Her2-Funktionalisierte Gold-Nanoschalen-Magnet-Hybrid-Nanopartikel:ein theranostischer Wirkstoff für die dual-modale Bildgebung und photothermische Therapie von Brustkrebs

Einführung

Brustkrebs ist weltweit die häufigste krebsbedingte Todesursache bei Frauen [1]. Der Schlüssel zur effektiven Reduzierung der Todesfälle durch Brustkrebs ist eine frühzeitige und genaue Diagnose [2]. Trotz der Fortschritte in den letzten Jahrzehnten weisen die aktuellen diagnostischen und therapeutischen Strategien immer noch Grenzen in der Früherkennung und präzisen Behandlung von Brustkrebs auf [3]. Daher ist es notwendig, kreative neue Strategien für Brustkrebs in den frühen und subklinischen Stadien zu nutzen.

Es wird erwartet, dass die Theranostik, die die Kombination von diagnostischen und therapeutischen Ansätzen innerhalb einer Plattform beinhaltet, eine bedeutende Rolle bei der Weiterentwicklung der personalisierten Medizin spielen wird [4]. Im Allgemeinen integrieren Theranostika molekulare Bildgebung und therapeutische Funktionen in einem einzigen Nanopartikel, da sie das Potenzial haben, Brustkrebs gleichzeitig auf zellulärer oder molekularer Ebene zu überwachen und zu behandeln [5]. In der Klinik sind Ultraschall (US) und Magnetresonanztomographie (MRT) die beiden am häufigsten verwendeten Methoden zur Diagnose und zum Staging von Brustkrebs [6]. Die US-Bildgebung zeigt die Vorteile hoher Sicherheit, Echtzeitmessung und leichter Verfügbarkeit, und kontrastmittelverstärkter Ultraschall (CEUS) hat die Sensitivität und Spezifität bei der Erkennung von Brustläsionen verbessert [7]. Aber die Anwendung der US-Bildgebung ist immer noch an eine relativ begrenzte räumliche und anatomische Auflösung gebunden. Die MRT könnte ein Bild mit hervorragender räumlicher Auflösung und Weichteilkontrast liefern, während sie unter einer relativ langen Bildgebungszeit und einer begrenzten Empfindlichkeit leidet [8, 9]. Daher ist es sinnvoll, die Fähigkeiten von US- und MRT zu kombinieren, um komplementäre, synergetische und genauere Informationen über Brustkrebs bereitzustellen [10]. Darüber hinaus sind Operation und adjuvante Chemotherapie die primären Behandlungen von Brustkrebs, sie haben jedoch auch Nachteile wie schwerwiegende Komplikationen und eine erhöhte Resistenz gegen mehrere Medikamente. Die photothermische Therapie (PTT) unter Verwendung von Nahinfrarot(NIR)-Lasern und Photoabsorbern hat in letzter Zeit aufgrund ihrer minimalen Invasivität und guten Kontrollierbarkeit als wirksame Alternative zu herkömmlichen Behandlungen breites Interesse geweckt [11, 12]. Daher wird es von großem Wert sein, US/MR-Bildgebung und PTT in einer Plattform zu kombinieren, um eine dual-modale bildgebende geführte und überwachte photothermische Ablation von Brustkrebs zu erreichen.

In letzter Zeit hat die Herstellung von Nanomaterialien erhebliche Fortschritte bei den potenziellen Anwendungen von Krebstheranostika gemacht. Wie wir alle wissen, wurden Nanostrukturen auf Basis von Poly(milchsäure-co-glycolsäure) (PLGA) aufgrund ihrer hervorragenden Biokompatibilität und biologischen Abbaubarkeit umfassend für den Einsatz in Arzneimittelabgabesystemen und molekularer Bildgebung untersucht [13, 14]. Perfluoroctylbromid (PFOB), ein flüssiger Perfluorcarbon (PFCs), wurde aufgrund seiner hohen Sauerstofflöslichkeit, Hydrophobie und Lipophobizität in Polymerhüllen wie PLGA eingekapselt, um neuartige Ultraschallkontrastmittel (UCAs) zu entwickeln [15, 16]. Darüber hinaus haben superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel (SPIOs) große Aufmerksamkeit als molekulare MR-Sonden erhalten, um anatomische Informationen in lebenden Organismen aufgrund ihrer großen Biokompatibilität und hervorragenden Kontrastverstärkung zu erhalten [17,18,19].

Eine weitere vielversprechende Nanoplattform sind Gold (Au)-Nanostrukturen, die aufgrund ihrer guten Biokompatibilität und einzigartigen optischen und elektrischen Eigenschaften in der biologischen und medizinischen Forschung weit verbreitet sind [20]. Die Gold-Nanoschale, eine Art sphärischer Gold-Nanomaterialien, hat eine signifikante Oberflächen-Plasma-Resonanz-(SPR)-Absorption im NIR-Bereich gezeigt, was ihre Verwendung in der PTT ermöglicht, um Krebszellen selektiv abzutöten, ohne die umgebenden gesunden Zellen zu beeinträchtigen [21]. Es wurde auch berichtet, dass mit Au-Nanoschalen beschichtete PLGA-Mikrokapseln für die molekulare Bildgebung in den USA verwendet werden könnten [22]. Zahlreiche Studien haben sich auf die Kombination von Au-Nanoschale und Polymer als „Schale-Kern-Struktur“ für die Theranostik von Krebs konzentriert. Keet al. entwickelten eine Reihe von Theranostika auf der Basis von Au-nanoshelled Poly(milchsäure)-Mikrokapseln für die multimodale Bildgebung und PTT [23, 24]. Luet al. stellten mit Doxorubicin beladene polymere Goldnanoschalen für die Fluoreszenzbildgebung und die Photothermo-Chemotherapie von Krebs her [25]. Ein häufiges Problem dieser NPs ist jedoch das Fehlen von hochaffinen Bindungsliganden auf der Oberfläche, was dazu führt, dass sie nicht in der Lage sind, spezifische Zielzellen mit hoher Spezifität zu erkennen oder an diese zu binden, um diagnostische und therapeutische Wirkungen zu maximieren. Darüber hinaus haben sich unseres Wissens nach nur wenige Studien der Untersuchung einer gezielten PLGA-Hybrid-Nanoplattform mit Au-Nanohülle für die dual-modale kollaborative Diagnose und PTT von Brustkrebs gewidmet.

