herz und Milz der Mäuse extrahiert und zur pathologischen Bewertung fixiert. Für die IHC-Färbung wurde Anti-Ki67-Antikörper (Abcam; ab15580) verwendet. Die Quantifizierung des IHC-positiven Bereichs wurde mit der Software Fiji durchgeführt.

Statistische Analyse

Für alle Experimente „N ” steht für die Anzahl der Wiederholungen oder die Anzahl der verwendeten Mäuse, wie in der Legende der Abbildung angegeben. Schüler t -Test oder Einweg-ANOVA wurde für statistische Vergleiche verwendet. P < 0,05 gilt als statistisch signifikant, während „ns“ nicht signifikant ist. P < 0.05, P < 0.01 und P < 0,001 sind mit „*“, „**“ bzw. „***“ Sternchen gekennzeichnet. Die Daten wurden mit GraphPad Prism 5 analysiert.

Ergebnisse

Die Eigenschaften von neuartigem CoFe₂ O₄ -QDs

Zuerst konstruierten wir das CoFe₂ O₄ -QDs unter Verwendung eines hydrothermalen Ansatzes, der kostengünstig und einfach durchzuführen ist. Das TEM-Bild von CoFe₂ O₄ -QDs wurde in Abb. 1a gezeigt und zeigt ein einheitliches und stabiles Muster mit einem Durchmesser von etwa 3,4 nm (Abb. 1b). Das so hergestellte CoFe₂ O₄ -QDs hatten eine dunkelbraune Farbe (Abb. 1b) und eine ausgezeichnete Löslichkeit in Wasser. Darüber hinaus zeigt das hochauflösende TEM-Bild (Abb. 1c) einen Gitterabstand von (222) von etwa 0,242 nm, was mit den Kristallparametern von CoFe₂ . übereinstimmt O₄ -QDs [38, 39]. Darüber hinaus bestätigte das Elementspektrum (Abb. 1d) die Elementkomponente des CoFe₂ . O₄ -QDs ist Co und Fe, und das Atomverhältnis von Co und Fe betrug etwa 1:2. Diese Daten zeigten eine erfolgreiche Konstruktion von CoFe₂ O₄ -QDs für unsere weitere Forschung.

Herstellung und Charakterisierung von CoFe₂ O₄ -QDs. a Das repräsentative TEM-Bild von vorbereitetem CoFe₂ O₄ -QDs. Maßstabsleiste, 20 nm. b Eine globale Analyse der Größe von CoFe₂ O₄ -QDs mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 3,4 nm. Der Einschub ist das repräsentative Digitalfoto des CoFe₂ O₄ -QDs-Aufhängung. c Die Gitterränder der Nanokristalle im präparierten Zustand entsprechen CoFe₂ O₄ -QDs HRTEM-Bild. Maßstabsleiste, 2 nm. d Das so hergestellte CoFe₂ O₄ -QDs zeigten eine gleichmäßige Verteilung von Co, Fe und O. Die repräsentative Elementkarte wurde gezeigt

Der Nachweis der physikalischen Eigenschaften von CoFe₂ O₄ -QDs

Um die physikalischen Eigenschaften von hergestelltem CoFe₂ . zu bestimmen O₄ -QDs, wir haben nach dem Bau mehrere Erkennungen durchgeführt. Mit dem NIR-Absorptionsbestimmungstest wird CoFe₂ O₄ -QDs zeigten eine korrekte photothermische Umwandlung in einer konzentrationsabhängigen Weise und die Temperaturinkremente (ΔT ) konnte von 0,3 bis 18,9 °C eingestellt werden (Abb. 2a). Darüber hinaus bei einer Konzentration von 1,0 mg/ml CoFe₂ O₄ -QDs durch Erhöhung der NIR-Strahlungsleistung von 0,5 auf 2,0 W/cm ² , konnte die ΔT von 0,8 bis 24,3 °C eingestellt werden (Abb. 2b). Diese Daten legen nahe, dass die photothermische Umwandlungsleistung von CoFe₂ O₄ -QDs war abhängig von seiner Konzentration und der Strahlungsleistung. Darüber hinaus ist die Stabilität von CoFe₂ O₄ -QDs-getriggerte photothermische Umwandlung wurde mit periodischer Bestrahlung bestimmt (Abb. 2c). Obwohl die berechnete Licht-Wärme-Umwandlungseffizienz 7,18 % betrug (Abb. 2d), reicht es aus, um den PDT-Effekt von CoFe₂ . zu verstärken O₄ -QDs. Darüber hinaus ist die längste Wellenlänge von CoFe₂ O₄ -QDs können Licht bei etwa 808 nm absorbieren (Abb. 2e, f). Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass CoFe₂ O₄ -QDs könnten zu einem vielversprechenden PTT/PDT-Synergisten für eine alternative Tumorabtötungstherapie entwickelt werden.

