Wasserlösliches Fullerenol mit Hydroxylgruppen-Abhängigkeit für eine effiziente photodynamische Zwei-Photonen-angeregte Inaktivierung infektiöser Mikroben

Einführung

In den letzten Jahrzehnten wurden verschiedene Photosensibilisator(PS)-Moleküle synthetisiert [1]. Klinische Anwendungen existierender PSs beinhalten jedoch mehrere Probleme. Die meisten PS-Moleküle sind hydrophob und können in wässrigen Medien leicht aggregieren, wodurch ihre Quantenausbeute (QY) verringert wird [2]. Darüber hinaus können aggregierte PSs nicht einfach intravenös injiziert werden. Eine selektive Akkumulation von PS-Molekülen in verstorbenen Geweben ist auch erforderlich, um Schäden an gesunden Zellen zu verhindern. Aufgrund dieser Probleme bleibt die Entwicklung eines wirksamen PS-Trägers eine große Herausforderung für die photodynamische Therapie (PDT). Dementsprechend steigt das Interesse an der Verwendung von Nanopartikeln als PS-Träger.

Fortschritte in der Nanobiotechnologie haben das Interesse an biomedizinischen Anwendungen einer neuen Klasse von Nanostrukturen [3,4,5,6,7,8,9,10,11] geweckt, die ausschließlich aus Kohlenstoffatomen bestehen, nämlich Fulleren C₆₀ , bei denen es sich um kugelförmige Moleküle (0,72 nm Durchmesser) handelt, die nicht toxisch sind und einzigartige physikalisch-chemische Eigenschaften aufweisen. Die geringe Größe von lipophilem C₆₀ Moleküle ist für ihre sterische Kompatibilität mit biologischen Molekülen verantwortlich und fördert ihre Integration in hydrophobe Bereiche von Membranen [12, 13]. Wegen der verlängerten π -konjugiertes System seiner Molekülorbitale, Fulleren C₆₀ absorbiert ultraviolett-sichtbares (UV-vis) Licht und kann reaktive Sauerstoffspezies (ROS) mit einem fast 100 % Singulett-Sauerstoff-QY (Φ _Δ ). Darüber hinaus sind die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Fulleren C₆₀ ermöglichen es ihm, ROS zu generieren und als PS für PDT zu dienen. Fullerene können auch prooxidative Wirkungen induzieren, und dies könnte durch das verwendete Fulleren, den untersuchten Zelltyp und den experimentellen Aufbau bestimmt werden [14,15,16,17]. C₆₀ hat eine extrem geringe Löslichkeit in polaren Lösungen, was ihre Anwendung in der Medizin erheblich einschränkt. Aufgrund des Vorhandenseins von Doppelbindungen ist C₆₀ . jedoch kann leicht mit chemischen Gruppen modifiziert werden, um die Wasserlöslichkeit zu erhöhen. Daher wasserlösliches C₆₀ Derivate bieten mehr Möglichkeiten für medizinische Anwendungen, einschließlich Neuroprotektion, Wirkstoff- und Genverabreichung, Photosensibilisierung und Biosensorik.

Multiphotonen-Lasermikroskopie (auch bekannt als Zweiphotonen-Lasermikroskopie) beinhaltet die Verwendung einer lokalisierten „nichtlinearen“ Anregung, um Fluoreszenz nur innerhalb einer dünnen Rasterebene anzuregen. Die Zwei-Photonen-Lasermikroskopie wurde in verschiedenen bildgebenden Studien verwendet [18]. Es ist typischerweise mit Nahinfrarot-(NIR)-Laseranregung gekoppelt, um die inhärente maximale Gewebetransmission für die Biobildgebung zu nutzen; Dies liegt daran, dass NIR die Vorteile einer geringen Streuung, einer geringen Energieabsorption, einer optimalen Strahlungsdurchdringung und einer reduzierten Photobleichung der Proben hat. Die Kopplung von Zwei-Photonen-Lasermikroskopie mit NIR-Laseranregung hat sich zur bevorzugten Technik für die Fluoreszenzmikroskopie in dickem Gewebe und tieferen biologischen Präparaten entwickelt [19, 20] und wird in großem Umfang bei anderen Photoanregungstherapien angewendet [21, 22]. Darüber hinaus gilt die Zwei-Photonen-Lasermikroskopie aufgrund ihrer ultraniedrigen Energie und kurzen Photoanregung als alternativer Ansatz zur Durchführung der PDT [23]. Obwohl einige PSs toxisch sind [24, 25], sind diejenigen mit einem hohen Φ _Δ werden für die Durchführung von PDT priorisiert. Ein hohes Φ _Δ Wert ist besonders wünschenswert, wenn Zwei-Photonen-Techniken verwendet werden, um molekulare Aktivitäten in Photoeigenschaften zu bewerten und nichtlineare mikroskopische Studien effizient durchzuführen; ein solcher Wert ist wünschenswert, da das Verhältnis der absorbierten Energie zum Eingangsenergiefluss einer Probe hoch ist, wodurch eine mögliche Photoschädigung der Probe minimiert wird [26]. Die Literatur enthält jedoch keine Studien, die die Verwendung von Materialien mit Zwei-Photonen-Eigenschaften für die PDT in Betracht gezogen haben. Um diese Forschungslücke zu schließen, wurde in der vorliegenden Studie wasserlösliches hydroxyliertes Fullerenol mit starker Elektronenspendefähigkeit und einem großen π . eingesetzt -konjugiertes System zur Erhöhung der Ladungsübertragungseffizienz, wodurch die Zwei-Photonen-Eigenschaften verbessert werden. Insbesondere wasserlösliches hydroxyliertes C₆₀ (OH)₄₆ wurde abgeleitet und als Zwei-Photonen-PS zur effektiven Entfernung von Mikroben mit ultraniedriger Femtosekunden-Laserbestrahlung und nur 800 Scans unter Zwei-Photonen-Anregung (TPE; Anregungswellenlänge 760  nm) angewendet. Für die Ultraniederenergie-Femtosekundenlaserbestrahlung betrug die Energie 211.2 nJ Pixel ⁻¹ und die Leistung betrug 2,112 mW (zur Berechnung der Laserleistung nach dem Objektiv, siehe Abschnitt „Materialien und Methoden“ und Abb. 1a, wobei die x –y Brennpunkt und z -Achsenauflösung des Lasersystems beträgt ungefähr 0,37538 bzw. 0,90159 μm); Darüber hinaus betrug die effektive Gesamtbelichtungszeit für den Scanvorgang ungefähr 3,2621 s, die Scanrate betrug 4,0776 ms scan ⁻¹ , und der Scanbereich war 200 × 200 μm ² (Details zur Berechnung siehe Abschnitt „Materialien und Methoden“). Das wasserlösliche hydroxylierte C₆₀ (OH)₄₆ erreichte eine fast 100%ige Elimination von Escherichia coli (E. coli , ein Gram-negativer Bakterienstamm). Darüber hinaus ist das wasserlösliche C₆₀ (OH)₄₆ mit einer höheren Zusammensetzung von Hydroxylgruppen zeigten überlegene Zweiphotonen-Photoeigenschaften im Vergleich zu denen mit einer niedrigeren Zusammensetzung von Hydroxylgruppen unter TPE; daher das abgeleitete wasserlösliche C₆₀ (OH)₄₆ kann ein erhebliches Potenzial für den Einsatz bei der simultanen PDT zur Eliminierung bösartiger Mikroben haben.