Unter den molekularen Targets, die bisher für Brustkrebs in Betracht gezogen wurden, wird der humane epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (Her2), eine an die Zellmembran gebundene Rezeptor-Tyrosinkinase, am häufigsten als wichtiger Biomarker für die Lokalisierung und Identifizierung von Brustkrebs verwendet [26, 27 ]. Es wird bei etwa 25–30 % der menschlichen primären Mammakarzinome überexprimiert, die mit Tumoraggressivität, hoher Rezidivrate und schlechter Prognose einhergehen [28, 29]. Daher ist die Herstellung von Her2-gerichteten Theranostika ein florierendes Feld zur Verbesserung der Früherkennung und Behandlung von Brustkrebs.

Die Grundidee unserer Studie ist die Entwicklung von Her2-funktionalisierten Gold-Nanoschalen-Magnet-Hybrid-NPs (Her2-GPH-NPs), die dual-modale US/MR-Bildgebung und PTT integrieren und der Früherkennung und präzisen Behandlung von Brustkrebs dienen. Der Wirkstoff wurde durch Einkapseln von PFOB und SPIOs in PLGA-NPs konstruiert, gefolgt von der Beschichtung der Oberfläche mit Gold-Nanoschalen und anschließender Konjugation mit Anti-Her2-Antikörpern (Abb. 1). Es wird erwartet, dass die ausreichende Akkumulation des Wirkstoffs in Her2-positiven Brustkrebs-SKBR3-Zellen durch die Antikörper-vermittelte Targeting-Spezifität und die Nanogröße des Wirkstoffs erreicht werden könnte. Die vorliegende Studie wurde auch entwickelt, um die Machbarkeit der Verwendung des Wirkstoffs als dual-modale molekulare Sonde zur Bereitstellung einer US/MR-Kontrast-verstärkten Bildgebung in vitro sowie die gezielte PTT-Wirkung von Brustkrebszellen, die durch NIR-absorbiertes Au . induziert wird, zu überprüfen Nanoschalen.

Schematische Darstellung des Herstellungsverfahrens von Her2-GPH-NPs

Materialien und Methoden

Materialien

Poly (Milchsäure-Co-Glykolsäure) (PLGA, Carbonsäure-terminiert, Lactid:Glykolid 50:50, Mw 24.000–38.000), Polyallylamin-Hydrochlorid (PAH, Mw 17.500) und Tetrachlorgold(III)-Säure-Trihydrat (HAuCl ₄ ·3H₂ O) wurden von Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd. (Shanghai, China) erhalten. Ölsäurebeschichtete superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel (OA-SPIOs) mit einem mittleren Durchmesser von 10 nm wurden von Shanghai So-Fe Biomedicine Co., Ltd. (Shanghai, China) bezogen. Perfluoroctylbromid (PFOB), Polyvinylalkohol (PVA, 87–89 % Mol hydrolysiert, niedriges Molekulargewicht), 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (EDC) und N -Hydroxysuccinimid (NHS) wurden von Aladdin Chemistry Co., Ltd. (Shanghai, China) bezogen. Carboxyl-terminierter Poly(ethylenglycol) (SH-PEG-COOH, Mw 2000) und Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-markierter Anti-Her2-Antikörper wurden von Xi'an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. (Xi'an, China) bezogen ) bzw. Abcam (Cambridge, MA, USA). Alle anderen verwendeten Reagenzien waren von analytischer Qualität.

Vorbereitung von PFOB/SPIOs@PLGA-NPs

PFOB/SPIOs@PLGA-NPs wurden unter Verwendung einer angepassten Öl/Wasser-Emulsionslösungsmittelverdampfungsmethode hergestellt [24, 30]. Kurz gesagt, wurden mit Ölsäure beschichtete SPIOs in Hexan (0,5 µl, 20 mg/ml) zu Methylenchlorid (3,6 µl) gegeben, um PLGA (100 µl) und PFOB (60 µl) aufzulösen. Die resultierende organische Phase wurde tropfenweise zu einer vorkühlenden wässrigen PVA-Lösung (20 mL, 2%, w /v ). Anschließend wurde das System 2 min lang unter Verwendung von Sondenbeschallung in einem Eiswasserbad bei einer Einstellung der Ausgangsamplitude von 80 % emulgiert. Danach wurde die Emulsion 5 h bei Raumtemperatur gerührt, dann zentrifugiert (16.000 U/min, 5 min, 15 °C, Avanti J-25, Beckman Coulter) und zweimal mit entionisiertem (DI) Wasser gewaschen, um PFOB/SPIOs@ zu erhalten. PLGA-NPs.

Vorbereitung von PFOB/SPIOs@PLGA@Au NPs

Zunächst wurden Citrat-stabilisierte Gold-NPs mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 5 nm hergestellt, wie bereits berichtet [21]. In der Zwischenzeit wurde die PFOB/SPIOs@PLGA NPs-Suspension (1 µl) in PAH-Lösung (1,0 µg/ml in 0,5 µmol/l wässriger NaCl-Lösung) für 30 Minuten gemischt, gefolgt von einer Zentrifugation (15.000 Umdrehungen pro Minute, 10 Minuten, 15 °C). ) und zweimaliges Waschen mit DI-Wasser. Dann wurde die Mischung in eine citratstabilisierte Gold-NPs-Suspension (100 ml) gegeben und 30 min gerührt. Nach wiederholten Zentrifugen-/Waschschritten wurden die resultierenden mit Au-NPs beschichteten PFOB/SPIOs@PLGA-NPs in HAuCl₄ . redispergiert Lösung (2 mL, 1% w /v ) unter magnetischem Rühren. Als nächstes frisch zubereitete Hydroxylamin-Hydrochlorid-Lösung (NH₂ OH·HCl, 0.3 mL, 0.5 mol/L) wurde hinzugefügt, um HAuCl₄ . zu reduzieren um Au-Nanoschalen auf der Oberfläche von PFOB/SPIOs@PLGA-NPs zu bilden.

Vorbereitung von Her2-GPH-NPs

Die hergestellte wässrige PFOB/SPIOs@PLGA@Au NPs-Lösung (1 µmL, 1 µg/mL) wurde mit SH-PEG-COOH (5 µg) gemischt und 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zentrifugation (16000 U/min, 20 min, 15 °C) und zweimaligem Waschen wurde das Präzipitat in Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) dispergiert. Als nächstes wurden EDC (10 mg) und NHS (10 mg) eingeführt und 2 h bei Raumtemperatur gerührt, um die Carboxylsäuregruppen der pegylierten NPs zu aktivieren, und die aktivierten NPs (GPH-NPs) wurden dann durch wiederholtes Zentrifugieren/Waschen erhalten Schritte. Danach wurden Anti-Her2-Antikörper mit FITC-markiert (10 µL, 0,38 µg/mL) in die aktivierten NPs-Dispersionen gegeben und 90 Minuten in einem isothermen Schüttler inkubieren gelassen. Schließlich wurden die freien Antikörper durch Zentrifugations-/Waschschritte entfernt, um Her2-funktionalisierte PFOB/SPIOs@PLGA@Au-NPs (Her2-GPH-NPs) zu erhalten.

