Gezielte siRNA-Wirkstoffgabe bei Eierstockkrebs mittels Folsäure-funktionalisierten Graphenoxid/PEI-Nanokomplexen

Zusammenfassung

Gentherapie etabliert sich als valide Methode zur Behandlung von Eierstockkrebs, einschließlich kleiner interferierender RNA (siRNA). Trotz ihrer Potenz behindern wenige gezielte, effiziente Gentransfersysteme die Entwicklung der Gentherapie. In dieser Studie synthetisierten wir einen neuartigen Genvektor PEG-GO-PEI-FA durch Funktionalisierung von Graphenoxid (GO), wobei Folsäure (FA) spezifisch an den Folsäurerezeptor (FR) bindet, der in Eierstockkrebs überexprimiert ist. Die Charakterisierung der Nanokomplexe wurde durch dynamische Lichtstreuung (DLS), Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) bewertet. Die siRNA-Kondensationsfähigkeit und Stabilität wurden durch Agarose-Gelelektrophorese geprüft. Zelluläre Aufnahmeneffizienz und lysosomale Fluchfähigkeit in Eierstockkrebszellen wurden durch konfokale Laserscanning-Mikroskopie untersucht. Zelluläre Bioverträglichkeit des Systems und Hemmung der siRNA-Verträglichkeit wurden mittels CCK-8-Test evaluiert. Die Größe der PEG-GO-PEI-FA-Nanokomplexe betrug 216,1 ± 2,457 nm und zeigte milde Zytotoxizität in Eierstockkrebszellen. Mit hoher Aufnahmeneffizienz kann PEG-GO-PEI-FA rasch aus dem Lysosom entweichen und das Gen freisetzen. Zudem kann PEG-GO-PEI-FA/siRNA das Wachstum von Eierstockkrebszellen effektiv hemmen. Insgesamt bietet PEG-GO-PEI-FA/siRNA eine vielversprechende Strategie für die siRNA-Wirkstoffgabe bei FR-positivem Ovarialkarzinom oder ähnlichen Tumoren.

Einleitung

Eierstockkrebs ist die häufigste gynäkologische Todesursache weltweit und meist mit schlechten klinischen Ergebnissen verbunden, bedingt durch Schwierigkeiten bei Früherkennung und Therapie [1–3]. Herkömmliche Chemotherapeutika weisen inhärente Limitationen auf wie unspezifische Verteilung, schlechte Bioverfügbarkeit, rasche Blutclearance und geringe Löslichkeit in physiologischen Umgebungen [4]. In den letzten Jahrzehnten wurde Gentherapie als potenzieller Ansatz zur Behandlung verschiedener genetischer Erkrankungen, einschließlich Krebs, erforscht [5–8]. Doch das Fehlen eines sicheren, hocheffizienten und selektiven Gentransfervektors hinderte den klinischen Fortschritt. Derzeit gibt es zwei Kategorien von Genvektoren: virale und nicht-virale. Obwohl virale Vektoren hohe Transfektionseffizienz zeigen, begrenzen Nachteile wie schwere immunentzündliche Reaktionen und Rekombinationsrisiko mit Wildtyp-Viren ihre klinische Anwendung [9, 10]. Im Gegensatz dazu bieten nicht-virale Vektoren umfangreiche Transportkapazität, geringe Immunogenität und strukturelle Flexibilität, was sie zu hervorragenden Alternativen macht [11–13]. Mit der rasanten Entwicklung der Nanotechnologie wurden viele Nanopartikel als potenzielle Gentransferträger untersucht [14, 15]. Hier entwarfen wir einen neuartigen nicht-viralen Vektor PEG-GO-PEI-FA, der effizient in Tumorengewebe geliefert werden kann.