a Nach dem z -Achsen-Scan eines dünnen Goldfilms, der verwendet wird, um das Signal der Erzeugung der zweiten Harmonischen an verschiedenen Positionen zu messen, dem z -Achsenauflösung des Lasersystems (volle Breite bei halbem Maximum) beträgt ca. 0.90159 μm (Anpassung unter Verwendung der Gaußschen Funktion). b TPL-Intensitätsabhängigkeit von der Anregungsleistung (Logarithmus) der Materialien und Fluorophore; TPE-Exposition von 704,0 bis 2816,0 nJ Pixel ⁻¹ für Rhodamin B und Fluorescein von 1408,0 bis 2816,0 nJ Pixel ⁻¹ für wasserlösliches C₆₀ (OH)₂₁ Fullerenol und von 1760,0 bis 2816,0 nJ Pixel ⁻¹ für wasserlösliches C₆₀ (OH)₄₆ Fullerenol. Anregungswellenlänge, 760 nm. Gelieferte Dosis:OD₆₀₀ 0,05 von E. coli und 3 μg mL ⁻¹ Materialien. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD (n =6)

Materialien und Methoden

Herstellung und Charakterisierung wasserlöslicher Fullerenole, C₆₀ (OH)₂₁ und C₆₀ (OH)₄₆ [27]

Rohes Fulleren wurde kommerziell bezogen (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) und das C₆₀ (OH)₁₂ Vorläufer wurde, wie zuvor beschrieben, hergestellt. Zuerst wurde dem Ausgangsmaterial eine 30%ige Wasserstoffperoxidlösung (100 ml; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) zugesetzt, 0,5-1,0 g C60&supmin; (OH)₁₂ , und die Mischung wurde bei 60 °C unter Luft kräftig gerührt. Nach dem Abkühlen wurde ein Lösungsmittelgemisch bestehend aus 2-Propanol, Diethylether und Hexan (jeweils 100–200 ml; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) in die Lösung gegeben, die anschließend zentrifugiert und dekantiert wurde. Der verbleibende Feststoff wurde zweimal mit 200 &mgr;l Diethylether durch Zentrifugieren und Dekantieren gewaschen. Schließlich die Endprodukte des wasserlöslichen C₆₀ (OH)₂₁ und C₆₀ (OH)₄₆ wurden durch Trocknen des Rückstands unter Vakuum bei Raumtemperatur jeweils über Nacht erhalten. Das Gewicht des Endprodukts wurde durch thermogravimetrische Analyse kalibriert. Die Morphologie des Endprodukts wurde mit einem hochauflösenden Transmissionselektronenmikroskop (HR-TEM, JEOL 3010, Akishima, Tokio, Japan) bei einer Auflösung von ca. 1,11 ± 0,03 nm und 1,13 ± 0,04 nm für C_{60 . beobachtet} (OH)₂₁ und C₆₀ (OH)₄₆ , bzw. Zur Größenbestimmung von Materialien wurde auch die dynamische Lichtstreuung (DLS, Malvern Nano-ZS90, Worcestershire, West Midlands, UK) verwendet. Die exponierten funktionellen Gruppen der so hergestellten Materialien wurden zuerst durch Fourier-Transform-Infrarot(FTIR)-Spektroskopie (RX1, PerkinElmer, Waltham, MA, USA) untersucht. Die UV-Vis-Spektroskopie der Materialien wurde mit einem Spektrometer (U-4100, Hitachi, Chiyoda-ku, Tokio, Japan) durchgeführt. Die Oberflächenchemie des Fullerenols wurde durch Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS, PHI 5000 Spektrometer (VersaProbe, Chanhassen, MN, USA)) untersucht. Das Molekulargewicht von Fullerenol wurde unter Verwendung eines Felddesorptions(FD)-Massenspektrometers (AccuTOF, GCx-plus, JEOL, Akishima, Tokio, Japan) bestimmt und die Anzahl der Hydroxylgruppen wurde basierend auf den Ergebnissen mit 21 und 46 bestätigt. bzw.