Charakterisierungen

Die Oberflächenstruktur und Morphologie von Her2-GPH-NPs wurde durch Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie (FE-SEM, Hitachi S-4800, Tokio, Japan) charakterisiert. Ein hochauflösendes Transmissionselektronenmikroskop (TEM, JEM-2100; JEOL, Tokio, Japan) wurde verwendet, um die innere Struktur zu bestätigen, indem eine Probe auf kohlenstoffbeschichtete Cu-Gitter getaucht wurde. Die entsprechende energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDS) der Probe (ohne Goldsputterprozess) wurde an TEM angehängt, um die elementare Zusammensetzung der resultierenden NPs zu analysieren. Die hydrodynamische Größe und das Zeta-Potential von Her2-GPH-NPs wurden mit einem Instrument der dynamischen Laserstreuung (DLS) (Zetasizer Nano ZS3690; Malvern Instruments, Malvern, UK) gemessen. Die UV-Vis-Absorptionsspektren des Mittels in verschiedenen Herstellungsstadien wurden mit einem UV-Vis-Spektrophotometer (Beckman Coulter DU 730, USA) aufgenommen. Die Menge an Au- und Fe-Elementen in Her2-GPH-NPs wurde durch Atomemissionsspektroskopie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-AES, Vistampxicp Varian, USA) bestimmt.

Messung der photothermischen Leistung

Die photothermische Leistung von Her2-GPH-NPs wurde durch Überwachung des Temperaturanstiegs unter NIR-Laserbestrahlung bewertet. Verschiedene Konzentrationen von wässrigen Her2-GPH-NPs-Lösungen (50, 100, 150, 200 µg/ml) wurden mit einem 808 nm Laser bestrahlt (1 µW/cm ² ) für 10 min in Quarzküvetten (Gesamtvolumen 1 ml) und die Temperatur der Lösungen wurde alle 10 s mit einer FLIR A300 Wärmebildkamera gemessen. Um die photothermische Stabilität des Mittels zu beurteilen, wurden die Absorptionsspektren der Materialien vor und nach dem Bestrahlungsprozess aufgenommen. DI-Wasser wurde zum Vergleich unter den gleichen Bedingungen bestrahlt.

Zellkultur

Die humane Brustkrebs-SKBR3-Zelllinie (SKBR3-Zellen), die Her2 überexprimiert, und die humane Brustkrebs-MDA-MB-231-Zelllinie (MDA-MB-231-Zellen), die Her2 niedrig exprimiert, stammten vom Institut für Biochemie und Zellbiologie (Shanghai, China). Sie wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Gibco Life Technologies, Grand Island, NY, USA) kultiviert, das 20 % fötales Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin enthielt. Alle Zellen wurden in einer Umgebung von 37 °C und 5 % CO₂ . gezüchtet .

In-vitro-Zytotoxizitäts-Assay

Die In-vitro-Zytotoxizität von Her2-GPH-NPs wurde durch Zellzähl-Kit-8-Assays (CCK-8, Dojindo Molecular Technologies Inc., Japan) an SKBR3- und MDA-MB-231-Zellen bewertet. Die beiden Zellarten wurden jeweils in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 1 × 10 ⁴ . ausgesät pro Well und inkubiert für 24 h. Nach Entfernen des Kulturmediums wurden die Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen (0, 10, 20, 50, 100, 200 µg/ml) Her2-GPH NPs behandelt und weitere 12 oder 24 Stunden inkubiert. Dann wurde die CCK-8-Lösung (10 µl CCK-8 in 100 µl DMEM) zugegeben und weitere 2 Stunden inkubiert. Schließlich wurde die optische Dichte (OD) jedes Wells mit einem Mikroplatten-Lesegerät (Thermo Scientific Multiskan MK3) bei einer Wellenlänge von 450   nm gemessen.

In-vitro-Rezeptor-spezifische Targeting-Studien

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie

SKBR3- und MDA-MB-231-Zellen wurden in Zellkulturschalen mit Glasboden (Φ = 20 mm) bei einer Dichte von 2 × 10 ⁴ Zellen/Vertiefung für 24 Stunden, und dann wurden sie in drei Gruppen eingeteilt, einschließlich Nicht-Zielgruppe, Zielgruppe und Zielinhibierungsgruppe. Zwei Arten von Zellen als Nicht-Zielgruppe wurden mit 100 µl GPH-NPs behandelt, und die Zellen in der Zielgruppe wurden mit 100 µl Her2-GPH-NPs behandelt. In gezielten Inhibitionsgruppen wurden die Zellen mit freien Anti-Her2-Antikörpern (20 µl) für 30 Minuten inkubiert, bevor sie mit Her2-GPH-NPs behandelt wurden. Nach entsprechender Inkubation von 30 min wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen, mit 4% Paraformaldehyd für 15 min fixiert. Dann wurden die Zellen mit einem Zellkernfärbemittel (DAPI; Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) für 10 min gefärbt und erneut mit PBS gewaschen. Schließlich wurden die Zellen unter Verwendung einer konfokalen Laserscanning-Mikroskopie (LSCM) (Leica TCS SP5 II, Leica Microsystems Ltd., Mannheim, Deutschland) beobachtet.

Durchflusszytometrie

SKBR3- und MDA-MB-231-Zellen wurden wie oben beschrieben kultiviert und behandelt, und die Gruppierungen stimmten mit dem LSCM-Assay überein. Alle Zellen wurden mit Trypsin verdaut und dann in PBS vor der Durchflusszytometrie (FCM) mit einer Dichte von 2 × 10 ⁵ . resuspendiert Zellen pro Röhrchen. Die Fluoreszenzintensität der Zellen wurde mit einem Durchflusszytometer (FC500MCL, Beckman Coulter, Fullerton, CA) bestimmt. SKBR3- und MDA-MB-231-Zellen wurden als Blindkontrollen verwendet, um die Gates zu setzen. Dann wurden die Spannungs- und Fluoreszenzkompensation von FL1 angepasst, um sicherzustellen, dass die spontane Fluoreszenz der Zellen innerhalb von 10 ¹ . lag des Fluoreszenzhistogramms. Nach der Inkubation der Zellen mit NPs spiegelten die Abweichungen der Fluoreszenzintensität von den Leergruppen die Bindungsrate der NPs an die Zellen wider. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

In-vitro-US-Bildgebung und quantitative Analyse

In-vitro-Lösung Ultraschallbildgebung

In-vitro-Lösungs-Ultraschallbildgebung von Her2-GPH-NPs wurde unter Verwendung des Mylab Twice Ultrasound System (Esaote SpA, Genova, Italien) durchgeführt. Her2-GPH-NPs wurden in entgastem DI-Wasser in verschiedenen Konzentrationen (0,1, 0,5, 1, 1,5, 2 µg/mL) dispergiert und in ein Eppendorf-Röhrchen (2 µmL) injiziert, und dann wurde das Röhrchen in einen Reinstwassertank getaucht. Die Ultraschalluntersuchung wurde mit dem LA522-Schallkopf sowohl im zweidimensionalen (2D) Graustufenmodus als auch im kontrastverstärkten Modus unter den folgenden Parametern durchgeführt:der mechanische Index (MI) =  0,01 und der Frequenzbereich betrug 3–9 MHz. Die Bilder wurden vom Längsquerschnitt des Röhrchens aufgenommen und für die quantitative Analyse der Zeit-Intensitäts-Kurve (TIC) mit der Software QontraXt V3.06 aufgezeichnet.

