Funktionalisierte Folat-modifizierte Graphenoxid/PEI-siRNA-Nanokomplexe für die gezielte Gentherapie von Eierstockkrebs

Einführung

Eierstockkrebs ist die weltweit führende gynäkologische Todesursache und wird aufgrund der Schwierigkeiten einer frühen Diagnose und Therapie in der Regel mit schlechten klinischen Ergebnissen in Verbindung gebracht [1,2,3]. Leider weisen konventionelle Chemotherapeutika inhärente Einschränkungen auf, wie z. B. unspezifische Verteilung, schlechte Bioverfügbarkeit, schnelle Blutclearance und schlechte Löslichkeit in physiologischen Umgebungen [4]. In den letzten Jahrzehnten wurde die Gentherapie als potenzieller Ansatz zur Behandlung verschiedener genetischer Störungen, einschließlich Krebs, untersucht [5,6,7,8]. Das Fehlen eines sicheren, hocheffizienten und selektiven Trägers für die Genabgabe hat jedoch seinen Fortschritt zum klinischen Nutzen behindert. Derzeit gibt es zwei Kategorien von Genvektoren:virale und nicht-virale Vektoren. Obwohl virale Vektoren eine hohe Transfektionseffizienz gezeigt haben, schränken mehrere Nachteile ihre klinische Anwendung ein, beispielsweise schwere entzündliche Immunreaktionen und das Risiko einer Rekombination mit Wildtyp-Viren [9, 10]. Im Gegensatz dazu haben nicht-virale Vektoren eine umfangreiche Transportkapazität, geringe Immunogenität und strukturelle Flexibilität, was sie zu ausgezeichneten Alternativen zu viralen Vektoren macht [11,12,13]. Im Zuge der rasanten Entwicklung der Nanotechnologie wurden viele Nanopartikel im Hinblick auf eine potenzielle Verwendung als Träger für die Genübertragung untersucht [14, 15]. Hier hatte diese Arbeit einen neuartigen nicht-viralen Vektor PEG-GO-PEI-FA entworfen, der effizient an Tumorgewebe abgegeben werden kann.

Graphenoxid (GO) ist das Derivat von Graphit, das durch mehrstufige Oxidation, Ultraschall und Reinigung von Graphit hergestellt wird [16]. Die GO-Oberfläche enthält Epoxy-, Hydroxy- und Carboxylgruppen [17]. Die funktionellen Sauerstoffgruppen auf seiner Oberfläche verleihen GO eine ausgezeichnete Biokompatibilität, die es ihm ermöglicht, eine stabile Suspension in Wasser und organischen Lösungsmitteln zu bilden, was chemische Modifikationen und Funktionalisierungen erleichtert [18, 19]. Daher wird GO häufig für die photothermische Krebstherapie, die Wirkstoff- und Genabgabe sowie für Biosensoren eingesetzt [20,21,22]. Polyethylenglykol (PEG) ist ein sicheres, ungiftiges, biologisch abbaubares Material; es wurde von der US-amerikanischen Food and Drug Administration als hydrophiler Wirkstoffträger zugelassen [23]. Die GO-Funktionalisierung mit PEG kann die Stabilität unter physiologischen Bedingungen verbessern, die Zykluszeit von GO-Nanomaterialien im Körper verlängern und die Pharmakokinetik von GO-Nanomaterialien für ein besseres Tumor-Targeting verbessern [24, 25]. Polyethylenimin (PEI) hat sich aufgrund seiner hohen Transfektionseffizienz in verschiedenen Zelllinien zu einem Goldstandard für nicht-virale Vektoren entwickelt [26]. PEI zeigt jedoch schwere Zytotoxizität und schlechte Biokompatibilität, wodurch seine klinischen Anwendungen eingeschränkt werden. In dieser Studie beobachteten wir eine signifikante Abnahme der Zytotoxizität, wenn PEI auf die Oberfläche von GO gepfropft wurde. Der Folatrezeptor ist auf verschiedenen Krebszellenoberflächen überexprimiert, insbesondere in Eierstockkrebszellen sowohl vor als auch nach einer Chemotherapie [27]. Für einen gezielten Gentransport wurden Folsäuremoleküle kovalent an GO gebunden, um Folatrezeptoren zu zielen.

Insgesamt war das Hauptziel der vorliegenden Studie die Erforschung eines neuen zielgerichteten GO-basierten Gen-Delivery-Systems, um den Nutzen der siRNA-basierten Gentherapie bei Eierstockkrebs zu erhöhen. Das erhaltene positiv geladene PEG-GO-PEI-FA konnte mit siRNA für den Gentransport beladen werden. Seine erfolgreiche Synthese, Charakterisierung, effektive zelluläre Internalisierung und In-vitro-Antikrebswirkung wurden mit verschiedenen Techniken analysiert. Außerdem wurde die Sicherheit dieses Systems auch in vitro bewertet.