Die Eigenschaftsbewertung von CoFe₂ O₄ -QDs. a Die photothermische Umwandlung von CoFe₂ O₄ -QDs wurde unter verschiedenen Konzentrationen bestimmt. Die Heizkurven werden angezeigt. b Die von der Bestrahlungsenergie abhängige Art von CoFe₂ O₄ -QDs wird bei unterschiedlichen Leistungsdichten angezeigt (0,5–2,0 W/cm ² ). c CoFe₂ O₄ -QDs haben eine stabile photothermische Umwandlung, die mit 4 Zyklen kontinuierlicher Erwärmung-Kühlung (1,0 W/cm ² .) nachgewiesen wurde ). d Die Effizienz von CoFe₂ O₄ -QDs photothermische Umwandlung. e , f Die Beziehung zwischen Wellenlänge und Absorption von CoFe₂ O₄ -QDs

Zytotoxizitätsbewertung von CoFe₂ O₄ -QDs zu normalen Zellen

Da Nanopartikel weit verbreitet als Wirkstoffabgabe oder Intramedium für Tumortherapien verwendet werden, ist die Zytotoxizität von CoFe₂ O₄ -QDs gegenüber normalen Zellen, insbesondere menschlichen vaskulären Epithelzellen, sollten für die weitere Verwendung bestätigt werden. Aus diesem Grund haben wir anhand der vorherigen Ergebnisse verschiedene Konzentrationen (0,1, 0,5, 1,0 und 2,0 mg/ml) von CoFe₂ . getestet O₄ -QDs. Nach der Kokultivierung mit HUVECs (normale humane Epithelzelllinie) wurde CCK-8-Reagenz zum Nachweis der Zelllebensfähigkeit zugegeben. Im Vergleich zur Kontrollgruppe wurde keine offensichtliche Zytotoxizität beobachtet (Abb. 3a). In diesem Zusammenhang wurde ein weiterer Apoptose-Assay durchgeführt, um unter den gleichen Bedingungen konsistente Ergebnisse zu erzielen (Abb. 3b). Die Quantifizierung der Apoptoserate zeigte keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb. 3c). Diese Daten zeigten, dass CoFe₂ O₄ -QDs hatten keine offensichtlich toxische Wirkung auf normale Zellen, was darauf hindeutet, dass CoFe₂ O₄ -QDs hatten das Potenzial, als Intermedium für die Wirkstoffabgabe verwendet zu werden.

In-vitro-Beurteilung der Zytotoxizität von CoFe₂ O₄ -QDs in Richtung normaler Zellen. a Der CCK-8-Zelllebensfähigkeitstest in HUVECs wurde unter verschiedenen Konzentrationen von CoFe₂ . durchgeführt O₄ -QDs. Die Lebensfähigkeit der Kontrollgruppe wurde als 100 % angenommen. Die Daten wurden als Mittelwert ± SD, N . angezeigt = 3. b Die Apoptose von HUVECs wurde durch FACS-Nachweis bestimmt. Repräsentative Bilder der angegebenen Konzentrationen werden gezeigt, N = 3. c Die Quantifizierung des Apoptoseverhältnisses. Sie zeigen keine Signifikanz im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Daten wurden als Mittelwert angezeigt  ± SD