Gezielte US-Bildgebung von Brustkrebszellen

SKBR3-Zellen und MDA-MB-231-Zellen wurden in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 2 × 10 ⁶ . kultiviert /well für 24 h, und sie wurden in drei Gruppen eingeteilt, einschließlich der Kontrollgruppe, der Nicht-Zielgruppe und der Zielgruppe. Zellen in der Nicht-Zielgruppe und der Zielgruppe wurden 30 min lang mit GPH-NPs (100 µg/ml) bzw. Her2-GPH-NPs (100 µg/ml) behandelt. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen, verdaut und in Teströhrchen mit PBS (0,5 ml) redispergiert. Agarosegele (1%) wurden in 20-ml-Glasschalen hergestellt. Um den gezielten Ultraschall-Imaging-Effekt von NPs auf der Zelloberfläche zu simulieren, wurden die Zellsuspensionen in den sechs Gruppen von Reagenzgläsern separat mit 1-ml-Spritzen extrahiert und langsam in das Agargel injiziert. Die Bildgebung erfolgte mit einem SL3116-Schallkopf im Graustufenmodus (Verstärkung = 70%; Mittenfrequenz = 22 MHz; MI = 0,06). Nach dem Scannen wurde die Region of Interest (ROI) in jeder Gruppe von Ultraschallbildern gezeichnet. Der Graustufenwert jedes ROI wurde mit einer Bildanalysesoftware (DigSubAna; Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China) quantitativ analysiert, um den gezielten Ultraschall-Bildgebungseffekt von Her2-GPH-NPs zu bewerten.

In-vitro-MR-Bildgebung und quantitative Analyse

T ₂ Messung und MR-Bildgebung von Her2-GPH-NPs

Die MR-Bildgebung von Her2-GPH-NPs und Relaxivitätsmessungen wurden unter Verwendung eines 0.5 T-Systems (Shanghai Niumag Corporation ration NM120-Analyst) durchgeführt. Her2-GPH-NPs wurden in DI-Wasser bei verschiedenen Fe-Konzentrationen (0, 0,005, 0,01, 0,02, 0,04, 0,08 mM) und T . suspendiert ₂ -gewichtete MR-Bilder der Proben wurden mittels Spin-Echo-Sequenz aufgenommen (TR = 2000 ms; TE = 100 ms; Schichtdicke = 3 mm; FOV = 3 × 3 cm). Die transversale Relaxationszeit (T ₂ ) der Wasserprotonen der wässrigen Lösung der NPs wurde ebenfalls gemessen, und die transversale Relaxivität (r ₂ ) wurde durch die Kurvenanpassung von 1/T . bestimmt ₂ (s ⁻¹ ) gegen die Konzentration von Fe (mM).

Gezielte MR-Bildgebung von Brustkrebszellen

Die Gruppierungen und Behandlung von SKBR3- und MDA-MB-231-Zellen stimmten mit dem gezielten US-Imaging-Assay überein. Nach Inkubation mit nicht-zielgerichteten GPH-NPs (100 µg/ml) oder gezielten Her2-GPH-NPs (100 µg/ml) für 30 Minuten wurden die Zellen mit PBS gewaschen, verdaut und in Xanthangummi (1 µg/ml) dispergiert. . Alle Proben wurden unter Verwendung einer Spin-Echo-Sequenz mit den gleichen Parametern wie oben beschrieben gescannt. Der ROI jedes Bildes wurde für die quantitative Analyse der Signalintensität mit der Software image J definiert.

Gezielte In-vitro-PTT-Evaluierung

Um die gezielte PTT-Wirkung von Her2-GPH-NPs sichtbar zu machen, wurden SKBR3-Zellen in Zellkulturschalen mit Glasboden ausplattiert (Φ = 20 mm) bei einer Dichte von 1 × 10 ⁵ Zellen/Vertiefung für 24 h, und sie wurden jeweils in fünf Gruppen eingeteilt, einschließlich DMEM-Kontrollgruppen mit oder ohne Laserbestrahlung, gezielte Materialgruppen mit oder ohne Laserbestrahlung und nicht gezieltes Material mit Laserbestrahlung. Die Zielgruppen wurden mit DMEM-Dispersionen behandelt, die Her2-GPH-NPs (100 µg/ml) für 30 Minuten enthielten, und die nicht anvisierten Gruppen wurden mit GPH-NPs (100 µg/ml) unter denselben Bedingungen behandelt. Zellen in Laserbestrahlungsgruppen wurden mit NIR-Laser bestrahlt (808 nm, 1 W/cm ² ) für 10 min und weiter bei 37 °C für 2 h inkubiert. Dann wurde die Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung eines Testkits für lebende/tote Zellen (Life Technologies, Grand Island, NY) bewertet. Schließlich wurden die Bilder der gefärbten Zellen mit einem LSCM aufgenommen. Um die photothermische Zytotoxizität zu quantifizieren, wurden SKBR3-Zellen (1 × 10 ⁴ pro Well) wurden in 96-Well-Platten ausplattiert und 24 h inkubiert. Die Gruppierungen stimmten mit den obigen überein, und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch den CCK-8-Assay getestet. Um die photothermische Zytotoxizität von Her2-GPH-NPs unter verschiedenen Konzentrationen und Laserbestrahlung weiter quantitativ zu bewerten. Die Zellen wurden mit DMEM-Dispersionen inkubiert, die Her2-GPH-NPs unterschiedlicher Konzentrationen (0, 50, 100, 150, 200 µg/ml) enthielten. Nach dem Waschen mit PBS (10 mM, pH 7,0) wurden die Zellen mit einem NIR-Laser (808 nm, 1 W/cm ² . bestrahlt ) für 10 min und weiter für 2 h inkubiert. Dann wurde die Zelllebensfähigkeit ebenfalls durch den CCK-8-Assay bestimmt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 4).