Materialien und Methoden

Materialien

Graphenoxid wurde von Suzhou Carbon Fung Graphene Technology Co. Ltd. (Suzhou, China) bezogen. Folsäure (FA), N -Hydroxysuccinimid (NHS) und Fluoresceinisothiocyanat (FITC) wurden von Sigma Aldrich Trading Co. Ltd. (Shanghai, China) bezogen. Verzweigtes PEI 25K, PEG (MG =2000), Agarose und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (EDC·HCL) wurden von Adama Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China) bezogen. Phosphat-gepufferte Lösung (PBS), Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) und alle anderen Chemikalien wurden von Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China) bezogen. Alle anderen Chemikalien waren von Reagenzqualität. RPMI-1640-Medium (Gibco), fötales Rinderserum (FBS) (Gibco), Trypsin (Gibco) und 20 × TAE-Puffer wurden von Thermo Fisher Scientific Co. Ltd. (China) bezogen. Das Zellzählkit 8 (CCK-8) wurde von Shanghai Yisheng Biological Co. Ltd. (Shanghai, China) bezogen. LysoTrackerRed, 4% Paraformaldehyd, 4'-6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) und Lipofectamine 2000-Transfektionsreagenzien wurden von Invitrogen Co. Ltd. (China) bezogen. Die Dil-Fluoreszenzsonde (Kat.-Nr.:C1036) wurde von Beyotime Co. Ltd. bezogen. Anti-PLK1 (PLK1-homo-581) kurze interferierende RNA (siRNA) wurde von Shanghai GenePharma Co. Ltd. (Shanghai, China) synthetisiert.

Vorbereitung von PEG-GO-PEI-FA

Die Synthese von PEG-GO-PEI-FA erfolgt nach der in Abbildung S2 (A) gezeigten Strategie. Zuerst wurde eine wässrige 10 ml GO-Suspension (1000 μg/ml) kontinuierlich 2 h lang bei 50 W im Bad beschallt. Dann wurden 1 µl EDC·HCL (5000 µg/ml) und NHC (5000 µg/ml) zugegeben und intermittierend 30 Minuten lang bei 100 W beschallt, gefolgt von der Zugabe von PEG (10 µg), 30 Minuten lang beschallt und auf einem Magnetrührer gerührt Rührer für 6 h bei 0°C. Um die nicht umgesetzten Reagenzien zu entfernen und GO-PEG-Lösung zu erhalten, wurde die Mischung 24 h in destilliertem Wasser mit einer Dialysemembran (MWCO, 3500 Da) dialysiert. Dann wurde die GO-PEG-Lösung 30 Minuten lang beschallt, 1 ml EDC·HCL (5000 μg/ml) und NHC (5000 μg/ml) wurden zugegeben und erneut 30 Minuten lang beschallt, gefolgt von der Zugabe von PEI 25K (5000 μg/ml). ) 2 ml. Die Mischung wurde 30 min beschallt und 6 h bei 0°C gerührt. Anschließend wurde zur Gewinnung des PEG-GO-PEI die Mischung erneut 24 h in destilliertem Wasser mit einer Dialysemembran (MWCO, 3500   Da) dialysiert. Die PEG-GO-PEI-Lösung wurde 60 Minuten lang beschallt, 1 ml EDC·HCL (5000 μg/ml) und NHC (5000 μg/ml) wurden zugegeben und erneut 30 Minuten lang beschallt, gefolgt von der Zugabe von 10 mg FA zur Lösung . Die Lösung wurde 30 min mit Ultraschall behandelt und 12 h bei 0°C gerührt und 48 h dialysiert, um PEG-GO-PEI-FA gemäß dem oben erwähnten Verfahren zu erhalten. Die Lösung der Nanokomplexe wurde mit einem Vakuumgefriertrockner (Biosafer-10D) getrocknet.

Charakterisierung

Das Oberflächenzetapotential und die durchschnittliche Partikelgröße der Nanokomplexe in wässriger Lösung wurden durch dynamische Lichtstreuung (DLS, Malvern Zetasizer Nano ZS, UK) gemessen. Die Morphologien der Nanokomplexe wurden mit einem Rasterkraftmikroskop in der Atmosphäre (AFM, MuLtimode Nanoscope IIIa, Deutschland) beobachtet. Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR)-Spektren wurden mit dem Thermo Nicolet 6700 FTIR-Spektrographen unter Verwendung des KBr-Pellets im Bereich von 400–4000 cm ⁻¹ . aufgenommen . Die UV-Vis-Absorptionsspektren der Nanokomplexe wurden mit einem UV-Vis-Spektrophotometer (UV, EV300, USA) gemessen. Das Raman der Nanokomplexe wurde mit einem dispersiven Raman-Mikroskop (Senterra R200-L, Deutschland) mit einer Anregungswellenlänge von 532 nm gemessen.