Bakterienkulturen [28]

E. coli , die aus unserem eigenen Labor stammen, wurden in Nähragar von LB (pro Liter:Trypton 10 g, Hefeextrakt 5 g, Natriumchlorid 8 g, Agar 15 g, und pH auf 7,5 eingestellt) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) und bei 37 °C inkubiert.

Biokompatibilitätsassay mit der Zählmethode der Koloniebildungseinheit (KBE) [28]

E. coli (OD₆₀₀ ~ 0,05) wurde mit Material hinzugefügt (0–9 μg mL ⁻¹ ) und 3 h bei 37 °C inkubiert (Zusatzdatei 1:Abb. S1). Nach der Inkubation wurde die Mischung zentrifugiert und die Bakterienpellets wurden verdünnt (OD₆₀₀ ~ 0,05). Ein Verdünnungsfaktor von 10 ⁻⁵ bis 10 ^–8 wurde dann in den inkubierten Bakterien durchgeführt und auf den Agarplatten ausplattiert. Die Platten bleiben über Nacht in einem Inkubator (bei 37 °C). Die Anzahl der überlebenden Bakterien wurde bestimmt und als Prozentsatz (%) ausgedrückt, der der Einheit KBE ml ⁻¹ . entsprach nach der Inkubation. Daten sind Mittelwerte ± SD (n =6).

ψ _Δ Messung [29, 30]

Laut der vorherigen Studie ist ψ _Δ erhalten werden können. ψ _Δ Messungen wurden in D₂ . durchgeführt O bei 355 nm, mit meso -Tetra(4-sulfonatophenyl)porphindihydrochlorid (TSPP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) als Referenz (ψ _Δ =0,64).

Fluoreszenz-QY-Messung [31, 32]

Die relative Photolumineszenz (PL) QY von Kontrastmitteln ist normalerweise das Verhältnis der emittierten Photonen zu den absorbierten Photonen und wird wie folgt angegeben:

wobei QY_ref =0,28 ist die QY von Cy5.5 gelöst in Dimethylsulfoxid (DMSO; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) als Referenz, η ist der Brechungsindex von ddH₂ O =1,33 (η _ref von DMSO =1,48), I ist die integrierte Fluoreszenzintensität und A ist die Extinktion bei der Anregungswellenlänge. Ein-Photonen-Anregung (OPE) oder TPE liefert den gleichen QY.

Femtosekunden-Laseroptiksystem zur Messung der Zwei-Photonen-Absorption (TPA) und Zwei-Photonen-Lumineszenz (TPL) [23, 28, 33,34,35 ,36,37,38]

Das hausgemachte Femtosekunden-Titan-Saphir-(ti-sa)-Laseroptiksystem (eine Wiederholrate von 80 MHz; Tsunami, Spectra-Physics, Santa Clara, CA, USA) wurde gemäß den vorherigen Studien verwendet.

TPA-Messung

Mit einer Galvanometer-Scannergeschwindigkeit von 2 m ms ⁻¹ , das Anregungsspektrum wurde als 720–820 nm mit einer Anregungsleistung von 2,8 mW gemessen [dies ist die Leistung vor Objektiv; die Leistung nach dem Objektiv (oder auf der Probe) beträgt 0,9856 mW oder 98,56 nJ Pixel ⁻¹ ]. Daher wurden die relativen TPA-Spektren als Funktion der Anregungswellenlänge für die Fullerenole gemessen.

Messung von TPL-Spektren

Das Material wurde TPE aus dem Femtosekundenlaser bei einer Anregungswellenlänge von 760 nm, einem Scanbereich von 200 × 200  μm ² . ausgesetzt , eine Frequenz von 10 kHz, eine Belichtungszeit von 1,638 s/(Scan, Pixel) =100 μs, 128 × 128 Pixel Scan ⁻¹ , und eine Pixelfläche von 1562,5 × 1562,5 nm ² . Der Brennfleckbereich wurde als πd . berechnet ² /4, wobei d =0,61 λ/numerische Apertur (NA ) ist die volle Breite beim halben Maximum der Strahltaille. Zum Beispiel beim x –y Achsenbrennfleck mit 760 nm Anregung und einem × 40 Ölimmersionsobjektiv mit einer NA von 1,3, d =0,61 × 800 nm/1,3 =375,38 nm =0,37538 μm und die z -Achsenauflösung wurde mit 0,90159 µm gemessen. Bei 760 nm Anregung wird die Belichtungszeit pro Scan für ein einzelnes Nanomaterial ausgedrückt als (Brennfleckfläche/Pixelfläche) × 100 =4,0776 ms und die Gesamtbelichtungszeit t =4,0776 ms × Anzahl der Scans. Ein × 40 Ölimmersionsobjektiv (NA 1.3) wurde verwendet, um die Signale zu sammeln, und der Erfassungsbereich des Spektrumphotometers betrug 300–695 nm.

Zusätzlich werden die Berechnungen der Laserleistung (mW oder nJ Pixel ⁻¹ ) wurden bei der Probe wie folgt verwendet. Für das × 40 Ölimmersionsobjektiv (NA 1.3), beträgt die Übertragungsrate bei einer Wellenlänge von 760  nm in diesem optischen System ungefähr 88 %, und die Laserleistung ging vom Ausgang zum Objektiv mit nur 40 % der ursprünglichen Ausgangsleistung aufgrund des Leistungsverlusts. Als Ergebnis beträgt die berechnete Energie nach dem Objektiv (auf der Probe) P _Ausgabe (mW)*40%*88% =0,352 × P _Ausgabe (mW). Zum Beispiel P _Ausgabe =2,8 mW, die berechnete Energie nach dem Objektiv (auf der Probe) beträgt 3,0 mW*40%*88% =0,9856 mW. Mit 10 kHz Abtastrate (jeder Puls bleibt 0,1 ms Pixel ⁻¹ ), die berechnete Energie der Probe (J pixel ⁻¹ ) war um P _Ausgabe (mW)*40%*88%*0,1 ms =0,0352*P _Ausgabe (J pixel ⁻¹ ). Zum Beispiel P _Ausgabe =2,8 mW, die Energie (J pixel ⁻¹ ) auf Probe =2,8 mW*40%*88%*0,1 ms =0,09856 μJ Pixel ⁻¹ =98,56 nJ Pixel ⁻¹ . Die Leistung nach dem Objektiv (auf der Probe) wurde verwendet und durch dieses Manuskript gekennzeichnet.