Um die heterogene Expression von Her2 in Brusttumorgeweben zu simulieren, kultivierten wir SKBR3-Zellen und MDA-MB-231-Zellen in unterschiedlichen Anteilen (0:100%, 25:75%, 50:50%, 75:25%, 100 .). :0%). Alle Zellen wurden 30 Minuten lang mit Her2-GPH-NP (200 µg/ml) behandelt und mit einem NIR-Laser (808 nm, 1 µW/cm ² . bestrahlt ) für 10 min. Nach einer weiteren Inkubation für 2 h wurden die Lebensfähigkeiten der Zellen mit CCK-8-Assays analysiert. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 4).

Statistische Analyse

Quantitative Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (Mittelwert ± ± SD) ausgedrückt. Statistische Unterschiede zwischen mehreren Gruppen wurden durch Varianzanalyse (ANOVA) bestimmt, und Daten aus zwei unabhängigen Stichproben wurden mit Student's t . verglichen Prüfung. P <  0,05 wurde als statistisch signifikanter Unterschied angesehen. Statistische Analysen wurden mit SPSS v17.0 (IBM, Armonk, NY, USA) durchgeführt.

Ergebnisse und Diskussionen

Charakterisierungen

PFOB/SPIOs@PLGA-NPs wurden über den Lösungsmittelverdampfungsprozess einer Öl/Wasser-Emulsion hergestellt. Die REM-Aufnahme (Abb. 2a) zeigte, dass die PFOB/SPIOs@PLGA-NPs eine einheitliche sphärische Morphologie und eine glatte Oberfläche aufwiesen. Wie in TEM (Abb. 2b) gezeigt, gab es einen offensichtlichen Unterschied in der elektronischen Dichte zwischen dem Kern und der Hülle der PFOB/SPIOs@PLGA-NPs, was auf die Einkapselung von PFOB in den NPs hindeutet. Außerdem wurde, wie im Nebenbild mit höherer Vergrößerung dargestellt, das Vorhandensein von SPIOs als tiefgraue Flecken in der Schale und der flüssigen PFOB-Kernregion von PFOB/SPIOs@PLGA-NPs gezeigt. Der mittlere Durchmesser von PFOB/SPIOs@PLGA-NPs betrug ca. 248,3 nm mit einem Polydispersitätsindex von 0,037 und das Zetapotential betrug gemäß der DLS-Messung ca. − 14,7 mV. Daher konnten PFOB/SPIOs@PLGA-NPs leicht positiv geladenes PAH absorbieren, um anschließend negativ geladene Au-Nanopartikel mit einer mittleren Größe von 5–7 nm anzulagern, die als Keime für das Wachstum der Gold-Nanoschale um die Oberfläche von PFOB . verwendet wurden /SPIOs@PLGA NPs durch Seeding-Verfahren.

Charakterisierungen von Her2-GPH-NPs. a SEM (Skala = 2 μm) und b TEM (Scale = 200 nm) Bilder von PFOB/SPIOs@PLGA NPs; c SEM (Skala = 1 μm) und d TEM-Bilder (Skala = 100 nm) von Her2-GPH-NPs; e EDS-Element-Mapping-Bilder zeigen die Verteilungen von C-, O-, Fe-, F-, Br- und Au-Elementen in Her2-GPH-NPs

Her2-GPH-NPs wurden hergestellt, indem Anti-Her2-Antikörper über SH-PEG-COOH mit PFOB/SPIOs@PLGA@Au-NPs verbunden wurden. Dabei wurde die klassische Carbodiimid-Technologie verwendet, um die Carbonsäuregruppen von PEGylierten PFOB/SPIOs@PLGA@Au-NPs zu aktivieren und die kovalente Bindung von Aminogruppen an Antikörper zu fördern [31]. Wie in REM- und TEM-Bildern dargestellt (Abb. 2c, d), behielten Her2-GPH-NPs eine wohldefinierte kugelförmige Morphologie mit rauer Oberfläche bei, und dichte Au-NPs mit einem Durchmesser von mehreren zehn Nanometern waren auf der Oberfläche des Nanopartikel, die die erfolgreiche Herstellung der Goldnanoschalen anzeigten. Die EDS-Elementkartierung (Abb. 2e) und die Ergebnisse der Elementanalyse (Abb. 3a) von Her2-GPH-NPs zeigten deutlich die große Menge an Au-Elementen und das Vorhandensein von Fe-, F- und Br-Elementen, was auf die erfolgreiche Einkapselung von SPIOs und PFOB . hindeutet und die Bildung von Au-Nanoschalen. Darüber hinaus wurde der Gehalt an Au- und Fe-Elementen in Her2-GPH-NPs mit 67,71 ±   7,34 % Gew.% bzw. 2,13 ± ± 0,52 Gew. % durch ICP-AES bewertet.

Charakterisierungen von Her2-GPH-NPs. a EDS-Elementanalyse von Her2-GPH-NPs; b UV-Vis-Absorptionsspektren von Her2-GPH-NPs in verschiedenen Herstellungsstadien; c Größenverteilung und d Zeta-Potenzial von Her2-GPH-NPs

Darüber hinaus wurden auch UV-Vis-Absorptionsspektren von Her2-GPH-NPs in verschiedenen Herstellungsstadien untersucht (Abb. 3b). PFOB/SPIOs@PLGA-NPs zeigten keinen offensichtlichen Absorptionspeak im Bereich von 400 bis 800 nm, während Au-NPs einen Plasmaresonanzpeak bei etwa 520 nm aufwiesen. Sowohl PFOB/SPIOs@PLGA@Au-NPs als auch Her2-GPH-NPs zeigten einen kontinuierlichen breiten Peak im Bereich von 600 bis 900 nm (NIR-Bereich) aufgrund der angelagerten Au-Keime, die durch den Impfprozess zum Cluster größer genug gewachsen waren. Die breiten Absorptionsspektren im NIR-Bereich stellten sicher, dass die Her2-GPH-NPs als Photoabsorber für die photothermische NIR-Therapie fungieren konnten. Darüber hinaus wiesen Her2-GPH-NPs im Vergleich zu PFOB/SPIOs@PLGA-NPs eine erhöhte Größenverteilung von 282,3 nm mit einem Polydispersitätsindex von 0,18 auf (Abb. 3c). Und das Zetapotential betrug − 31,3 mV (Abb. 3d), was auf eine gute Stabilität hindeutet.