In-vitro-Biosicherheitsassay

Die SKOV3 (menschliche Eierstockkrebszellen) wurde von Keygen (China) bezogen. Die Zellen wurden in RPMI-1640-Medium gehalten, ergänzt mit 10 % FBS, 100 µE/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin, und bei 37 °C unter einer angefeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ . kultiviert . In dieser Studie wurde die Zytotoxizität von Materialien in SKOV3-Zellen durch den CCK-8-Assay analysiert. Kurz gesagt, die Zellen wurden in einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 6 × 10 ³ . ausgesät Zellen/Well in 100 µl 1640 Medium mit 10 % FBS und dann 12 Stunden bei 37 °C in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ . inkubiert . Dann wurden GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI und PEG-GO-PEI-FA in Endkonzentrationen im Bereich von 10 bis 1000 µg/ml zugegeben und mit den Zellen weitere 12 Stunden inkubiert. Ein anderer, GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI und PEG-GO-PEI-FA wurden mit unterschiedlichen Zeiten von 4 bis 24 h bei Konzentrationen von 100 &mgr;g/ml inkubiert. Anschließend wurden 10 µl CCK-8 in jede Vertiefung gegeben und weitere 3 Stunden bei 37 °C inkubiert. Danach wurde die Extinktion bei 450  nm auf einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen. Jedes Gruppenexperiment wurde dreimal wiederholt. Die relative Zelllebensfähigkeit (%) bezogen auf in Medien kultivierte Kontrollzellen wurde berechnet als (Absorption der Probe – Absorption des Leerwerts)/(Absorption der Kontrolle – Absorption des Leerwerts) × 100 %.

Agarose-Gel-Retardierungsassay

Die 20-fache TAE-Pufferlösung wurde mit DEPC-behandeltem Wasser verdünnt, um eine 1%ige Agaroselösung herzustellen. Dann wurde die Lösung 5 Minuten lang in einem Mikrowellenofen erhitzt, um die Agarose vollständig aufzulösen. Als die Temperatur der Agaroselösung auf 55 °C abfiel, wurde Ethidiumbromid (EB, 0,5 µg/ml)-Lösung im Volumenverhältnis von 10.000:1 zugegeben und gleichmäßig gemischt, anschließend die Agaroselösung durch Abkühlen, um ein Agarosegel zu bilden . Das PEG-GO-PEI-, PEG-GO-PEI-FA- und siRNA-Gemisch in unterschiedlichen Gewichtsverhältnissen wurde dem Loch zugesetzt. Das Gel wurde bei 110 V und 40 mA etwa 60 min laufen gelassen und dann mit einem Ultraviolett-Imager beobachtet und analysiert.

Zellaufnahmestudien von PEG-GO-PEI-FA

Um die Zellaufnahme zu untersuchen, wurden die Nanokomplexe mit FITC nach zuvor beschriebener Methode mit geringfügigen Modifikationen markiert [28]. Kurz gesagt wurde die Lösung von Nanokomplexen (ungefähr 1 µg/ml, 2,0 ml) mit 0,2 µl FITC (26 µM), gelöst in DMSO, gemischt und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierenden Mischungen wurden durch eine 5000 MWCO-Membran dialysiert, um unmarkiertes FITC zu entfernen, und dann lyophilisiert. Die Zellen wurden in einer 6-Well-Platte (die die Deckgläser enthielt) mit einer Dichte von 2 × 10 ⁵ . ausgesät Zellen/Vertiefung in 2 ml 1640 Medium, das 10 % FBS enthält, und dann bei 37 °C für 12 h in einem Zellkulturinkubator inkubiert. Dann wurde das Medium in jeder Vertiefung durch serumfreies 1640-Medium ersetzt. Anschließend wurden die Zellen mit verschiedenen Nanokomplexen/FITC behandelt. Zellen, die ohne die Nanokomplexe behandelt wurden, sind die Kontrollgruppe, und mit PEI 25 K behandelte Zellen sind die parallele Kontrollgruppe. Nach Inkubation für 4 h bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO₂ , die Flüssigkeit der Kulturplatte wurde entfernt, die Zellen wurden zweimal mit kaltem DPBS (pH =7,4) gewaschen, dann wurden 20 μL DAPI und 5 μL Dil (Zytomembranfarbstoff) in jede Vertiefung gegeben und 20 min bei 37 °C unter . inkubiert die Dunkelheit. Anschließend wurden DAPI und Dil des Kulturmediums entfernt und zweimal mit kaltem DPBS (pH =7,4) gewaschen, und die Deckgläser der Zellen wurden herausgenommen und auf einem Glasobjektträger mit Permount TM Eindeckmedium fixiert. Danach wurde das Fluoreszenzsignal der Zellträger mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) beobachtet und die Zellaufnahme von Nanokomplexen analysiert.