Messung des absoluten TPE-Querschnitts [24, 36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47, 48]

Der absolute Wirkungsquerschnitt von TPE wurde über das Lumineszenzsignal über . gemessen optisches Femtosekunden-Lasersystem nach früheren Studien. Die TPL von Fluorescein und Rhodamin B (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) musste überprüft werden. Die Ergebnisse sind in Abb. 1b dargestellt und wurden durch Messung der Abhängigkeit der Emissionsintensität mit einem Anregungsleistungsbereich von 704 nJ pixel ⁻¹ . erhalten (7,04 mW) bis 2816 nJ Pixel ⁻¹ (28,16 mW). Zur Bestimmung der Lumineszenz von TPE wurde eine quadratische Abhängigkeit mit den Exponenten von 2,03 für Fluorescein und 2,02 für Rhodamin B gemessen, um die Anregungsleistung zu erhöhen. Nach früheren Studien betragen die Wirkungsquerschnitte von TPE für Fluorescein und Rhodamin B 36,4 und 68,0 GM (1 GM =10 ⁻⁵⁰ cm ⁴ s-Photon ⁻¹ ) bzw. für 760 nm Anregung. Wir verweisen auch auf die kostenlose Website http://www.drbio.cornell.edu/cross_sections.html, die uns freundlicherweise von Prof. Chris Xu (Cornell University, NY, USA) zur Verfügung gestellt wurde. Die Wirkungsquerschnitte von TPE für Fluorescein und Rhodamin B wurden mit 36,5 bzw. 66,1 GM berechnet (Tabelle 1), was einen Fehler von weniger als 5 % im Vergleich zu denen aus dem Labor von Prof. Xu anzeigte. In dieser Studie wurde Rhodamin B als Standardreferenz für die Bestimmung des Querschnitts und die berechneten absoluten Querschnitte von TPE für das wasserlösliche C₆₀ . gewählt (OH)₂₁ und C₆₀ (OH)₄₆ Fullerenole betrugen ungefähr 1230,51 GM bzw. 1037,21 GM. Die gemessenen Parameter zur Berechnung der absoluten TPE-Querschnitte der Proben sind in Tabelle 3 aufgeführt. Für die Materialien wurden keine Variationen von Charge zu Charge in den Zwei-Photonen-Eigenschaften und der photodynamischen Fähigkeit der Zwei-Photonen beobachtet.

Femtosekunden-Laseroptiksystem (für Fluoreszenzlebensdauer-Imaging-Mikroskopie, FLIM) [39, 45]

Das selbstgebaute optische Femtosekunden-Ti-Sa-Lasersystem (Wiederholungsrate von 80 MHz; Tsunami, Spectra-Physics, Santa Clara, CA, USA) wurde gemäß den vorherigen Studien verwendet. Die Lebensdauerdaten und Parameter werden unter Verwendung der dreifach-exponentiellen Gleichungsanpassung generiert, während die Emission unter TPE (Ex, 760 nm) überwacht wird.

Berechnung der Strahlungs- und Nichtstrahlungszerfallsraten [46]

PL QY und Lebensdauer sind beides wichtige Parameter bei der Untersuchung der Emissionseigenschaften von Fluoreszenzfarbstoffen in verschiedenen Umgebungen. Das QY (Q ) kann wie folgt ausgedrückt werden:

wo Γ ist die Strahlungszerfallsrate und k ist die strahlungslose Zerfallsrate. Die Fluoreszenzlebensdauer wird normalerweise als die durchschnittliche Zeit definiert, die ein Elektron im angeregten Zustand benötigt, um in den Grundzustand zu zerfallen. Die TPL-Lebensdauer τ kann auch relativ zu den Zerfallsraten sein und wird wie folgt beschrieben:

Nach Gl. (2) und (3) können die Strahlungs- und Nichtstrahlungszerfallsraten berechnet werden.

Bei der Absorption eines Photons wird eines der schwach gebundenen Elektronen des fluoreszierenden Moleküls – ein Fluorophor – auf ein höheres Energieniveau gehoben. Der Fluorophor befindet sich dann in einem angeregten Zustand, A* . Dieser Zustand ist metastabil; daher kehrt das Fluorophor in seinen stabilen Grundzustand zurück, A . Dies kann entweder durch Strahlung durch Emission eines Fluoreszenzphotons hν

oder strahlungslos durch Dissipieren der Energie des angeregten Zustands als Wärme:

Die Entvölkerung des angeregten Zustands hängt von den verfügbaren Abregungswegen ab. Fluoreszenz ist die Strahlungsdeaktivierung des niedrigsten Schwingungsenergieniveaus des ersten elektronisch angeregten Singulett-Zustands, S ₁ , zurück zum elektronischen Grundzustand, S ₀ . Die Singulett-Zustände sind die Energieniveaus, die das schwach gebundene Elektron ohne Spin-Flip besetzen kann. Die Absorptions- und Emissionsprozesse werden durch ein nach Aleksander Jablonski benanntes Energieniveaudiagramm veranschaulicht.