Messung der photothermischen Leistung

Der photothermische Umwandlungseffekt der Her2-GPH-NPs-Lösung wurde unter Bestrahlung mit einem NIR-Laser (808 nm, 1 W/cm ² ) und die Temperaturänderung wurde alle 10 s mit einer IR-Wärmebildkamera überwacht. Nach 10 Minuten Laserbestrahlung änderte sich die Farbe der Wärmebildgebung verschiedener Konzentrationen der Her2-GPH-NP-Lösung, was darauf hindeutet, dass die Temperatur mit steigender Konzentration an Her2-GPH-NPs anstieg (Abb. 4a). Die photothermische Temperaturmessung stimmte mit den Bildgebungsdaten überein. Es konnte beobachtet werden, dass die Temperatur der NPs-Lösung mit zunehmender Expositionszeit und Konzentration anstieg (Abb. 4b). Im Detail betrug der Temperaturanstieg der Her2-GPH-NPs-Lösung 18,5 °C bei einer Konzentration von 0,2 mg/ml, während der Temperaturanstieg für DI-Wasser nur 1,2 °C betrug. Um Krebszellen abzutöten, musste nach früheren Studien die Temperatur auf den Hyperthermie-Temperaturbereich (40–47 °C) angehoben werden [32]. Aufgrund des thermischen Verlustes in vitro reicht jedoch eine Temperaturerhöhung von ca. 10 °C nicht aus, um den Zelltod zu induzieren [33]. Her2-GPH-NPs könnten die Temperatur bei relativ niedriger Konzentration um etwa 18 °C erhöhen, wodurch das Potenzial besteht, Krebszellen durch Hyperthermie abzutöten. Um die photothermische Stabilität von Her2-GPH-NPs zu überprüfen, wurden außerdem UV-sichtbare NIR-Absorptionsspektren von Proben vor und nach der Laserbestrahlung gesammelt. Und die Absorptionsspektren sind vor und nach der Laserbelichtung fast unverändert (Abb. 4c), wodurch sichergestellt wird, dass Her2-GPH-NPs als effizienter Photoabsorber für die PTT von Krebs dienen können.

Photothermische Wirkung von Her2-GPH-NPs. a NIR-Wärmebilder und b Temperaturvariation von Her2-GPH-NPs bei verschiedenen Konzentrationen nach Bestrahlung mit einem NIR-Laser (808 nm, 1 W/cm ² ,10 Minuten); c UV-Vis-NIR absorption spectra before and after the photothermal irradiation assay

In Vitro Cytotoxicity Assay

It is well known that biocompatibility of NPs is one of the primary concerns in biomedical applications and should be determined first. Thus, CCK-8 assays were used to evaluate the cytotoxicity of Her2-GPH NPs in breast cancer MDA-MB-231 and SKBR3 cells, as shown in Fig. 5a and b. Compared with controls, the viability of Her2-GPH NPs-treated MDA-MB-231 and SKBR3 cells remained more than 90% at the concentration ranging from 10 to 200 μg/mL for 24 h, indicating the low cytotoxicity and good biocompatibility of the resulted NPs, which could ensure their safety for further cell experiments and clinical studies.

Cell viabilities of a MDA-MB-231 and b SKBR3 cells at different dosages of Her2-GPH NPs (0, 10, 20, 50, 100, 200 μg/mL) for 12 h and 24 h (data expressed as mean ± SD, n  = 4)

In Vitro Receptor-Specific Targeting Studies

Confocal Laser Scanning Microscopy

Fluorescein isothiocyanate (FITC) is widely used as green fluorescence probes for immune detection and it can easily bind several kinds of monoclonal antibodies. Thus, we choose FITC-labeled anti-Her2 antibody, and the connection of NPs with antibody could be observed more visually by immunofluorescence assay. To verify the binding of anti-her2 antibodies to GPH NPs, GPH NPs and Her2-GPH NPs were placed on dishes (Φ  = 20 mm) for CLSM analysis. As illustrated in Fig. 6, both Her2-GPH NPs and GPH NPs could be clearly observed in bright field. GPH NPs showed no fluorescence signal, while Her2-GPH NPs exhibited bright green fluorescence in the FITC and merged channel, which confirmed the successful conjugation of anti-her2 antibody with GPH NPs.

Confocal microscopic images of Her2-GPH NPs and GPH NPs in bright field, FITC fluorescence and merged channels (scale bar = 5 μm)

We utilized LSCM to confirm the targeting specificity of Her2-GPH NPs in vitro. As can be seen from the Fig. 7, compared with non-targeted group (b), SKBR3 cells incubated with targeted Her2-GPH NPs (a) exhibited bright green fluorescence signals on the surface of cell membranes, indicating the NPs carrying Her2 antibodies could effectively bind to Her2-positive cells [34]. To clearly observe the distributions of Her2-GPH NPs in SKBR3 cells, we provided a bright image (a1), FITC fluorescence image (a2), nuclear image (a3), and an overlay image (a4) of it. Because of the short incubation time of NPs, they were mainly distributed on the surface of cell membranes and aggregated into black spots. In competition study, there were negligible fluorescence signals when SKBR3 cells were pre-treated with excess free anti Her2 antibodies and then incubated with Her2-GPH NPs (Fig. 7c). These results demonstrated that the targeting behavior of Her2-GPH NPs was receptor-mediated and could be blocked by excess free anti-Her2 antibodies [26]. In addition, little fluorescence is detected in MDA-MB-231 cells treated with Her2-GPH NPs under the same conditions (Fig. 7d), which confirmed that Her2-GPH NPs specifically bind to SKBR3 cells overexpressing Her2 receptors.

Confocal microscopic images and flow cytometry results of SKBR3 cells incubated with targeted Her2-GPH NPs (a /a1 –a4 , e ) and non-targeted GPH NPs (b , f ), free Her2 antibody pre-treated SKBR3 cells incubated with Her2-GPH NPs (c , g ), and MDA-MB-231 cells incubated with Her2-GPH NPs (d , h ). a1 the image of bright field; a2 the image of DAPI channel; a3 the image of FITC channel; and a4 the image of merged channel (scale bar = 10 μm)

Flow Cytometry

The binding rate of Her2-GPH NPs towards cells was further assessed quantitatively via FCM. As clearly illustrated in Fig. 7, the binding rate of targeted NPs to SKBR3 cells (e) was remarkably higher than that of MDA-MB-231 cells (h) (86% ± 3.72% vs 2.31% ± 0.36%, P  < 0.001), indicating the specific targeting capability of Her2-GPH NPs to Her2-positive cells. In addition, Her2-GPH NPs had little targeting binding to SKBR3 cells which were pre-treated with excess free anti-Her2 antibodies (Fig. 7g), and there was significant difference between the targeted inhibition group and targeted group (3.16% ± 0.41% vs 86% ± 3.72%, P  < 0.001). Based on the above, the FCM results provided further strong evidence that Her2-GPH NPs had specific targeting capability of recognizing and combining with SKBR3 cells overexpressing Her2 receptors and the targeting behavior was receptor-mediated.