Kombination von NIR und CoFe₂ O₄ -QDs induziert die Apoptose von NSCLC

Zur Bestimmung der potenziellen NSCLC-Krebsabtötungsfähigkeit von CoFe₂ O₄ -QDs, NIR-Laserstrahlung (808 nm) wurde kombiniert mit Inkubation von CoFe₂ . durchgeführt O₄ -QDs in vitro. Dann wurde nach den Behandlungen ein Apoptose-Assay durchgeführt, sowohl H460- als auch A549-Zellen zeigten eine aggressive Apoptoserate mit der Kombination von CoFe₂ O₄ -QDs und NIR-Laser (Abb. 4a, b). Die Quantifizierung zeigte einen signifikanten Unterschied im Vergleich zur Kontrollgruppe, während CoFe₂ O₄ - Nur QDs oder nur NIR-Gruppen zeigten keinen Unterschied, was darauf hindeutet, dass CoFe₂ O₄ -QDs plus NIR könnten einen Anti-NSCLC-Effekt induzieren (Abb. 4a, b). Es ist bekannt, dass die Veränderung des Proteinspiegels von Bcl-2/Bax wichtig ist, um zu bestimmen, ob die Zellen eine Apoptose eingehen würden [40]. In Übereinstimmung mit dieser Idee wurde der Proteinspiegel von Bcl-2 und Bax sowohl in H460- als auch in A549-Zellen nach Behandlungen bestimmt (Fig. 4c, d). Wie respektiert, zeigten die Daten auch, dass das Verhältnis von Bcl-2/Bax abnahm, was als Marker für mitochondrienvermittelte Apoptose angesehen wurde. Daher haben wir vorgestellt, dass CoFe₂ O₄ -QDs plus NIR führen zu einer Anti-NSCLC-Wirkung durch die Aktivierung des mitochondrienvermittelten Apoptoseweges.

In-vitro-Kombination von CoFe₂ O₄ -QDs und NIR induzieren NSCLC-Apoptose. a , b H460- und A549-NSCLC wurden mit der Kombination von CoFe₂ . behandelt O₄ -QDs und NIR-Laser für 5 Minuten. Die apoptotischen Zellen wurden durch Annexin-V-Färbung bewertet und durch FACS nachgewiesen. Die Quantifizierung wird jeweils ebenfalls gezeigt. Die Daten wurden als Mittelwert ± SD, N . angezeigt = 3. **P < 0,01 vs. Kontrolle, NIR, CoFe₂ O₄ Gruppen. c , d Der Proteinspiegel von Bcl-2 und Bax wurde durch Western-Blot-Analyse in NCI-H460 und A549 NSCLC nach der Behandlung bestimmt. Repräsentative Bilder werden gezeigt. Die Quantifizierung wird nach Kalibrierung auf die Expression der internen Kontrolle β-Actin gezeigt. Die Daten wurden als Mittelwert ± SD, N . angezeigt = 3.*P < 0,05 vs. Kontrolle, NIR, CoFe₂ O₄ Gruppen

Kombination von CoFe₂ O₄ -QDs und NIR induzieren ROS-Generierung über den PI3K/AKT-Pfad

Die Dysfunktion der Mitochondrien führt immer zu einer hochregulierten ROS-Erzeugung, die bei NSCLC zum Zelltod führt. In diesem Zusammenhang haben wir den ROS-Nachweis nach CoFe₂ . durchgeführt O₄ -QDs plus NIR-Behandlung in H460- und A549-Zellen. Die Ergebnisse zeigten, dass eine immense Freisetzung von ROS in der Kombinationsgruppe, was auf einen verstärkten PDT-Effekt hindeutet, durch CoFe₂ . induziert werden könnte O₄ -QDs auch bei geringer photothermischer Transmissionseffizienz (Zusatzdatei 1:Abb. S1A, B). Darüber hinaus war auch der zugehörige Proteinspiegel des PI3K/AKT-Signalwegs reduziert, was darauf hindeutet, dass die Veränderung von ROS durch den PI3K/AKT-Signalweg reguliert wurde, was zu einer Veränderung des Bcl-2/Bax-Protein-Expressionsspiegels führt (Abb. 4c, d, Zusatzdatei 1:Abb. S1C, D). Um diese Idee zu bestätigen, wurde der ROS-Inhibitor NAC hinzugefügt, um das Phänomen umzukehren (Abb. 5a, b). Dann wurde festgestellt, dass die Expression von PI3K/AKT nach der NAC-Behandlung gerettet wurde, was weiter bestätigte, dass die ROS-Freisetzung nach CoFe₂ O₄ -QDs plus NIR-Behandlung wurde durch den PI3K/AKT-Weg reguliert (Abb. 5c, d). Diese Ergebnisse unterstützen nachdrücklich die Idee, dass die Kombination von CoFe₂ O₄ -QDs und NIR können zu einer synergistischen PTT- und PDT-Wirkung beim Abtöten von NSCLC-Zellen führen, indem sie eine mitochondriale Dysfunktion (ROS) abhängige Apoptose induzieren.