Graphenoxid (GO) ist ein Derivat von Graphit, das durch mehrstufige Oxidation, Ultraschallbehandlung und Reinigung hergestellt wird [16]. Die GO-Oberfläche enthält Epoxy-, Hydroxyl- und Carboxylgruppen [17]. Die sauerstoffhaltigen Funktionsgruppen verleihen GO ausgezeichnete Biokompatibilität, ermöglichen stabile Suspensionen in Wasser und organischen Lösungsmitteln und erleichtern chemische Modifikationen und Funktionalisierungen [18, 19]. Daher wird GO breit für photothermale Krebstherapie, Wirkstoff- und Gentransport sowie Biosensoren eingesetzt [20–22]. Polyethylenglykol (PEG) ist ein sicheres, ungiftiges, biologisch abbaubares Material, das von der US-FDA als hydrophiler Wirkstoffträger zugelassen wurde [23]. Die GO-Funktionalisierung mit PEG verbessert die Stabilität unter physiologischen Bedingungen, verlängert die Zirkulationszeit von GO-Nanomaterialien im Körper und optimiert die Pharmakokinetik für bessere Tumortargeting [24, 25]. Polyethylenimin (PEI) gilt als Goldstandard nicht-viraler Vektoren aufgrund hoher Transfektionseffizienz in verschiedenen Zelllinien [26]. Allerdings zeigt PEI schwere Zytotoxizität und schlechte Biokompatibilität, was klinische Anwendungen limitiert. In dieser Studie beobachteten wir einen signifikanten Zytotoxizitätsrückgang, als PEI auf die GO-Oberfläche graftet wurde. Der Folsäurerezeptor ist auf verschiedenen Krebszellen überexprimiert, besonders in Eierstockkrebszellen vor und nach Chemotherapie [27]. Für gezielte Gentransfer wurden Folsäuremoleküle kovalent an GO gebunden, um Folsäurerezeptoren anzusteuern.

Insgesamt zielte die vorliegende Studie darauf ab, ein neues GO-basiertes gezieltes Gentransfersystem zu erforschen, um den Nutzen der siRNA-basierten Gentherapie bei Eierstockkrebs zu steigern. Das erhaltene positiv geladene PEG-GO-PEI-FA konnte mit siRNA beladen werden. Seine erfolgreiche Synthese, Charakterisierung, effektive zelluläre Internalisierung und in-vitro-Antikrebswirkung wurden mit verschiedenen Techniken analysiert. Zudem wurde die Sicherheit dieses Systems in vitro evaluiert.

Materialien und Methoden

Materialien

Graphenoxid wurde von Suzhou Carbon Fung Graphene Technology Co. Ltd. (Suzhou, China) bezogen. Folsäure (FA), N-Hydroxysuccinimid (NHS) und Fluoresceinisothiocyanat (FITC) wurden von Sigma Aldrich Trading Co. Ltd. (Shanghai, China) gekauft. Verzweigtes PEI 25K, PEG (MW = 2000), Agarose und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC·HCl) stammten von Adama Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China). Phosphatgepufferte Lösung (PBS), Dulbecco's PBS (DPBS) und alle anderen Chemikalien wurden von Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China) bezogen. Alle Chemikalien waren Reagenzienqualität. RPMI-1640 Medium (Gibco), fetales Rinderserum (FBS) (Gibco), Trypsin (Gibco) und 20× TAE-Puffer wurden von Thermo Fisher Scientific Co. Ltd. (China) gekauft. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) stammte von Shanghai Yisheng Biological Co. Ltd. (Shanghai, China). LysoTracker Red, 4% Paraformaldehyd, 4'-6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) und Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenzien wurden von Invitrogen Co. Ltd. (China) bezogen. Dil-Fluoreszenzsonde (Kat.-Nr.: C1036) von Beyotime Co. Ltd. Anti-PLK1 (PLK1-homo-581) siRNA wurde von Shanghai GenePharma Co. Ltd. (Shanghai, China) synthetisiert.

Herstellung von PEG-GO-PEI-FA

Die Synthese von PEG-GO-PEI-FA erfolgte gemäß der in Abb. S2(A) dargestellten Strategie. Zunächst wurde 10 ml GO-wässrige Suspension (1000 µg/ml) 2 Stunden lang bei 50 W im Ultraschallbad sonifiziert. Anschließend wurden 1 ml EDC·HCl (5000 µg/ml) und NHS (5000 µg/ml) zugegeben und 30 Minuten bei 100 W intermittierend sonifiziert, gefolgt von Zugabe von PEG (10 mg), 30 Minuten Sonifizierung und 6 Stunden Rühren auf einem Magnetrührer bei 0 °C. Zur Entfernung unbehandelter Reagenzien und Erhalt der GO-PEG-Lösung wurde das Gemisch 24 Stunden in destilliertem Wasser mit einer Dialysemembran (MWCO 3500 Da) dialysiert. Die GO-PEG-Lösung wurde 30 Minuten sonifiziert, erneut 1 ml EDC·HCl (5000 µg/ml) und NHS (5000 µg/ml) zugegeben und 30 Minuten sonifiziert, gefolgt von Zugabe von 2 ml PEI 25K (5000 µg/ml). Das Gemisch wurde 30 Minuten sonifiziert und 6 Stunden bei 0 °C gerührt. Anschließend wurde zur Erlangung von PEG-GO-PEI erneut 24 Stunden in destilliertem Wasser mit Dialysemembran (MWCO 3500 Da) dialysiert. Die PEG-GO-PEI-Lösung wurde 60 Minuten sonifiziert, 1 ml EDC·HCl (5000 µg/ml) und NHS (5000 µg/ml) zugegeben und 30 Minuten sonifiziert, gefolgt von Zugabe von 10 mg FA. Die Lösung wurde 30 Minuten sonifiziert, 12 Stunden bei 0 °C gerührt und 48 Stunden dialysiert, um PEG-GO-PEI-FA gemäß dem oben genannten Verfahren zu erhalten. Die Nanokomplexlösung wurde im Vakuumgefriertrockner (Biosafer-10D) getrocknet.