Endosomales Entweichen und Eindringen in den Zellkern

Um die zelluläre Verteilung, das endosomale Entweichen und das Eindringen von Nanokomplexen zu visualisieren, wurden SKOV3-Zellen in einer 12-Well-Platte (mit den Deckgläsern) mit einer Dichte von 1 × 10 ⁵ . ausgesät Zellen/Vertiefung in 2 ml 1640 Medium mit 10 % FBS und dann 12 h inkubiert (37 °C, 5 % CO₂ ). Dann wurde das Medium in jeder Vertiefung durch 1 µl/Vertiefung serumfreies 1640-Medium ersetzt. Anschließend wurden die verschiedenen mit FITC markierten Nanokomplexe (100 µg/mL) in 12-Well-Platten für 1 µmL/Well zugegeben. Nach 6 h wurde die Flüssigkeit entfernt, die Zellen wurden zweimal mit kaltem DPBS (pH =7,4) gewaschen und der 12-Well-Platte wurde LysoTracker Red (5 &mgr;g/ml) für 50 &mgr;l/Well hinzugefügt. Nach 15 min Inkubation bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO₂ , die Flüssigkeit der 12-Well-Platte wurde entfernt, die Zellen wurden zweimal mit kaltem DPBS (pH =7,4) gewaschen, dann wurden 20 µl DAPI in jede Vertiefung gegeben und für 20 Minuten bei 4 °C im Dunkeln inkubiert. Als nächstes wurde die DAPI-Flüssigkeit entfernt und zweimal mit kaltem DPBS (PH =7,4) gewaschen. Danach wurde mit 4% Paraformaldehyd 15 min bei Raumtemperatur fixiert, und die Deckgläser wurden herausgenommen und auf einem Glasobjektträger mit Permount TM Eindeckmedium fixiert. Das Fluoreszenzsignal der Objektträger wurde durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie beobachtet und das lysosomale Entweichen und Eindringen in den Kern von Nanokomplexen analysiert [29].

Zyto-Hemmungsanalyse

Wir analysierten die zellhemmende Wirkung von PEG-GO-PEI/siRNA und PEG-GO-PEI-FA/siRNA mit dem CCK-8-Assay. Kurz darauf wurden die Zellen in einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 6 × 10 ³ . ausgesät Zellen/Well in 100 µl 1640 Medium mit 10 % FBS und dann 12 Stunden bei 37 °C in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ . inkubiert . Dann wurden PEG-GO-PEI und PEG-GO-PEI-FA in Endkonzentrationen im Bereich von 10 bis 500 µg/ml zugegeben und weitere 12 und 24 Stunden mit den Zellen inkubiert. Dann wurden PEG-GO-PEI/siRNA und PEG-GO-PEI-FA/siRNA mit Zellen 4 bis 48 h bei einer Konzentration von 100 &mgr;g/ml inkubiert. Die siRNA wurde mit Lipofectamine 2000 transfiziert und als Kontrollgruppe unbehandelt. Anschließend wurden 10 µl CCK-8 in jede Vertiefung gegeben und weitere 3 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Extinktion wurde bei 450 nm gemessen. Jedes Gruppenexperiment wurde dreimal wiederholt. Die Hemmrate (%) wurde berechnet als 1 – (Extinktion der Probe – Extinktion des Leerwerts)/(Extinktion der Kontrolle – Extinktion des Leerwerts) × 100 %.

Statistik

Jeder Versuchstest wurde dreimal wiederholt und die Daten wurden unter Verwendung der Software SPSS 17.0 analysiert. Einweg-ANOVA-Test für Mehrgruppenanalyse und ungepaartes Student's t Test zur Zweigruppenanalyse wurden zum Vergleich verwendet. Die Daten wurden als Mittelwert und Standardabweichung (SD) ausgedrückt und die statistische Signifikanz wurde auf p . festgelegt <0.05.

Ergebnisse und Diskussion

Synthese von PEG-GO-PEI-FA

Die Expression von FR wurde zunächst in verschiedenen Krebszelllinien basierend auf der Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE; http://portals.broadinstitute.org/ccle)-Datenbank [30] und verschiedenen Ovarialgeweben basierend auf dem Gene Expression Profiling Interactive . analysiert Analysedatenbank (GEPIA2; http://gepia2.cancer-pku.cn) [31]. Die Ergebnisse stimmten mit früheren Untersuchungen überein (Abbildung S1). Daher haben wir FA als Targeting-Ligand für den Gentransport gewählt.