Die Fluoreszenzlebensdauer, τ , ist die durchschnittliche Zeit, die ein Fluorophor im elektronisch angeregten Zustand verbleibt S ₁ nach Erregung. τ ist als Kehrwert der Summe der Geschwindigkeitsparameter für alle Entvölkerungsprozesse im angeregten Zustand definiert:Gl. (3), wobei die strahlungslose Geschwindigkeitskonstante k ist die Summe der Geschwindigkeitskonstanten für die interne Umrechnung k _ic und die Geschwindigkeitskonstante für den Intersystem-Übergang in den Triplett-Zustand k _isc so dass k =k _ic + k _isc . Die Fluoreszenzemission erfolgt immer vom niedrigsten Schwingungsniveau von S ₁ , eine Regel, die als Kasha-Regel bekannt ist und anzeigt, dass der Fluorophor keine Erinnerung an seinen Erregungsweg hat; OPE und TPE liefern beispielsweise dasselbe Fluoreszenzspektrum, QY und Lebensdauer.

Bestimmung der Bakterienlebensrate nach Laserbelichtung [28]

CFU-Zählmethode

Bakterien (OD₆₀₀ ~ 0.05) wurde mit Material hinzugefügt (3 oder 6 μg mL ⁻¹ ) durch Inkubation für 3 h bei 37 C im Dunkeln. Nach der Inkubation wurde die Mischung zentrifugiert und die Bakterienpellets wurden verdünnt (OD₆₀₀ ~ 0,05) und einer TPE-Leistung von 211,2 nJ Pixel ⁻¹ . ausgesetzt mit 800 Scans (ca. 3,2621 s der gesamten effektiven Belichtungszeit; Bsp. 760  nm). Dann ist ein Verdünnungsfaktor von 10 ^–5 bis 10 ^–8 wurde dann in den inkubierten Bakterien durchgeführt und auf den Agarplatten ausplattiert. Die Platten bleiben über Nacht in einem Inkubator (bei 37 °C). Die Anzahl der überlebenden Bakterien wurde bestimmt und als Prozentsatz (%) ausgedrückt, der der Einheit KBE ml ⁻¹ . entsprach nach der Inkubation. Daten sind Mittelwerte ± SD (n =6).

LIVE/DEAD Kit

Bakterien (OD₆₀₀ ~ 0.05) wurde mit Material hinzugefügt (3 oder 6 μg mL ⁻¹ ) durch Inkubation für 3 h bei 37 C im Dunkeln. Nach der Inkubation wurde die Mischung zentrifugiert und die Bakterienpellets wurden verdünnt (OD₆₀₀ ~ 0,05) und einer TPE-Leistung von 211,2 nJ Pixel ⁻¹ . ausgesetzt mit 800 Scans (ca. 3,2621 s der gesamten effektiven Belichtungszeit; Bsp. 760  nm). Dann wurden die Pellets mit einem LIVE (SYTO 9, angezeigt mit grüner Fluoreszenz)/DEAD (Propidiumiodid, PI, wie angezeigt mit roter Fluoreszenz) Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gemäß der Anleitung. Die Lebensfähigkeit der Bakterien wurde für antimikrobielle Tests quantifiziert, die zeigten, dass fast alle mit Nanomaterial behandelten Bakterien nach der Behandlung abgestorben waren. Eine ähnliche Lebensfähigkeit wurde durch die CFU-Zählmethode quantifiziert, um die effiziente antibakterielle Wirkung von Materialien in der PDT zu bestimmen. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n =6).

ROS-Erkennung [23, 29, 34, 35, 49,50,51,52,53,54,55]

Singulett-Sauerstoff ( ¹ O₂ )

(a) Material (3 oder 6 μg mL ⁻¹ ) wurde mit Bakterien behandelt (OD₆₀₀ ~ 0.05), danach wurde es 3 h bei 37 C im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurde die Mischung einer TPE-Photoanregung (211.2 nJ pixel ⁻¹ , 800 Scans; Ex, 760 nm) und schließlich mit Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG) Reagenz (1µM; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gemischt (Ex/Em:488/525 nm). Für die Messungen wurde ein Fluoreszenzspektrometer verwendet. Zur ROS-Neutralisation wurde die Mischung mit 30 ppm des Antioxidans α . gemischt -Tocopherol/Methyllinoleat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) im Dunkeln und mit der gleichen Behandlung einer TPE-Photoanregung ausgesetzt. (b) Material (3 oder 6 μg mL ⁻¹ ) wurde mit Bakterien behandelt (OD₆₀₀ ~ 0.05), danach wurde es 3 h bei 37 C im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurde die Mischung einer TPE-Photoanregung (211.2 nJ pixel ⁻¹ , 800 Scans; Ex, 760 nm) und schließlich mit 10 μM trans-1-(2′-methoxyvinyl)pyren (t -MVP, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)/0,10 M SDS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) (Ex/Em:352/465 nm). Zur ROS-Neutralisation wurde die Mischung mit 30 ppm des Antioxidans α . gemischt -Tocopherol/Methyllinoleat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) im Dunkeln. Reaktion von t -MVP mit ¹ O₂ ergibt ein Dioxetan-Zwischenprodukt, das fluoresziert, während es sich in 1-Pyrencarboxaldehyd zersetzt. Darüber hinaus reagiert diese hochselektive Fluoreszenzsonde nicht mit anderen aktivierten Sauerstoffspezies wie Hydroxylradikalen, Superoxid oder Wasserstoffperoxid. Für die Messungen wurde ein Fluoreszenzspektrometer verwendet. Die ROS-Neutralisation wurde mit der gleichen Behandlung wie zuvor beschrieben durchgeführt.