Charakterisierung

Oberflächen-Zetapotential und durchschnittliche Partikelgröße der Nanokomplexe in wässriger Lösung wurden durch dynamische Lichtstreuung (DLS, Malvern Zetasizer Nano ZS, UK) gemessen. Die Morphologie der Nanokomplexe wurde mit einem Rasterkraftmikroskop in Atmosphäre (AFM, MultiMode Nanoscope IIIa, Deutschland) beobachtet. Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) Spektren wurden mit einem Thermo Nicolet 6700 FTIR-Spektrographen im KBr-Pellet im Bereich 400–4000 cm⁻¹ aufgenommen. UV-Vis-Absorptionsspektren der Nanokomplexe wurden mit einem UV-Vis-Spektrophotometer (UV, EV300, USA) gemessen. Raman-Spektren der Nanokomplexe wurden mit einem dispersiven Raman-Mikroskop (Senterra R200-L, Deutschland) bei Anregungswellenlänge 532 nm erfasst.

In-vitro-Bioverträglichkeitsassay

SKOV3-Zellen (humane Eierstockkrebszellen) wurden von Keygen (China) bezogen. Zellen wurden in RPMI-1640-Medium mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin bei 37 °C unter feuchter Atmosphäre mit 5% CO₂ kultiviert. In dieser Studie wurde die Zytotoxizität der Materialien in SKOV3-Zellen mittels CCK-8-Test analysiert. Kurz gesagt, Zellen wurden in 96-Well-Platten bei einer Dichte von 6 × 10³ Zellen/Well in 100 µl 1640-Medium mit 10% FBS ausgesät und 12 Stunden bei 37 °C in feuchter Atmosphäre mit 5% CO₂ inkubiert. Dann wurden GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI und PEG-GO-PEI-FA in Endkonzentrationen von 10 bis 1000 µg/ml zugegeben und weitere 12 Stunden inkubiert. In einem weiteren Versuch wurden GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI und PEG-GO-PEI-FA bei 100 µg/ml für 4 bis 24 Stunden inkubiert. Anschließend wurden 10 µl CCK-8 zu jedem Well gegeben und 3 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Absorption bei 450 nm wurde mit einem Mikroplattenleser gemessen. Jedes Experiment wurde dreimal wiederholt. Die relative Zellviabilität (%) im Verhältnis zu Kontrollzellen in Medium wurde berechnet als (Absorption Probe – Absorption Blank) / (Absorption Kontrolle – Absorption Blank) × 100%.

Agarose-Gel-Retardationsassay

Die 20× TAE-Pufferlösung wurde mit DEPC-behandeltem Wasser verdünnt, um 1% Agarose-Lösung herzustellen. Diese wurde 5 Minuten in der Mikrowelle erhitzt, um die Agarose vollständig aufzulösen. Bei Abkühlung auf 55 °C wurde Ethidiumbromid (EB, 0,5 µg/ml) im Volumenverhältnis 10.000:1 zugegeben und gleichmäßig gemischt; anschließend wurde die Agarose-Lösung durch Abkühlung zum Gelieren gebracht. Die PEG-GO-PEI, PEG-GO-PEI-FA und siRNA-Gemische bei unterschiedlichen Gewichtsverhältnissen wurden in die Taschen gegeben. Der Gel wurde bei 110 V und 40 mA ca. 60 Minuten laufen gelassen und anschließend mit einem UV-Imager beobachtet und analysiert.