Graphenoxid trägt sicherlich viele sauerstoffhaltige Gruppen, einschließlich Carboxylgruppen am Rand, Hydroxylgruppen und Epoxygruppen an der Basalebene, die durch den Oxidationsprozess erzeugt werden [32]. Um nanoskaliges GO (NGO) zu erhalten, wurde GO durch Beschallung im Bad bei 50 W für 2 h kontinuierlich gecrackt und anschließend kovalent PEG/PEI/FA an GO mittels EDC/NHS-Chemie verknüpft, wie in Abbildung S2(A) dargestellt. Abbildung S2(B) zeigt den Behandlungsweg der PEG-GO-PEI-FA/siRNA. Die Analyse der chemischen Konjugation wurde mit der FTIR-Differentialspektrentechnologie durchgeführt, um die spektralen Absorptionspeaks zu erhalten [33]. Wie in Abb. 1a gezeigt, ist die Existenz von OH (3425 cm ⁻¹ ), C=O (1719 cm ⁻¹ ) und C=H (1350 cm ⁻¹ ) wurden funktionelle Gruppen in GO gefunden und deuteten auf die Existenz von Hydroxyl und Carboxyl in der Oberfläche von GO hin. CH (2885 cm ⁻¹ ) konnte eine Streckschwingungsbande gefunden werden, wenn das PEG mit GO über stabile kovalente Bindungen reagierte; dies zeigte an, dass PEG auf GO gepfropft worden war und die PEG-Konjugationseffizienz etwa 6% betrug. Nachdem PEI und FA mit GO reagiert hatten, wurde das NH (1590 cm ⁻¹ ), C–N (1420 cm ⁻¹ ) wurde eine Streckschwingungsbande beobachtet, was darauf hindeutet, dass PEI und FA durch Veresterung auf GO gepfropft wurden. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Konjugation PEG-GO-PEI-FA erfolgreich synthetisiert wurde.

Die erfolgreiche synthetische Analyse von PEG-GO-PEI-FA mit Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) und UV-Vis-Spektrophotometer. a Die FTIR-Spektren von GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI und PEG-GO-PEI-FA. b Die UV-Vis-Absorptionsspektren von GO, FA, GO-PEG, PEG-GO-PEI und PEG-GO-PEI-FA

Abbildung 1b zeigt die UV-Vis-Absorptionsspektren von GO, FA, GO-PEG, PEG-GO-PEI und PEG-GO-PEI-FA. Das GO hatte einen Absorptionspeak von 223 nm. Der FA hatte einen Absorptionspeak von 275 nm. Das GO-PEG zeigte eine glatte Kurve, was darauf hindeutet, dass PEG mit GO konjugiert war und den Berg von GO glatter machte. Das PEG-GO-PEI hatte einen Absorptionspeak bei 219 nm, was veranschaulicht, dass PEI auf die Oberfläche von GO-PEG aufgepfropft war. Das PEG-GO-PEI-FA hatte einen Absorptionspeak bei 219 nm und 275 nm, was zeigt, dass FA auf das PEG-GO-PEI gepfropft war. Alle diese Ergebnisse zeigten weiter die erfolgreiche Synthese von PEG-GO-PEI-FA.

Charakterisierung von PEG-GO-PEI-FA

Die in Tabelle 1 angegebenen Daten zeigten die Partikelgröße und das Zetapotential der Nanokomplexe. Die Partikelgröße der Nanokomplexe stieg allmählich auf 218,4 nm an, während PEG, PEI und FA nach und nach auf die Oberfläche von GO gepfropft wurden. Das Zeta-Potential änderte sich von − 16,5 auf + 17,5 mv, wenn PEI mit GO verbunden war, was die Fähigkeit zur Adsorption von negativ geladener DNA oder RNA über elektrostatische Wechselwirkung und zelluläre Aufnahme erleichterte. Die Zetapotentiale von PEG-GO-PEI-FA und PEG-GO-PEI-FA/siRNA betrugen + 14,7 mv bzw. + 14,5 mv. Die Zetapotentiale zeigten, dass PEG-GO-PEI-FA oder PEG-GO-PEI-FA/siRNA aufgrund der negativen Ladung von FA und siRNA kleiner als PEG-GO-PEI waren. Diese deuteten darauf hin, dass PEG-GO-PEI-FA/siRNA durch die Ladungswechselwirkung an die Oberfläche von Zellen adsorbiert und von der rezeptorvermittelten Endozytose auf der Zytomembran genutzt werden könnte [34].

Die Oberflächenmorphologie und Partikelgröße des Nanocarriers wurden ebenfalls mit AFM und DLS gemessen. Wie in Abb. 2a gezeigt, zeigte das GO eine glatte Oberfläche und Blattstruktur mit einer Partikelgröße von 192,1 nm. Nach dem Pfropfen von PEG, PEI und FA auf die Oberfläche von GO erhöhte sich die Partikelgröße von PEG-GO-PEI-FA auf 216,1 nm, und auf der Oberfläche von PEG-GO-PEI-FA wurden viele Vorsprünge beobachtet (Abb. 2b .). ), was darauf hindeutet, dass eine große Anzahl von Dekorationen auf den GO-Blättern immobilisiert wurde. Gleichzeitig war die Höhe von PEG-GO-PEI-FA höher als GO, was hauptsächlich auf die Anbringung von PEG, PEI und FA auf beiden Ebenen des GO-Blattes zurückzuführen ist.