Die Kombination von CoFe₂ O₄ -QDs und NIR induzieren die ROS-Erzeugung durch die Regulierung des PI3K/AKT-Pfads. a , b NCI-H460- und A549-NSCLCs wurden mit CoFe₂ . behandelt O₄ -QDs und NIR-Laser mit oder ohne NAC für 5 min. Der ROS-Spiegel wurde durch FACS nachgewiesen bzw. die mittlere Fluoreszenzintensität wurde quantifiziert. Die Daten wurden als Mittelwert ± SD, N . angezeigt = 3. **P < 0,01. c , d Der Proteingehalt von P -PI3K und P -AKT wurde durch Western-Blot-Analyse bestimmt. Repräsentative Bilder werden gezeigt, N = 3

In-vivo-Anti-NSCLC-Bewertung einer Kombination von CoFe₂ O₄ -QDs und NIR

Basierend auf den In-vitro-Ergebnissen untersuchten wir als nächstes die Anti-NSCLC-Wirkung von CoFe₂ . O₄ -QDs und NIR-Kombinationsbehandlung am NSCLC-Tumor tragenden Mausmodell. M-NSG-Mäusen wurden H460-Zellen subkutan implantiert. Nach intratumoraler Injektion von CoFe₂ O₄ -QDs verursachte die NIR-Laserbestrahlung einen schnellen Temperaturanstieg auf etwa 56 °C unter der Überwachung von thermischen Detektionsgeräten (Abb. 6a, b). Darüber hinaus zeigte die histopathologische Färbung einen ausgedehnten Nekrosebereich, der in der Kombinationsgruppe beobachtet wurde, was darauf hindeutet, dass CoFe₂ O₄ -QDs plus NIR-Behandlung verursachten den Tod von Tumorzellen als Ergebnis der Tumorelimination (Abb. 6c, d). Eine weitere IHC-Färbung zeigte auch, dass der Ki-67-positive Bereich im Vergleich zu anderen Gruppen nach der Kombinationsbehandlung aggressiv geschrumpft war, was darauf hindeutet, dass die behandelten Tumor-Xenotransplantate nicht mehr proliferieren konnten (zusätzliche Datei 2:Abb. S2A, B). Als nächstes verfolgten wir 12 Tage lang nach CoFe₂ O₄ -QDs und NIR-Behandlung. Wie wir erwartet hatten, nahmen die Größe und das Gewicht der Tumor-Xenotransplantate in anderen Gruppen bemerkenswert zu, aber nicht in der CoFe₂ O₄ -QDs- und NIR-Behandlungsgruppe (Abb. 6e, f), die die Idee unterstützt, dass CoFe₂ O₄ -QDs und NIR kombinierte Behandlung könnten die Tumor-Xenotransplantate in vivo vollständig eliminieren. Zur zytotoxischen Wirkung von CoFe₂ O₄ -QDs, zumindest in unserem Beobachtungszeitraum, wurden aus den Ergebnissen der histopathologischen Analyse in wichtigen Organen von Mäusen keine offensichtlichen Nebenwirkungen festgestellt (Zusatzdatei 2:Abb. S2C). Die obigen Daten lieferten einen starken Beweis dafür, dass CoFe₂ O₄ -QDs könnten als neuartiges PTT/PDT-Reagenz für die NSCLC-Behandlung entwickelt werden.