In Vitro US Imaging and Quantitative Analysis

In Vitro Solution Ultrasound Imaging

In our study, the US imaging effect of Her2-GPH NPs solution was assessed in vitro under different modes using Mylab Twice Ultrasound System unit. Observed from Fig. 8a, the tubes filled with Her2-GPH NPs solution displayed strong dotted echo in both 2D gray-scale and CEUS modes. By contrast, DI water exhibited as an echo. Furthermore, with the increasing concentration of Her2-GPH NPs, the ultrasound contrast enhancement signal gradually increased. As illustrated in TIC, the mean signal intensity of the Her2-GPH NPs gradually increased as the concentration of NPs increased and it kept correspondence with the CEUS result. The agent at the concentration of 2 mg/mL had significantly stronger contrast enhancement signals than the NPs at 0.1 mg/mL (82 ± 0.69 dB vs 27 ± 6.7 dB, P  < 0.01), indicating the stronger backscattering is produced by higher concentration of the NPs. The above indicated that the Her2-GPH NPs possessed satisfactory contrast enhancement effect in vitro and such contrast enhancement was concentration-dependent. In addition, the length of ultrasound imaging time of Her2-GPH NPs at the concentration of 2 mg/mL was also investigated (Fig. 8b). Her2-GPH NPs exhibited exquisite contrast-enhanced signal before 2 min, and the signal intensity gradually decreased with time elapsing. However, there was still obvious enhancement signal within 5 min, which can meet the requirement of clinical contrast-enhanced ultrasonography. Conventional gas-filled microbubbles as UCAs could enhance the backscattering signal of blood by non-linear oscillations under ultrasound but are not suitable for tissue molecular evaluation due to its limitation in intravascular imaging and poor stability [35]. Compared with gas-filled agent, the liquid fluorocarbon-filled PLGA nanocapsules have acoustic stability with prolonged circulation half-time [16]. Besides, our previous research found that Au nanoshells have good reflection properties because of its high atomic number and density [36]. Therefore, we combined the ultrasonic resonance properties of PFOB-filled PLGA nanocapsules with the great echogenicity of Au nanoshells, which prominently enhanced the backscattering signal of Her2-GPH NPs in vitro.

a In vitro two-dimensional (2D) gray-scale ultrasound (US) and contrast-enhanced ultrasound (CEUS) images and the time-intensity curve (TIC) of Her2-GPH NPs under different concentrations (0, 0.1, 1, 1.5, 2 mg/mL). b In vitro US images of Her2-GPH NPs (2 mg/mL) with time elapsing

Targeted US Imaging of Breast Cancer Cells

The targeted ultrasound imaging ability of Her2-GPH NPs on breast cancer cells was evaluated in 2D gray-scale mode using Mylab Twice Ultrasound System unit. As shown in Fig. 9a, both the NPs-treated and the control cells displayed uniform, hyperechoic bands in the gel with clear boundaries. It could be clearly observed that the echogenic band of SKBR3 cells treated with Her2-GPH NPs was brighter and denser than those of non-targeted and control SKBR3 cells. However, no significant echo signal differences were observed in MDA-MB-231 cells treated with targeted or non-targeted NPs. We further quantified the average gray-scale value of the images based on the defined ROI, and the results were exhibited in Fig. 9b. The gray-scale value of SKBR3 cells treated with targeted Her2-GPH NPs was significantly higher than that of SKBR3 non-targeted and control group (P  < 0.01). Moreover, SKBR3 cells treated with targeted Her2-GPH NPs showed higher gray-scale values compared to MDA-MB-231 cells treated with the same NPs (P < 0,05). These results demonstrated that Her2-GPH NPs could specifically bind to Her2-positive SKBR3 cells and had the potential to enhance the ultrasound molecular imaging effect of targeted cells.

a In vitro ultrasound imaging and b gray-scale value analysis of MDA-MB-231 and SKBR3 cells treated with targeted Her2-GPH NPs or non-targeted GPH NPs. MDA-MB-231 and SKBR3 cells served as controls (data expressed as mean ± SD, *P  < 0.05, **P  < 0.01, n  = 3)

In Vitro MR Imaging and Quantitative Analysis

T ₂ Measurement and MR Imaging of Her2-GPH NPs

SPIOs have been intensively investigated in T ₂ -weighted MR imaging due to their capability to shorten transverse relaxation times of the surrounding water protons, which results in the decrease in the MR signal intensity and enables to provide negative contrast enhancement of the target lesion [37, 38]. The T ₂ contrast imaging capabilities of Her2-GPH NPs with various Fe concentrations were evaluated at a 0.5 T magnetic field. Figure 10 a displayed the transverse relaxation rates (1/T ₂ ) of water protons as a function of the iron concentration in Her2-GPH NPs aqueous solution. And the relaxivity (r ₂ ) was calculated based on the slope to be 441.47 mM ⁻¹ s ⁻¹ , which is more than 2 times as high as commercial SPIO-based MR imaging contrast agent Feridex (152 mM ⁻¹ s ⁻¹ ) under the same magnetic field strength [39]. The higher T ₂ relaxivity may be due to the fact that the aggregation of SPIOs inside the polymeric matrix results in a relatively enlarge in the size of the magnetic NPs and enhances the magnetic interactions [37, 40]. In addition, the signal intensity of T ₂ -weighted MR imaging gradually decreased along with the increase of the iron concentration (Fig. 10b), which further confirmed Her2-GPH NPs had the capability for T ₂ -weighted MR contrast imaging.

In vitro MR imaging. a The transverse relaxation rates (1/T ₂ ) of Her2-GPH NPs aqueous solution as a function of the iron concentration in a 0.5 T magnetic field. b T ₂ -weighted MR images of Her2-GPH NPs with different iron concentrations acquired using spin-echo sequence. c T ₂ -weighted MR images and d signal intensity of Her2-GPH NPs (100 μg/mL) and GPH NPs (100 μg/mL) incubated with MDA-MB-231 and SKBR3 cells. MDA-MB-231 and SKBR3 cells served as controls (data expressed as mean ± SD, *P  < 0.05, **P  < 0.01, ***P  < 0.001, n  = 3)

Targeted MR Imaging of Breast Cancer Cells

The targeted MR imaging effect of Her2-GPH NPs on SKBR3 and MDA-MB-231 cells was confirmed by in vitro T ₂ -weighted MR imaging. As shown in Fig. 10 c and d, SKBR3 cells treated with targeted Her2-GPH NPs exhibited noticeable negative contrast enhancement, and the signal intensity decreased by 48% compared to the control cells (P  < 0.001). However, the MR signal intensity of non-targeted GPH NPs-treated SKBR3 cells showed little reduction. In addition, the signal intensity of MDA-MB-231 cells labeled with Her2-GPH NPs or GPH NPs did not change significantly compared with the control group (P  > 0.05). Furthermore, Her2-GPH NPs-treated SKBR3 cells showed a higher degree of signal intensity reduction than that of MDA-MB-231 cells (P  < 0.001), which could be used to distinguish the two cells from each other. The above results together indicated that Her2-GPH NPs could enhance T ₂ -weighted MR imaging through receptor-mediated cell-specific uptake [41].