Die Charakterisierung des nanoskaligen Abgabesystems. Zur Charakterisierung von Morphologie und Größenverteilungen wurden Rasterkraftmikroskopie (AFM) und dynamische Lichtstreuung (DLS) verwendet:a GO und b PEG-GO-PEI-FA. Raman-Spektren zur Analyse der erzeugten Graphenoxidoberfläche von GO, GO-PEG und PEG-GO-PEI c

Die Raman-Spektroskopie ist eine der am häufigsten verwendeten, um die Charakterisierung und die strukturellen Eigenschaften von Nanokohlenstoffmaterialien zu messen [35]. Wie in Abb. 2c gezeigt, zeigte das Raman-Spektrum von GO das Schwingungsband bei 1600 cm ⁻¹ (G-Band) und 1354 cm ⁻¹ (D-Band) und das Flächenverhältnis von ID/IG betrug 1,0385, was anzeigt, dass der Teil SP ² Die Hybridisierung von GO war aufgebrochen und bildete Hydroxyl und Carboxyl. GO-PEG und PEG-GO-PEI zeigten das Vibrationsband bei 1595 cm ⁻¹ (G-Band) und 1352 cm ⁻¹ (D-Band) und das Flächenverhältnis von ID/IG betrugen 0,7737 und 0,5238. Das Flächenverhältnis von ID/IG verringerte sich nach der PEG- und PEI-Reaktion mit dem GO allmählich; dies deutete darauf hin, dass PEG und PEI auf die Oberfläche des GO gepfropft waren.

In-vitro-Biosicherheitsanalyse der verschiedenen funktionalen NGO

Das Problem der Biosicherheit nicht-viraler Genvektoren ist nach wie vor eine bedeutende Herausforderung für klinische Anwendungen. Die hohen positiven Ladungen bewirkten nicht nur eine ausgezeichnete Fähigkeit, Gene zu kondensieren und zu schützen, sondern führten auch zu einer starken Zytotoxizität [36, 37]. Um die Zytotoxizität freier siRNA-Nanokomplexe zu testen, wurde ein CCK-8-Assay mit SKOV3-Zellen durchgeführt, die 4, 8, 12 und 24 h mit freien Nanokomplexen in verschiedenen Konzentrationen (von 10 bis 1000 &mgr;g/ml) inkubiert worden waren. Wie in Abbildung S3 gezeigt, wiesen die Nanokomplexe bei Eierstockkrebs bei 1000 µg/ml und 24 Stunden immer noch eine hohe Zellviabilität auf. Die Zytotoxizität aller Nanokomplexe war zeit- und konzentrationsabhängig (Lebensfähigkeit von SKOV3-Zellen:größer oder gleich 84,38 % für alle Nanokomplexe in 1000 µg/ml und größer oder gleich 94,21% für alle Nanokomplexe bei 24 µg/mL). mit SKOV3-Zellen). Diese Ergebnisse legten nahe, dass die Nanokomplexe eine vernachlässigbare Zytotoxizität zeigten und als biokompatibler Genvektor dienen könnten.

Die Analyse von Nanokomplexen in Kombination mit siRNA

Die zelluläre Aufnahme freier RNA-Moleküle ist aufgrund der erheblichen negativen Ladungen, die sie tragen, normalerweise schwierig [38]. Die Beladung der negativ geladenen Biomoleküle durch kationische Polymere wird häufig zur Lösung des Problems eingesetzt [39]. In diesem Papier wurde das Laden von siRNA auf den PEG-GO-PEI-FA-Vektor durch Mischen von siRNA und PEG-GO-PEI-FA in wässriger Lösung erreicht. Wie in Tabelle 1 gezeigt, betrug das Zetapotential von PEG-GO-PEI-FA + 14,7 mV, was anzeigt, dass siRNA durch elektrostatische Wechselwirkung an die Oberfläche von PEG-GO-PEI-FA adsorbiert werden kann. In dieser Studie wurde die Genkondensationsfähigkeit der Nanokomplexe durch Agarosegelelektrophorese bewertet [40]. 3a zeigte, dass PEG-GO-PEI bei einem Gewichtsverhältnis von 10 eine offensichtliche Kondensationsfähigkeit gegenüber siRNA aufwies, während die vollständige Verzögerung der siRNA-Migration von PEG-GO-PEI-FA beobachtet wurde, wenn das Gewichtsverhältnis 20 erreichte ( 3b ). PEG-GO-PEI-FA könnte also siRNA vor Abbau schützen, benötigt aber gleichzeitig etwas mehr Nanokomplex, um eine gute Bindungsfähigkeit zu zeigen. Dies könnte mit den nicht so hohen Zetapotentialen von PEG-GO-PEI-FA zusammenhängen. Diese Ergebnisse zeigten, dass PEG-GO-PEI und PEG-GO-PEI-FA über eine ausreichende Transportfähigkeit verfügten, insbesondere PEG-GO-PEI-FA, das sein Potenzial als valider Vektor für den effizienten und sicheren Transport von Genen weiter unter Beweis stellte.