In-vivo-Bewertung der Tumorabtötung der Kombination von CoFe₂ O₄ -QDs und NIR-Behandlung. a Die repräsentativen Infrarot-Wärmebilder von M-NSG-Mäusen, die NCI-H460-Tumor-Xenotransplantate tragen, werden gezeigt. b Die Temperaturkurve zeigt die Temperaturerhöhung innerhalb von Tumor-Xenotransplantaten unter NIR-Bestrahlung. c Die pathologische H&E-Färbung jeder Gruppe wurde 1 Tag nach der Behandlung fotografiert. In der Kombinationsgruppe konnte eine scheinbare Nekrose beobachtet werden. Repräsentative Bilder werden gezeigt, N = 3. d Das Foto der Xenotransplantate in jeder Gruppe nach der Tötung der Mäuse, N = 5. e , f Die Wachstumskurve und das Gewicht der Tumor-Xenotransplantate in jeder Gruppe wurden aufgezeichnet. Die Daten wurden als Mittelwert ± SD, N . angezeigt = 5.***P <0,001

Diskussion

In den letzten Jahren hat die Forschung zur Entwicklung von Anti-NSCLC-Strategien enorme Fortschritte erzielt. Sowohl die Präzisionsmedizin, die auf spezifische mutierte onkogenabhängige NSCLC abzielt, als auch Immun-Checkpoint-Blockade-Therapien bringen eine vielversprechende Zukunft in der klinischen Behandlung [41, 42]. Angesichts der Komplexität und Heterogenität der Tumormikroumgebung und des zugrunde liegenden Risikos, Tumorantigen zu verlieren, bleibt es jedoch ein Flaschenhals, die Arzneimittelresistenzrate nach dem Immunevasiv-Status zu senken, was in kurzer Zeit zu einem Tumorrezidiv führt. Daher ist die Suche nach neuen Behandlungen oder Zwischenprodukten für NSCLC-Therapien dringend erforderlich. Unter den neuen Ansätzen wurden Nanomaterialien geschätzt und als wirksame krebsabtötende Mittel aufgeführt. Mehrere Nanomaterialien nutzen ihre geringe Größe, gute Biokompatibilität und Wärmeübertragungsfähigkeiten und zeigen in neueren Forschungen hervorragende Fähigkeiten zur Abtötung von Krebs [43].

In unserer Studie haben wir ein neuartiges CoFe₂ . entwickelt O₄ -QDs, die als Zwischenprodukt für NSCLC-Behandlungen verwendet werden könnten, indem sie die Apoptose von Tumorzellen mit synergistischen PTT- und PDT-Effekten induzieren. Wie andere Nanomaterialien auch CoFe₂ O₄ -QDs zeigten in unseren Studien ausgezeichnete Biokompatibilitäten, die keine offensichtliche Toxizität gegenüber normalen Zellen und Hauptorganen zeigten. Obwohl wir festgestellt haben, dass die Wärmeübertragungsrate nicht so hoch ist wie bei anderen Nanomaterialien, reicht sie für CoFe₂ . aus O₄ -QDs, um die Apoptose von Krebszellen unter der NIR-Laseraktivierung zu induzieren. CoFe₂ O₄ -QDs zeigen in dieser Studie eine gute lineare Beziehung zur Lichtabsorption und erzeugen möglicherweise ROS mit der Kombination von NIR-Lasern, was weiter beweist, dass CoFe₂ O₄ -QDs können als vorteilhafter Photosensibilisator wirken. Als nächstes können wir die Struktur weiter optimieren oder wärmeempfindliche Elemente zu CoFe₂ . hinzufügen O₄ -QDs, die eine höhere Wärmeübertragungsrate für bessere synergistische PTT- und PDT-Effekte erreichen könnten [44, 45]. Darüber hinaus werden chemische Medikamente oder Antikörper auf die Oberfläche von CoFe₂ . aufgetragen O₄ -QDs ist ebenfalls möglich, was eine überlegene Tötungseffizienz bringen kann. Zum Beispiel der Ansatz, Anti-PDL1- oder Anti-CTLA4-Antikörper an CoFe₂ . zu koppeln O₄ -QDs könnten eine vielversprechende Kombinationstherapie sein, um die immunsuppressive Mikroumgebung in Tumoren zu durchbrechen, was unser nächstes Interesse ist, CoFe₂ . vollständig zu nutzen O₄ -QDs.