Zellaufnahmestudien von PEG-GO-PEI-FA

Zur Untersuchung der Zellaufnahme wurden die Nanokomplexe mit FITC nach einer zuvor beschriebenen Methode mit leichter Modifikation markiert [28]. Kurz gesagt, die Nanokomplexlösung (ca. 1 mg/ml, 2,0 ml) wurde mit 0,2 ml FITC (26 mM) in DMSO gelöst und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierenden Gemische wurden durch 5000 MWCO-Membran dialysiert, um unmarkiertes FITC zu entfernen, und anschließend lyophilisiert. Zellen wurden in 6-Well-Platten (mit Deckgläsern) bei einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen/Well in 2 ml 1640-Medium mit 10% FBS ausgesät und 12 Stunden bei 37 °C in einem Zellkulturinkubator inkubiert. Dann wurde das Medium in jedem Well durch serinfreies 1640-Medium ersetzt. Anschließend wurden die Zellen mit verschiedenen Nanokomplexen/FITC behandelt. Zellen ohne Nanokomplexe dienten als Kontrollgruppe, Zellen mit PEI 25K als Parallelkontrolle. Nach 4-stündiger Inkubation bei 37 °C in feuchter Atmosphäre mit 5% CO₂ wurde die Flüssigkeit entfernt, Zellen zweimal mit kaltem DPBS (pH 7,4) gewaschen, dann 20 µl DAPI und 5 µl Dil (Zellmembranfarbstoff) zu jedem Well gegeben und 20 Minuten bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden DAPI und Dil entfernt, zweimal mit kaltem DPBS (pH 7,4) gewaschen, die Deckgläser entnommen und mit Permount TM Mounting Medium auf einem Objektträger fixiert. Die Fluoreszenzsignale der Zellpräparate wurden mit konfokalem Laserscanning-Mikroskop (CLSM) beobachtet und die zelluläre Aufnahme der Nanokomplexe analysiert.

Endosomale Flucht und Kernpenetration

Zur Visualisierung der zellulären Verteilung, endosomalen Flucht und Kernpenetration der Nanokomplexe wurden SKOV3-Zellen in 12-Well-Platten (mit Deckgläsern) bei einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen/Well in 2 ml 1640-Medium mit 10% FBS ausgesät und 12 Stunden (37 °C, 5% CO₂) inkubiert. Dann wurde das Medium in jedem Well durch 1 ml/Well serinfreies 1640-Medium ersetzt. Anschließend wurden verschiedene Nanokomplexe (100 µg/ml) FITC-markiert in 12-Well-Platten für 1 ml/Well zugegeben. Nach 6 Stunden wurde die Flüssigkeit entfernt, Zellen zweimal mit kaltem DPBS (pH 7,4) gewaschen, und LysoTracker Red (5 µg/ml) für 50 µl/Well zugegeben. Nach 15-minütiger Inkubation bei 37 °C in feuchter Atmosphäre mit 5% CO₂ wurde die Flüssigkeit entfernt, Zellen zweimal mit kaltem DPBS (pH 7,4) gewaschen, dann 20 µl DAPI zu jedem Well gegeben und 20 Minuten bei 4 °C im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurde DAPI-Flüssigkeit entfernt, zweimal mit kaltem DPBS (pH 7,4) gewaschen, mit 4% Paraformaldehyd 15 Minuten bei Raumtemperatur fixiert, und die Deckgläser wurden auf Objektträgern mit Permount TM Mounting Medium fixiert. Die Fluoreszenzsignale der Präparate wurden mit konfokalem Laserscanning-Mikroskop beobachtet und die lysosomale Flucht und Kernpenetration der Nanokomplexe analysiert [29].

Zytoinhibitionsanalyse

Wir analysierten den Zellinhibitionseffekt von PEG-GO-PEI/siRNA und PEG-GO-PEI-FA/siRNA mittels CCK-8-Test. Kurz gesagt, Zellen wurden in 96-Well-Platten bei einer Dichte von 6 × 10³ Zellen/Well in 100 µl 1640-Medium mit 10% FBS ausgesät und 12 Stunden bei 37 °C in feuchter Atmosphäre mit 5% CO₂ inkubiert. Dann wurden PEG-GO-PEI und PEG-GO-PEI-FA in Endkonzentrationen von 10 bis 500 µg/ml zugegeben und weitere 12 und 24 Stunden inkubiert. Anschließend wurden PEG-GO-PEI/siRNA und PEG-GO-PEI-FA/siRNA bei 100 µg/ml für 4 bis 48 Stunden mit Zellen inkubiert. siRNA wurde mit Lipofectamine 2000 transfiziert und unbehandelt als Kontrollgruppe verwendet. Danach wurden 10 µl CCK-8 zu jedem Well gegeben und 3 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Absorption wurde bei 450 nm gemessen. Jedes Experiment wurde dreimal wiederholt. Die Inhibitionsrate (%) wurde berechnet als 1 – (Absorption Probe – Absorption Blank) / (Absorption Kontrolle – Absorption Blank) × 100%.