Die siRNA-Ladefähigkeit bei verschiedenen Gewichtsverhältnissen. Es wurde ein Agarosegel-Retardationsassay durchgeführt, um die Interaktion zwischen siRNA und Nanocarrier zu bewerten. a PEG-GO-PEI und b PEG-GO-PEI-FA in den verschiedenen Gewichtsverhältnissen (Materialien/siRNA)

Zelluläre Aufnahmeanalyse

Es ist so entscheidend, ob die Träger gezielt auf Tumore für die Genübertragung abzielen können. Um zu bestätigen, ob der PEG-GO-PEI-FA-Träger leicht in Zellen eindringen kann, verwendeten wir FITC als fluoreszierende Sonde für die intrazelluläre Bildgebung. Gleichzeitig wurden die Kerne mit DAPI und die Cytomembran mit Dil gefärbt. Wie in 4 gezeigt, zeigten die Kontrollgruppe und die PEG-GO-PEI-Gruppe keine grünen Fluoreszenzsignale um die Kerne und die Zytomembran herum. Dies implizierte, dass PEG-GO-PEI nicht in die Zellen eindrang. PEI 25K und PEG-GO-PEI-FA/siRNA erschienen als grünes Fluoreszenzsignal um den Kern herum, was eindeutig zeigte, dass PEG-GO-PEI-FA Zellmembranen durchdringen und in Zellen eindringen kann. Die PEG-GO-PEI-FA-Nanokomplexe zeigten die aktivste zelluläre Aufnahme, was möglicherweise darauf zurückzuführen ist, dass die FA FR spezifisch binden kann, die in der Oberfläche von SKOV3-Zellen überexprimiert wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass FA eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung der effizienten zellulären Aufnahme von PEG-GO-PEI-FA- und PEG-GO-PEI-FA/siRNA-Nanokomplexen spielt. Noch wichtiger ist, dass die Fähigkeit von FA, seinen Rezeptor zu binden, durch die kovalente Amidbindung nicht beeinflusst wurde und die rezeptorvermittelte Endozytose ungehindert war.

Zelluläre Aufnahme verschiedener Nanokomplexe. Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM)-Bilder der zellulären Aufnahme von FITC-markierten verschiedenen Nanokomplexen in humanen Ovarialkarzinom-SKOV3-Zellen nach Inkubation für 4 Stunden. Blau, Kerne (DAPI-markiert); rot, Zytomembran (Dil-markiert); grün, Nanokomplexe (FITC-markiert). Maßstabsbalken stellen 100 μm dar, aber der Maßstabsbalken beträgt 10 μm in einer einzelnen Zelle

Analyse der lysosomalen Flucht

Für das siRNA-Abgabesystem sollten sie aus dem Endosom oder gebildeten Lysosom entweichen. Wenn nicht, wird die siRNA jedoch abgebaut oder aus der Zelle abgeleitet [41,42,43]. Wir bewerten die endosomale Fluchtfähigkeit durch intrazelluläre Lokalisierung der Nanokomplexe mit CLSM. Da viele Berichte gezeigt haben, dass PEI 25K das endosomale oder lysosomale Entweichen durch den „Protonenschwammeffekt“ begünstigen kann [44], wurde PEI 25K als Kontrolle verwendet. In dieser Studie wurden die Nanokomplexe mit FITC markiert. Zuerst schätzten wir, dass die Nanokomplexe in das Lysosom eintreten, indem das gelbe Signal das grüne Fluoreszenzsignal von FITC mit dem roten Fluoreszenzsignal von Lyto Tracker Red überlagert. Der PEI 25K erschien als gelbes Signal nach 4-stündiger Inkubation mit Zellen und andere Materialien erschienen als gelbes Signal nach 2-stündiger Inkubation mit Zellen, was darauf hindeutet, dass die Materialien in die Zellen eingedrungen waren (Fig. 5). Unabhängig davon, ob die Nanokomplexe durch das helle Cyansignal aus dem Lysosom entkommen oder nicht, kombiniert sich das grüne Fluoreszenzsignal von FITC mit dem blauen Fluoreszenzsignal von DAPI. Wie in Fig. 5a gezeigt, wurde das grüne Signal bei der Akkumulation in den Kernen beobachtet, und es gab ein helles Cyan-Signal nach 8 h Inkubation von PEI/siRNA mit Zellen, was darauf hinweist, dass PEI/siRNA aus dem Lysosom entwichen war. PEG-GO-PEI-FA und PEG-GO-PEI-FA/siRNA hatten jedoch bereits nach 2 h ein schwaches grünes Signal, um die Kerne zu durchdringen, und ein grüneres Signal akkumulierte sich in den Kernen mit zunehmender Inkubationszeit. Und es gab ein helles Cyan-Signal, wenn PEG-GO-PEI-FA und PEG-GO-PEI-FA/siRNA 4 h lang mit Zellen inkubiert wurden (Fig. 5b, c). Diese zeigten, dass die Materialien so früh aus dem Lysosom entwichen waren. Kurz gesagt, diese Ergebnisse zeigten, dass PEG-GO-PEI-FA und PEG-GO-PEI-FA/siRNA eine ausgezeichnete Fähigkeit zur endosomalen oder lysosomalen Flucht beibehalten und die lysosomale Flucht und Gentransfektion in vitro effizient erleichtern können.