In Vitro Targeted PTT Evaluation

Initially, calcein-AM/propidium iodide (PI) staining was used to visually evaluate targeted photothermal cytotoxicity in vitro. Calcein AM, a non-fluorescent live cell stain, can permeate the cell membrane and hydrolyze to produce a green fluorescent calcein dye in live cells. Propidium iodide (PI) is a dead cell stain, which binds to the DNA of dead cells to generate red fluorescence [33]. As shown in Fig. 11a, there were no obvious dead cells when NIR laser irradiation or the Her2-GPH NPs was used separately, indicating that neither laser irradiation nor the NPs itself was cytotoxic. Likewise, cells treated with non-targeted GPH NPs in combination with NIR laser showed little cell death. On the contrary, a large number of dead cells could be observed when Her2-GPH NPs were treated in the presence of laser irradiation, which suggested that the agent could induce hyperthermic cell death by targeting photothermal effect. The cell viabilities were further quantitatively evaluated by CCK-8 assay. As illustrated in Fig. 11b, SKBR3 cells treated with Her2-GPH NPs and laser irradiation exhibited a (62 ± 4.56%) decrease in cell viability compared with the control group (P  < 0.001). Furthermore, under the laser irradiation for 10 min, the cell viability of targeted Her2-GPH NPs group was significantly lower than that of the non-targeted group (38 ± 4.56% vs 87.6 ± 4.06%, P  < 0.05).

In vitro targeted photothermal assay. a Confocal microscopic images of calcein-AM/PI-stained SKBR3 cells in in different treatments groups (Her2-GPH NPs group, laser group, GPH NPs + laser group, Her2-GPH NPs + laser group) (scale bar = 100 μm). SKBR3 cells served as control. b Relative cell viabilities of SKBR3 cells in the five groups after treatment as shown in Fig. 11 a (data expressed as mean ± SD, *P  < 0.05, ***P  < 0.001, n = 4); c cell viabilities of SKBR3 cells incubated with Her2-GPH NPs at different concentrations (0, 50, 100, 150, 200 μg/mL) with or without NIR laser irradiation (808 nm, 1 W/cm ² , 10 min) (data expressed as mean ± SD, *P  < 0.05, ***P  < 0.001, n  = 4)

In addition, we used the CCK-8 assay to further quantitatively assess the photothermal cytotoxicity of Her2-GPH NPs at various concentrations. As shown in Fig. 11c, the viabilities of SKBR3 cells treated with Her2-GPH NPs without NIR laser irradiation remained more than 90%, whereas the viabilities of laser irradiated cells decreased significantly with increasing concentrations of Her2-GPH NPs. Only less than 20% of laser-irradiated cells remained viable at the concentration of 200 μg/mL compared with the non-laser-irradiated cells at the same concentration (P  < 0.001). These results further confirmed that relatively low concentrations of Her2-GPH NPs were sufficient to provide enough temperature increase to kill SKBR3 cells.

Furthermore, we co-cultured SKBR3 and MDA-MB-231 cells in different proportions to simulate the heterogeneous expression of Her2 in breast tumor tissues. Results showed that the total cell viabilities after photothermal induction of Her2-GPH NPs decreased with the increasing proportions of SKBR3 cells, and the total cell viability of the other proportion group was significantly higher than that of the 100% SKBR3 cells group (P  < 0.05) (Additional file 1:Figure S1). Besides, in the presence of Her2-GPH NPs for 30 min, the total cell viabilities after induction with NIR laser was significantly lower than that of the non-laser irradiation cells (P  < 0.05), except for the 100% MDA-MB-231 cells group. Taken together, Her2-GPH NPs could specifically bind to SKBR3 cells and had great potential to induce cancer cells to death by photothermal effect. The possible mechanism of photothermal hyperthermia for SKBR3 cells should be mainly attributed to the exposure of the cancer cells to higher temperatures, which inhibited normal cellular growth and proliferation by denaturing intracellular proteins [42].

Conclusions

Her2-GPH NPs, a Her2 functionalized theranostic agent that integrated dual-modal US/MR imaging and targeted PTT has been successfully designed, fabricated and investigated in vitro. By conjugation with anti-Her2 antibodies, the agent could recognize or bind to breast cancer SKBR3 cells overexpressing Her2 with high specificity and sensitivity. In addition, through the co-loading of PFOB and SPIOs, and the construction of Au-nanoshelled PLGA “shell-core structure”, the resulting Her2-GPH NPs provide excellent contrast enhancement in vitro US and T ₂ -weighted MR imaging. Furthermore, the formation of Au nanoshells enables the agent to be served as efficient photoabsorber for targeted NIR PTT in breast cancer cells. Our results provide a preliminary exploratory study for the integration of collaborative diagnosis and adjuvant therapy of breast cancer, and further studies in vivo are still needed.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

The datasets generated and analyzed during the current study are included in this article.

Abkürzungen

Au NPs:

Gold nanoparticles

CCK-8:

Cell-counting kit-8

DAPI:

4′,6-Diamidino-2-phenylindole

DI:

Deionized

DLS:

Dynamic laser scattering

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

EDC:

Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide

EDS:

Energy dispersive X-ray spectroscopy

FCM:

Flow cytometry

FDA:

Food and Drug Administration

FE-SEM:

Field emission scanning electron microscopy

FITC:

Fluorescein isothiocyanate

GPH NPs:

Gold-nanoshelled magnetic hybrid nanoparticles

Her2:

Human epidermal growth factor receptor 2

HR-TEM (TEM):

Hochauflösendes Transmissionselektronenmikroskop

HUVEC cells:

Human umbilical vein endothelial cells

ICP-AES:

Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy

LSCM:

Laser scanning confocal microscopy

MRI:

Magnetic resonance imaging

NIR:

Near-infrared

PAH:

Polyallylamine hydrochloride

PFOB:

Perfluorooctyl bromide

PLGA:

Poly lactic-co-glycolic acid

PTT:

Photothermal therapy

PVA:

Polyvinyl alcohol

SPIOs:

Superparamagnetic iron oxide nanoparticles

TIC:

Time-intensity curve

UCA:

Ultrasound contrast agent

US:

Ultrasound imaging