Statistik

Jeder Versuch wurde dreimal wiederholt, und die Daten wurden mit SPSS 17.0 Software analysiert. Einfaktorielle ANOVA für Mehrgruppenvergleiche und ungepaarter Student's t-Test für Zweigruppenvergleiche wurden verwendet. Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt, statistische Signifikanz wurde bei p < 0,05 festgelegt.

Ergebnisse und Diskussion

Synthese von PEG-GO-PEI-FA

Die Expression von FR wurde zunächst in verschiedenen Krebszelllinien basierend auf der Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE; https://portals.broadinstitute.org/ccle) Datenbank [30] und verschiedenen Ovargeweben basierend auf der Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA2; https://gepia2.cancer-pku.cn) Datenbank [31] analysiert. Die Ergebnisse stimmten mit früheren Forschungen überein (Abb. S1). Daher wählten wir FA als Targeting-Ligand für die Gentransfer.

Graphenoxid trägt zweifellos viele sauerstoffhaltige Gruppen einschließlich Carboxylgruppen am Rand, Hydroxyl- und Epoxygruppen auf der Basalebene, die durch den Oxidationsprozess entstehen [32]. Um nanoskaliges GO (NGO) zu erhalten, wurde GO durch 2-stündige Badsonikation bei 50 W kontinuierlich aufgebrochen und anschließend kovalent PEG/PEI/FA mittels EDC/NHS-Chemie an GO gebunden, wie in Abb. S2(A) illustriert. Abb. S2(B) zeigt den Behandlungsweg von PEG-GO-PEI-FA/siRNA. Die Analyse der chemischen Konjugation erfolgte durch FTIR-Differenzspektroskopie zur Erlangung der spektralen Absorptionspeaks [33]. Wie in Abb. 1a gezeigt, wurden in GO die Existenz von OH (3425 cm⁻¹), C=O (1719 cm⁻¹) und C-H (1350 cm⁻¹) Funktionsgruppen gefunden, was auf Hydroxyl- und Carboxylgruppen an der GO-Oberfläche hinweist. CH (2885 cm⁻¹) Dehnungsschwingungsband war nachweisbar, als PEG mit GO über stabile kovalente Bindungen reagierte; dies zeigte, dass PEG an GO graftet war, und die PEG-Konjugationseffizienz betrug ca. 6%. Nach Reaktion von PEI und FA mit GO wurden NH (1590 cm⁻¹) und C-N (1420 cm⁻¹) Dehnungsschwingungsbänder beobachtet, was anzeigte, dass PEI und FA durch Veresterung an GO graftet waren. Diese Ergebnisse demonstrierten, dass das Konjugat PEG-GO-PEI-FA erfolgreich synthetisiert wurde.

Abb. 1b zeigte die UV-Vis-Absorptionsspektren von GO, FA, GO-PEG, PEG-GO-PEI und PEG-GO-PEI-FA. GO hatte einen Absorptionspeak bei 223 nm. FA hatte einen Absorptionspeak bei 275 nm. GO-PEG zeigte eine glatte Kurve, was darauf hindeutete, dass PEG mit GO konjugiert war und den GO-Peak glättete. PEG-GO-PEI hatte einen Absorptionspeak bei 219 nm, was verriet, dass PEI an der GO-PEG-Oberfläche graftet war. PEG-GO-PEI-FA hatte Absorptionspeaks bei 219 nm und 275 nm, was zeigte, dass FA an PEG-GO-PEI graftet war. All diese Ergebnisse demonstrierten weiter die erfolgreiche Synthese von PEG-GO-PEI-FA.