Außerdem ist der Mechanismus von CoFe₂ O₄ -QDs bei der Abtötung von NSCLC wurden in dieser Studie ebenfalls aufgeklärt. Wir haben bestätigt, dass CoFe₂ O₄ -QDs induzierten NSCLC-Apoptose hauptsächlich durch ROS-Sekretion nach NIR-Laser-aktivierten synergistischen PDT- und PTT-Effekten. Eine übermäßige ROS-Erzeugung verursacht oxidativen Stress von Tumorzellen und verursacht direkt DNA-Schäden, die wiederum nachgeschaltete Signalwege aktivieren und dann den Tod von Tumorzellen induzieren [46, 47]. Unter anderem hat zunehmende Evidenz gezeigt, dass der PI3K/AKT-Signalweg durch zelluläres ROS reguliert werden könnte und zu einer Dysfunktion der Mitochondrien führt [48, 49]. Es ist allgemein anerkannt, dass AKT bei Aktivierung von PI3K phosphoryliert wird und daher das pro-apoptotische Protein Bax inaktiviert und Zellen vor Apoptose schützt. Darüber hinaus ist phosphoryliertes AKT auch in der Lage, den MDM2/p53-Komplex zu stabilisieren, der das Zellüberleben reguliert [50]. In diesem Zusammenhang ist die Rolle eines solchen Stoffwechselwegs in CoFe₂ O₄ -QDs induzierte ROS-Sekretion wurde untersucht. Wie erwartet haben wir festgestellt, dass durch CoFe₂ . verursachte übermäßige ROS O₄ -QDs haben die Expression von PI3K/AKT-Signalwegen signifikant herunterreguliert und verursachen daher die Apoptose von Tumorzellen über die Aktivierung von Bax, aber die Inaktivierung des Bcl-2-Proteins. Dieses Ergebnis wurde durch die Zugabe eines ROS-Inhibitors weiter bestätigt, der die PI3K/AKT-Expression umkehrte und die Produktion von ROS verringerte. Da bekannt ist, dass der PI3K/AKT-Signalweg das Überleben und den Tod von Zellen reguliert, insbesondere in Krebszellen, ist das Verständnis solcher Mechanismen von CoFe₂ O₄ -QDs bei der Abtötung von NSCLC würden uns helfen, mehr Optionen für Kombinationstherapien zu entwickeln.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir erfolgreich CoFe₂ . konstruiert haben, um neuartige Photosensibilisatoren für eine alternative Tumorabtötungstherapie zu entwickeln O₄ -QDs unter Verwendung eines hydrothermalen Ansatzes auf kostengünstige und einfache Weise in dieser Studie. Das CoFe₂ O₄ -QDs haben eine breite NIR-Absorption, gute Biokompatibilität und photothermische Umwandlungsfähigkeit. Darüber hinaus ist im Vergleich zu früher berichteten QDs CoFe₂ O₄ -QDs zeigten einen synergistischen PTT/PDT-Effekt bei der Abtötung von NSCLC-Tumoren, was ein vielversprechendes multifunktionales Mittel in weiteren Phototherapien von NSCLC darstellt. Darüber hinaus wird bei der NIR-Bestrahlung CoFe₂ O₄ -QDs könnten NSCLC hauptsächlich abtöten, indem sie die ROS-Erzeugung durch die Regulierung der Bcl-2/Bax-Expression über den vorgeschalteten PI3K/AKT-Signalweg induzieren. Was die in-vivo-Tumorabtötungsfähigkeit betrifft, so ist CoFe₂ O₄ -QDs in Kombination mit NIR könnten die NSCLC-Tumor-Xenotransplantate ohne offensichtliche toxische Wirkungen vollständig eliminieren. Diese Ergebnisse beweisen, dass CoFe₂ O₄ -QDs besitzt vielversprechende Anwendungen, die als neuartiges NSCLC-Abtötungsreagenz entwickelt werden sollen.

Schlussfolgerung

Alles in allem CoFe₂ O₄ -QDs, die wir synthetisiert haben, könnten überlegene synergistische Effekte von PTT/PDT bei der Unterdrückung von NSCLC aufweisen, indem sie die ROS-Erzeugung durch die Regulierung des PI3K/AKT-Signalwegs induzieren, was Aufschluss über die Mechanismenforschung und Anwendungen von neuartigen Photosensibilisatoren gibt.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.