Zelluläre Internalisierung und lysosomales Entweichen von PEG-GO-PEI-FA, beobachtet durch CLSM. SKOV3-Eierstockkrebszellen, inkubiert mit a PEI, b PEG-GO-PEI-FA und c PEG-GO-PEI-FA für 0,5, 1, 2, 4 und 8 h. Diejenigen in Blau waren mit DAPI gefärbte Kerne, Grün waren mit FITC markierte Nanokomplexe und diejenigen in Rot repräsentierten Endosomen und Lysosomen-Fluoreszenz nach Färbung mit LysoTracker Rot. Maßstabsbalken stellen 100 μm dar, aber der Maßstabsbalken beträgt 10 μm in einer einzelnen Zelle

Zellinhibitorische Bewertung der PEG-GO-PEI-FA/siRNA

Im vorliegenden Fall wurde die therapeutische Wirkung von PEG-GO-PEI-FA/siRNA mittels CCK-8-Assay an SKOV3-Zellen in vitro untersucht. Wie in Abb. 6a gezeigt, fanden wir keinen signifikanten Einfluss auf die Überlebensrate von Tumorzellen bei unterschiedlichen Konzentrationen (10–100 µg/mL) und unterschiedlichen Zeitpunkten (12 und 24 Stunden) in der PEG-GO-PEI- FA-Gruppe. Obwohl die Konzentration über 100 µg/ml lag, lag die Überlebensrate der Tumorzellen immer noch bei über 80 %. Daher wählten wir 100 µg/ml für die nächste zelluläre Hemmstudie. Eine schwächere Zytotoxizität zeigte sich in der PEG-GO-PEI/siRNA- und Lipo2000/siRNA-Gruppe (Hemmungsrate von weniger als 20 %). Im Vergleich zu PEG-GO-PEI/siRNA und Lipo2000/siRNA hatte PEG-GO-PEI-FA/siRNA eine signifikante Hemmwirkung auf das Wachstum von SKOV3-Tumorzellen. PEG-GO-PEI-FA/siRNA inhibierte SKOV3-Zellen zeitabhängig (Abb. 6b). Diese Ergebnisse zeigten, dass PEG-GO-PEI-FA/siRNA die beste Hemmwirkung für das Wachstum von Tumorzellen hatte und wir PEG-GO-PEI-FA als idealen Nanoträger für die Genübertragung verwenden konnten.

In vitro cytotoxicity of PEG-GO-PEI-FA/siRNA in ovarian cancer SKOV3 cells via CCK-8 assay. a SKOV3 cells were treated with PEG-GO-PEI and PEG-GO-PEI-FA at different concentrations (10–500 μg/mL) at 12 and 24 h to get the optimal dose of nanocarrier. b The cytotoxicity of PEG-GO-PEI-FA/siRNA, PEG-GO-PEI/siRNA, and Lipo2000/siRNA were measured in different time points (4–48 h) at 100 μg/mL. Error bars represent ± SD; *p <0.05 (Student’s t test)

Conclusions

In this study, we successfully synthesized a novel gene delivery system, PEG-GO-PEI-FA. The not cytotoxic by itself and excellent biological compatibility of PEG-GO-PEI-FA guaranteed its prospects as a safe and effective gene delivery vector. PEG-GO-PEI-FA/siRNA nanocomplexes exhibited outstanding physicochemical properties for gene targeting delivery. Moreover, PEG-GO-PEI-FA/siRNA could readily enter SKOV3 ovarian cancer cells and escape from the lysosomes. Cytotoxicity assay demonstrated that PEG-GO-PEI-FA/siRNA had a good inhibition effect on ovarian cancer cells in a time-dependent manner, and it exhibited a higher cytotoxicity effect compared to other groups. On the basis of aforementioned results, PEG-GO-PEI-FA may provide good anticipation as a gene vector for targeted gene delivery and more effective strategy in ovarian carcinoma treatments.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten.

Abkürzungen

AFM:

Rasterkraftmikroskop

CCK-8:

Cell counting kit8

CCLE:

Cancer cell line encyclopedia

CLSM:

Confocal laser scanning microscope

DAPI:

4′-6-Diamidino-2-phenylindole

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

DMSO:

Dimethylsulfoxid

DPBS:

Dulbecco’s phosphate-buffered saline

EB:

Ethidium bromide

EDC∙HCL:

1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyl carbodiimide hydrochloride

FA:

Folsäure

FBS:

Fötales Rinderserum

FITC:

Fluoresceinisothiocyanat

FITR:

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie

FR:

Folate receptor

GEPIA:

Gene expression profiling interactive analysis

GO:

Graphenoxid

MWCO:

Molecular weight cutoff

NGO:

Nanoscale graphene oxide

NHS:

N -hydroxysuccinimide

NPs:

Nanopartikel

PBS:

Phosphate-buffered solution

PDI:

Polydispersitätsindex

PEG:

Polyethylenglykol

PEI:

Polyethyleneimine

siRNA:

Small interfering RNA