Charakterisierung von PEG-GO-PEI-FA

Die Daten in Tabelle 1 zeigten Partikelgröße und Zetapotential der Nanokomplexe. Die Partikelgröße stieg graduell auf 218,4 nm an, während PEG, PEI und FA progressiv auf die GO-Oberfläche graftet wurden. Das Zetapotential änderte sich von –16,5 auf +17,5 mV, als PEI an GO gebunden war, was die Fähigkeit zur Adsorption negativ geladener DNA oder RNA über elektrostatische Wechselwirkung und zelluläre Aufnahme erleichterte. Die Zetapotentiale von PEG-GO-PEI-FA und PEG-GO-PEI-FA/siRNA betrugen +14,7 mV bzw. +14,5 mV. Die Zetapotentiale zeigten, dass PEG-GO-PEI-FA oder PEG-GO-PEI-FA/siRNA geringer waren als PEG-GO-PEI aufgrund der negativen Ladung von FA und siRNA. Dies deutete darauf hin, dass PEG-GO-PEI-FA/siRNA durch Ladungswechselwirkung an die Zelloberfläche adsorbiert und durch rezeptorvermittelte Endozytose an der Zytomembran aufgenommen werden konnte [34].

Die Oberflächenmorphologie und Partikelgröße des Nanoträgers wurden auch durch AFM und DLS gemessen. Wie in Abb. 2a gezeigt, wies GO eine glatte Oberfläche und Blattstruktur mit einer Partikelgröße von 192,1 nm auf. Nach Grafting von PEG, PEI und FA auf die GO-Oberfläche stieg die Partikelgröße von PEG-GO-PEI-FA auf 216,1 nm an, und viele Vorwölbungen waren auf der PEG-GO-PEI-FA-Oberfläche zu beobachten (Abb. 2b), was darauf hindeutete, dass eine große Anzahl von Dekorationen auf den GO-Schichten immobilisiert waren. Gleichzeitig war die Höhe von PEG-GO-PEI-FA größer als die von GO, was hauptsächlich auf die Anlagerung von PEG, PEI und FA auf beiden Ebenen des GO-Blatts zurückzuführen ist.

Ramanspektroskopie ist eine der häufigsten Methoden zur Charakterisierung und Strukturanalyse von Nanokohlenstoffmaterialien [35]. Wie in Abb. 2c gezeigt, zeigte das Ramanspektrum von GO Schwingungsbänder bei 1600 cm⁻¹ (G-Band) und 1354 cm⁻¹ (D-Band), und das Flächenverhältnis ID/IG betrug 1,0385, was anzeigte, dass der sp²-Hybridisierungsanteil von GO gebrochen war und Hydroxyl- und Carboxylgruppen gebildet hatten. GO-PEG und PEG-GO-PEI zeigten Schwingungsbänder bei 1595 cm⁻¹ (G-Band) und 1352 cm⁻¹ (D-Band), und die Flächenverhältnisse ID/IG betrugen 0,7737 und 0,5238. Das Flächenverhältnis ID/IG verringerte sich graduell nach Reaktion von PEG und PEI mit GO; dies zeigte, dass PEG und PEI auf der GO-Oberfläche graftet waren.

In-vitro-Bioverträglichkeitsanalyse der verschiedenen funktionalisierten NGO

Die Bioverträglichkeit nicht-viraler Genvektoren bleibt eine bedeutende Herausforderung für klinische Anwendungen. Hohe positive Ladungen brachten nicht nur ausgezeichnete Kapazität zur Kondensation und zum Schutz von Genen, sondern führten auch zu schwerer Zytotoxizität [36, 37]. Um die Zytotoxizität freier siRNA-Nanokomplexe zu testen, wurde der CCK-8-Test mit SKOV3-Zellen durchgeführt, die 4, 8, 12 und 24 Stunden mit freien Nanokomplexen bei verschiedenen Konzentrationen (10 bis 1000 µg/ml) inkubiert wurden. Wie in Abb. S3 gezeigt, wiesen die Nanokomplexe bei 1000 µg/ml und 24 Stunden noch hohe Zellviabilität in Eierstockkrebs auf. Die Zytotoxizität aller Nanokomplexe zeigte eine zeit- und konzentrationsabhängige Weise (Viabilität von SKOV3-Zellen: ≥ 84,38% für alle Nanokomplexe bei 1000 µg/ml, und ≥ 94,21% für alle Nanokomplexe nach 24 Stunden mit SKOV3-Zellen). Diese Ergebnisse legten nahe, dass die Nanokomplexe vernachlässigbare Zytotoxizität aufwiesen und als biokompatible Genvektoren dienen konnten.