Superoxid-Radikalanion (O₂ ^.− )

(a) Material (3 oder 6 μg mL ⁻¹ ) wurde mit Bakterien behandelt (OD₆₀₀ ~ 0.05), danach wurde es 3 h bei 37 C im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurde die Mischung einer TPE-Photoanregung (211.2 nJ pixel ⁻¹ , 800 Scans; Bsp., 760 nm) und schließlich mit 2, 3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carbonsäureanilid (XTT, 0,45 mM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO .) vermischt , VEREINIGTE STAATEN VON AMERIKA). Der Zweck dieses Materials bestand darin, dass es mit O₂ . interagierte ^{. −} und produzierte XTT-Formazan, was zu einer starken Absorption (470  nm Wellenlänge) führte. Zur Überwachung dieser Absorption wurde ein UV-Vis-Spektrometer verwendet. Zur ROS-Neutralisation wurde die Mischung mit 30 ppm des Antioxidans α . gemischt -Tocopherol/Methyllinoleat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) im Dunkeln und mit der gleichen Behandlung einer TPE-Photoanregung ausgesetzt. (b) Material (3 oder 6 μg mL ⁻¹ ) wurde mit Bakterien behandelt (OD₆₀₀ ~ 0.05), danach wurde es 3 h bei 37 C im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurde die Mischung einer TPE-Photoanregung (211.2 nJ pixel ⁻¹ , 800 Scans; Ex, 760 nm) und schließlich mit 50 mM Bicarbonatpuffer (pH 8,60) und Glutathion (γ -l-glutamyl-l-cysteinyl-glycine, GSH, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)/0,80 µM Bicarbonatpuffer (Ellmans Assay für O₂ ^{. −} Erkennung). Anschließend wurden die folgenden Experimente gemäß dem Verfahren in einer früheren Studie durchgeführt. Der GSH-Verlust (%) wurde als Extinktionsdifferenz zwischen Probe und Negativkontrolle dividiert durch die Extinktion der Negativkontrolle berechnet. Das Signal des erzeugten O₂ ^{. −} wurde wie in der vorherigen Berechnung beschrieben erhalten. Daten sind Mittelwerte ± SD (n =6).

Aufnahmetest [35]

E. coli (OD₆₀₀ ~ 0,05) wurden mit 3 μg mL ⁻¹ . inkubiert Material. Die Extinktion einer Menge von 3 μg mL ⁻¹ Material wurde durch UV-Vis-Spektroskopie (Abs, ungefähr 203 nm) aufgezeichnet. Die Materialien wurden mit E gemischt. coli (OD₆₀₀ ~ 0.05) bei 37 °C von der 1. Der Extinktionsunterschied zwischen dem gesammelten Überstand und den Originalmaterialien wurde geschätzt, was zu dem Prozentsatz der Aufnahme zu jedem Zeitpunkt führte. Daten sind Mittelwerte ± SD (n =6).

Statistische Analyse [56]

Die statistische Signifikanz wurde durch die Varianzanalyse bestimmt. Die p Wert wurde für alle Behandlungen als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung von wasserlöslichem Fullerenol

Wasserlösliches C₆₀ (OH)₄₆ (Fullerenol), das als zirkulär und monodispers bestimmt wurde, wurde gemäß einer früheren Studie synthetisiert [27]. Die mittlere laterale Größe des Fullerenols betrug ungefähr 1,13 ± 0,04 nm, wie unter Verwendung von schwacher Vergrößerung (Abb. 2a) und HR-TEM-Bildern (Abb. 2b) bestimmt wurde. Darüber hinaus zeigte das Fullerenol eine günstige Kristallinität zusammen mit einem guten Gitterabstand, der dem d -Abstand der Fullerenol-{1\(\overline{1}\)00}-Gitterstreifen. Diese Partikel könnten jedoch in einer wässrigen Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 durch Wasserstoffbrückenbindungen Aggregate bilden. Die durchschnittliche Größe der gebildeten Aggregate betrug ungefähr 130 nm, wie eine DLS-Analyse ergab. Darüber hinaus blieben die Aggregate in verschiedenen physiologischen Umgebungen, wie einer wässrigen Lösung mit pH 7,0, 1 × phosphatgepufferter Kochsalzlösung und Kulturmedium, 3 Monate lang hochstabil (Zusatzdatei 1:Tabelle S1). Im UV-vis-Absorptionsspektrum des Fullerenols wurden Absorptionspeaks bei ungefähr 216 und 309 nm beobachtet, und diese Peaks wurden dem π . zugeschrieben –π * Übergang aromatischer C=C-Bindungen und der n –π * Übergänge der C=O-Schulter bzw. Die π -Elektronenübergang im Fullerenol enthaltenden Sauerstoff (Fig. 2c), wie er typischerweise für wässrige Dispersionen beobachtet wird, wodurch die Anwesenheit des Fullerenols bestätigt wird. Zusätzliche Charakterisierungen wurden mit FTIR, XPS und Massenspektrometrie durchgeführt, um die Eigenschaften der hergestellten Materialien zu bestätigen. FTIR wurde verwendet, um die exponierten funktionellen Gruppen der hergestellten Materialien zu analysieren. Die Analyseergebnisse zeigten die folgenden charakteristischen Materialbänder:ein C–O-Streckband bei ca. 1109 cm ⁻¹ (Band 1), phenolisches C-OH-Streckband bei ungefähr 1271 cm ⁻¹ (Band 2), tertiäres alkoholisches C=O-Streckband bei ungefähr 1422 cm ⁻¹ (Band 3), C=C-Streckband bei ungefähr 1674 cm ⁻¹ (Band 4), C=O-Streckband bei ungefähr 1721 cm ⁻¹ (Bande 5) und intermolekulare C-H-Wasserstoffbrücken- und Carboxylat-OH-Streckbande bei ungefähr 3318 cm ⁻¹ (Band 6). Außerdem ist eine CO₂ .-Bande Störungen beobachtet wurden. Diese Banden zeigten exponierte Hydroxyl- und Carbonylgruppen sowie aromatische C=C-Bindungen (Abb. 2d). XPS wurde durchgeführt, um die Oberflächenchemie des Fullerenols zu untersuchen, das im Allgemeinen überwiegend Kohlenstoffatome enthält. Die entfalteten C(1s)-Spektren des Fullerenols zeigten einen nichtoxygenierten Ring (C–C/C=C, 286,1 eV), eine C–O-Bindung (286,9 eV) und eine C=O-Bindung (288.0 eV). Außerdem betrug das O(1s)/C(1s)-Verhältnis ungefähr 35,8% (Abb. 2e). Das Molekulargewicht des Fullerenols wurde ebenfalls mittels FD-Massenspektrometrie bestimmt (Zusatzdatei 1:Abb. S2); the number of hydroxyl groups (C–OH) was confirmed to be 46, which was consistent with the atomic ratios and bonding compositions of the fullerenol summarized in Fig. 2. These characterization results confirm the successful synthesis of fullerenol.