Analyse der Nanokomplexe in Kombination mit siRNA

Die zelluläre Aufnahme freier RNA-Moleküle ist aufgrund ihrer substantialen negativen Ladungen meist schwierig [38]. Die Beladung negativ geladener Biomoleküle durch kationische Polymere wird weit verbreitet angewendet, um dieses Problem zu lösen [39]. In dieser Arbeit wurde die Beladung von siRNA auf dem PEG-GO-PEI-FA-Vektor durch Mischen von siRNA und PEG-GO-PEI-FA in wässriger Lösung erreicht. Wie in Tabelle 1 gezeigt, betrug das Zetapotential von PEG-GO-PEI-FA +14,7 mV, was anzeigte, dass siRNA durch elektrostatische Wechselwirkung an die PEG-GO-PEI-FA-Oberfläche adsorbiert werden kann. In dieser Studie wurde die Genkondensationsfähigkeit der Nanokomplexe durch Agarose-Gelelektrophorese bewertet [40]. Abb. 3a zeigte, dass PEG-GO-PEI bei einem Gewichtsverhältnis von 10 evidente Kondensationsfähigkeit gegenüber siRNA aufwies, während die vollständige Retardierung der siRNA-Migration bei PEG-GO-PEI-FA beobachtet wurde, als das Gewichtsverhältnis 20 erreichte (Abb. 3b). Somit konnte PEG-GO-PEI-FA siRNA vor Abbau schützen, benötigte aber etwas mehr Nanokomplex für gute Bindungsfähigkeit. Dies könnte mit den Zetapotentialen von PEG-GO-PEI-FA zusammenhängen, die nicht so hoch waren. Diese Ergebnisse zeigten, dass PEG-GO-PEI und PEG-GO-PEI-FA ausreichende Lieferfähigkeit besaßen, insbesondere PEG-GO-PEI-FA, das zudem sein Potenzial als valider Vektor für effizienten und sicheren Gentransfer demonstrierte.

Zelluläre Aufnahmeanalyse

Es ist entscheidend, ob Träger spezifisch Tumore für Gentransfer ansteuern können. Um zu bestätigen, ob der PEG-GO-PEI-FA-Träger problemlos in Zellen eindringen kann, verwendeten wir FITC als fluoreszierende Sonde für intrazelluläre Bildgebung. Gleichzeitig wurden Kerne mit DAPI und Zytomembran mit Dil gefärbt. Wie in Abb. 4 gezeigt, zeigten Kontrollgruppe und PEG-GO-PEI-Gruppe keine grünen Fluoreszenzsignale um Kerne und Zytomembran. Dies implizierte, dass PEG-GO-PEI nicht in Zellen eindrang. PEI 25K und PEG-GO-PEI-FA/siRNA erschienen als grüne Fluoreszenzsignale um den Kern, was klar demonstrierte, dass PEG-GO-PEI-FA Zellmembranen durchdringen und in Zellen eindringen konnte. Die PEG-GO-PEI-FA-Nanokomplexe zeigten die aktivste zelluläre Aufnahme, möglicherweise weil FA spezifisch an FR bindet, das auf der Oberfläche von SKOV3-Zellen überexprimiert ist. Diese Ergebnisse legten nahe, dass FA eine kritische Rolle bei der Vermittlung der effizienten zellulären Aufnahme von PEG-GO-PEI-FA und PEG-GO-PEI-FA/siRNA-Nanokomplexen spielte. Wichtiger noch, die Fähigkeit von FA, seinen Rezeptor zu binden, wurde durch die kovalente Amidbindung nicht beeinträchtigt, und die rezeptorvermittelte Endozytose war ungehindert.