Functional characterization of the synthesized water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ fullerenol. a Low-magnified TEM image and b HR-TEM image of a water-soluble fullerenol illustrating the materials {1\( \overline{1} \)00} lattice planes and the mean size of 1.11 ± 0.03 nm with a d -spacing of 0.213 nm. c UV–vis and d FTIR spectra of nanomaterial. e Deconvoluted C(1s) XPS spectra and fitted peaks obtained using Gaussian function:nonoxygenated ring (C–C/C=C), C–O bond, and C=O bond, respectively. The atomic ratio and bonding composition of fullerenol are shown as summarized in the table. The O(1s)/C(1s) atomic ratio is 35.8%

ROS Generation of Water-Soluble Fullerenol Under TPE

A PS absorbs and transfers light energy to other nonabsorbing molecules to generate ROS, which kill targeted cells, damage tumor vasculature, and activate an antitumor immune response. PSs have a particular arrangement of electrons in their molecular orbitals. Similar to nearly all molecules, at ground (singlet) state, PSs have couples of electrons with opposite spins in low-energy molecular orbitals. The absorption of light at an appropriate wavelength lifts an electron to a high-energy orbital without changing its spin. This is a short-lived (nanoseconds) excited singlet (S₁ ) state, and the PS can lose its energy and return to the ground state by emitting light (fluorescence) or heat. Alternatively, intersystem crossing, wherein the spin of the excited electron is inverted, can occur in the S₁ Zustand. This electron spin inversion is responsible for the relatively long life (lasting microseconds) of the excited triplet (T₁ ) state. Radiative triplet-to-singlet transitions are inhibited because they require a change in electron spin, which is a slow process. From the T₁ state, the PS can return to the ground state by emitting light (phosphorescence) or transferring energy to another molecule. It can also lose energy through internal conversion or radiationless transitions when colliding with other molecules. The longer the life of the PS in the T₁ state is, the higher are its chances of colliding with another molecule, resulting in ROS production [57,58,59]. The photosensitization of water-soluble fullerenols results in their transition to a long-lived T₁ state and subsequent energy or electron transfer to molecular oxygen, yielding ROS such as ¹ O₂ and O₂ ^{. −} , which have major roles in PDT. Therefore, ¹ O₂ and O₂ ^{. −} produced by water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ must be detected directly using laser irradiation. To detect ¹ O₂ and O₂ ^{. −} formation during PDT, in this study, PDT was initiated by combining excited the triplet water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ , oxygen, and light configured to a suitable wavelength and energy as well as by introducing SOSG, t -MVP, XTT, and GSH reagents [33, 34, 49,50,51]. To exploit the potential bactericidal capability of the materials, a wavelength of approximately 760 nm was determined to be the most efficient for deriving the relative maximum TPA ratio of the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ under TPE (Fig. 3a); this is attributable to the interband transitions involved [52]. This wavelength was used in subsequent experiments in this study. The water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ was photoexcited through TPE at a power of 211.2 nJ pixel ⁻¹ with 800 scans (Ex, 760 nm; total effective exposure time, ~ 3.2621 s) and delivered dose of 3 or 6 μg mL ⁻¹ (Additional file 1:Table S2). Furthermore, to confirm the involvement of ROS in the PDT effects of the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ , α -tocopherol was used for ROS neutralization [49, 53]. The quantity of generated ROS was reduced after the addition of α -tocopherol, but the observed bacterial viability increased as expected. Additionally, the quantity of generated ROS depended on the delivered dose. To prevent ¹ O₂ and O₂ ^{. −} production possibly engendered by inadvertent exposure of water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ to white light—which could have compromised the experiments in this study [60]—subsequent PDT experiments were conducted in the dark. This study focused on the quantities of generated ¹ O₂ and O₂ ^{. −} . The water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ exhibited considerable antibacterial effects, demonstrating its potential for application in PDT. Notably, after the same experiment, the water-soluble C₆₀ (OH)₂₁ (Additional file 1:Figs. S3, S4; Fig. 3a) was less effective in forming ¹ O₂ and O₂ ^{. −} when compared with the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ (Additional file 1:Table S2). The water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ generated more ¹ O₂ and O₂ ^{. −} than did the water-soluble C₆₀ (OH)₂₁; additionally, the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ and water-soluble C₆₀ (OH)₂₁ had Φ _Δ values of approximately 0.93 and 0.85, respectively (for reference, Φ _Δ =0.64 is the QY of TSPP dissolved in D₂ O [29, 30]).

a Relative TPA spectra of the material. TPE as a function of the wavelength (720–820 nm) at 98.56 nJ pixel ⁻¹ that was used to monitor the signals. Delivered dose, 3 μg mL ⁻¹ water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ or C₆₀ (OH)₂₁ fullerenol. The number of surviving b material-treated bacteria was determined by CFU counting assay and is expressed as the percentage (%) for c bacteria that corresponds to the unit of CFU mL ⁻¹ . Delivered dose, OD600 ~ 0.05 of E. coli and 0–9 μg mL ⁻¹ water-soluble fullerenol. d Measurement of phosphorescence spectra at 1270 nm for material. Delivered dose, 3 μg mL ⁻¹ water-soluble fullerenol. Data are means ± SD (n =6)