Lysosomale Fluchtanalyse

Für das siRNA-Wirkstoffsystem sollten sie aus dem Endosom oder gebildeten Lysosom entweichen. Andernfalls wird siRNA abgebaut oder aus der Zelle ausgeschleust [41–43]. Wir evaluierten die endosomale Fluchfähigkeit durch intrazelluläre Lokalisation der Nanokomplexe mittels CLSM. Da viele Berichte gezeigt haben, dass PEI 25K endosomale oder lysosomale Flucht durch „Protonenschwamm-Effekt“ begünstigen kann [44], wurde PEI 25K als Kontrolle verwendet. In dieser Studie wurden die Nanokomplexe mit FITC markiert. Zunächst schätzten wir das Eindringen der Nanokomplexe in das Lysosom durch das gelbe Signal, das das grüne Fluoreszenzsignal von FITC mit dem roten Fluoreszenzsignal von LysoTracker Red überlagerte. PEI 25K erschien nach 4-stündiger Inkubation mit Zellen als gelbes Signal, andere Materialien nach 2-stündiger Inkubation, was implizierte, dass die Materialien in die Zellen eingedrungen waren (Abb. 5). Ob die Nanokomplexe aus dem Lysosom entweichen, wurde durch das helle Cyan-Signal angezeigt, bei dem das grüne Fluoreszenzsignal von FITC mit dem blauen Fluoreszenzsignal von DAPI kombiniert wird. Wie in Abb. 5a gezeigt, wurde das grüne Signal in der Anreicherung in den Kernen beobachtet, und nach 8-stündiger Inkubation von PEI/siRNA mit Zellen erschien ein helles Cyan-Signal, was anzeigte, dass PEI/siRNA aus dem Lysosom entkommen war. Allerdings zeigten PEG-GO-PEI-FA und PEG-GO-PEI-FA/siRNA bereits nach 2 Stunden einige schwache grüne Signale, die in die Kerne eindrangen, und mehr grünes Signal reicherte sich in den Kernen mit zunehmender Inkubationszeit an. Ein helles Cyan-Signal erschien, als PEG-GO-PEI-FA und PEG-GO-PEI-FA/siRNA 4 Stunden mit Zellen inkubiert wurden (Abb. 5b, c). Dies zeigte, dass die Materialien so früh aus dem Lysosom entkommen waren. Zusammenfassend zeigten diese Ergebnisse, dass PEG-GO-PEI-FA und PEG-GO-PEI-FA/siRNA eine ausgezeichnete endosomale oder lysosomale Fluchfähigkeit behielten und effizient lysosomale Flucht und Gentransfektion in vitro fördern konnten.

Zellinhibitionsbewertung von PEG-GO-PEI-FA/siRNA

Im vorliegenden Fall wurde der therapeutische Effekt von PEG-GO-PEI-FA/siRNA durch CCK-8-Test an SKOV3-Zellen in vitro untersucht. Wie in Abb. 6a gezeigt, fanden wir keinen signifikanten Einfluss auf die Überlebensrate von Tumorzellen bei verschiedenen Konzentrationen (10–100 µg/ml) und Zeitpunkten (12 und 24 h) in der PEG-GO-PEI-FA-Gruppe. Selbst bei Konzentrationen über 100 µg/ml lag die Überlebensrate von Tumorzellen noch über 80%. Daher wählten wir 100 µg/ml für die nächste zelluläre Inhibitionsstudie. Schwächere Zytotoxizität wurde in der PEG-GO-PEI/siRNA- und Lipo2000/siRNA-Gruppe gezeigt (Inhibitionsrate < 20%). Im Vergleich zu PEG-GO-PEI/siRNA und Lipo2000/siRNA hatte PEG-GO-PEI-FA/siRNA einen signifikanten inhibitorischen Effekt auf das Wachstum von SKOV3-Tumorzellen. PEG-GO-PEI-FA/siRNA inhibierte SKOV3-Zellen zeitabhängig (Abb. 6b). Diese Ergebnisse zeigten, dass PEG-GO-PEI-FA/siRNA den besten Inhibitionseffekt auf das Tumorzellwachstum hatte und wir PEG-GO-PEI-FA als idealen Nanoträger für Gentransfer verwenden konnten.

Schlussfolgerungen

In dieser Studie synthetisierten wir erfolgreich ein neuartiges Gentransfersystem, PEG-GO-PEI-FA. Die fehlende Eigenzytotoxizität und ausgezeichnete biologische Kompatibilität von PEG-GO-PEI-FA sicherten seine Aussichten als sicheren und effektiven Genteilchenvektor. PEG-GO-PEI-FA/siRNA-Nanokomplexe wiesen herausragende physikochemische Eigenschaften für gezielte Gentransfer auf. Zudem konnten PEG-GO-PEI-FA/siRNA problemlos in SKOV3-Eierstockkrebszellen eindringen und aus Lysosomen entweichen. Zytotoxizitätstests demonstrierten, dass PEG-GO-PEI-FA/siRNA einen guten Inhibitions- effekt auf Eierstockkrebszellen in zeitabhängiger Weise hatte und eine höhere Zytotoxizität im Vergleich zu anderen Gruppen aufwies. Basierend auf den vorgenannten Ergebnissen könnte PEG-GO-PEI-FA gute Aussichten als Genvektor für gezielten Gentransfer und effektivere Strategien in der Ovarialkarzinombehandlung bieten.