Antimicrobial Ability Determination Using TPE

Before the execution of antimicrobial experiments, the toxicity of water-soluble fullerenols must be examined to exclude factors that could contribute to bacterial elimination and confound experimental results. In addition, to prevent possible ROS production engendered by the inadvertent exposure of experimental materials to white light, which could confound experimental results [35], PDT experiments must be conducted in the dark. This study applied Gram-negative E. coli as the experimental template. A CFU counting assay was conducted to determine the number of surviving bacteria (expressed herein as a percentage, corresponding to CFU mL ⁻¹ ). The bacteria were treated with two types of the prepared water-soluble fullerenols (dose range, 0 to 9 μg mL ⁻¹ ) and incubated in the dark for 3 h at 37 °C to determine absorbance at 600 nm (OD₆₀₀ ~ 0.05; Additional file 1:Fig. S1). The growth levels of the bacteria treated with the water-soluble fullerenols were first monitored by measuring absorbance at 600 nm. The initial absorbance was 0.05 OD₆₀₀ , and the absorbance associated with both materials reached approximately 0.37 over time. Accordingly, neither material inhibited bacterial proferation. Moreover, the materials engendered a nearly 0 log₁₀ reduction in the number of surviving bacteria (Fig. 3b), corresponding to a viability of approximately 100% (Fig. 3c). Accordingly, the materials were determined to exhibit excellent biocompatibility with the bacteria. Consequently, the materials subjected to 3 h of incubation in the dark at 37 °C were used to conduct experiments. Although the water-soluble fullerenol could generate ROS, interactions between materials and reagents (i.e., SOSG, t -MVP, XTT, and GSH) may result in false-positive ROS signals, thereby confounding PDT results [52]. Therefore, to exclude this possibility, bacteria were introduced and treated with materials in the present study. The amount of ROS generated from the photoexcited material-treated E. coli was observed. Table 2 presents the observed amount of ROS, revealing a similar trend to that in Tables S2–S3 (Additional file 1:materials alone and material-treated-Gram-positive Bacillus subtilis (B. subtilis )); these results were consistent with the ¹ O₂ phosphorescence signal emitted from the materials at 1270 nm (Fig. 3d). PDT against E. coli was performed using irradiation with a low dose of energy (211.2 nJ pixel ⁻¹ with 800 scans, total effective exposure time ~ 3.2621 s; Ex, 760 nm). The effects PDT on the viability of E. coli treated with two-photon photoexcited materials were then determined (Fig. 4). No bactericidal effects were observed on bacteria alone (with or without laser exposure) or on the panel of material-treated bacteria without laser treatment (Fig. 4a). After TPE, bacterial viability was relatively low; specifically, the viability observed for the panel that was treated with the water-soluble C₆₀ (OH)₂₁ was nearly 15%, corresponding to an approximately 0.823 log₁₀ reduction (Fig. 4b). By contrast, the bacterial viability observed for the panel treated with the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ was approximately 0 (100% elimination efficiency, corresponding to a ~ 7.736 log₁₀ reduction). When the dose was increased, complete bactericidal effects were observed for both materials (Fig. 4c, d). However, antimicrobial effects did not differ by bacteria type (Gram-negative E. coli or Gram-positive B. subtilis ) after photoexcitation (Additional file 1:Fig. S5). In addition, regarding the fullerenols that eliminated bacteria, a higher composition of hydroxyl groups increased bactericidal capability when compared with a lower composition under identical treatment conditions.

Viability (%) was quantified according to the determined viable count of material-treated bacteria through a CFU assay conducted using short excitation with a TPE power of 211.2 nJ pixel ⁻¹ with 800 scans (approximately 3.2621 s of total effective exposure time; Ex, 760 nm) to deliver a dose of a , b 3 or c , d 6 μg mL ⁻¹ . Delivered dose, OD600 0.05 of E. coli . Data are presented as means ± SD (n =6). For C₆₀ (OH)₄₆ - and C₆₀ (OH)₂₁ -treated E. coli with photoexcitation, a p <0.001 and p =0.662, b p <0.001 and p =0.658, c p <0.001 and p <0.001, and d p <0.001 and p <0.001. *p value obtained by Student’s t testen

Observation of Water-Soluble Fullerenol-Treated E. coli Using TEM and Investigation of Two-Photon Properties

To observe the disruption of material-treated bacteria after photoexcitation, the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ with high PDT efficiency was selected, and bacteria were imaged using TEM. Bare E. coli (Fig. 5a) were incubated with the water-soluble fullerenol for 3 h, resulting in the substantial adsorption of materials on the bacterial surfaces. Nevertheless, no unusual morphologies were observed, indicating normal live bacterial morphology (Fig. 5b). Uptake assay results revealed the adsorption of materials onto the bacterial surface, with the corresponding burst rate being approximately 85% within the first 3 h of incubation (Fig. 5c); the rate reached saturation from the 3rd to the 10th hour. Therefore, the materials were adsorbed and formed an external barrier on the bacterial surface. However, the E. coli exhibited a distorted appearance and severe morphological changes over 3 days of incubation (Fig. 5d), resulting in a 0.940 log₁₀ reduction that corresponded to a nearly 18% viability (Fig.5f; Additional file 1:Fig. S6). Material absorption and coating on the bacterial surface suppressed the absorption of nutrients essential for microbial growth and engendered changes in membrane (wall) permeability, thereby inducing internal osmotic imbalances and inhibiting microbial growth. In other words, the water-soluble fullerenol had antibacterial (bacteriostatic or bactericidal) effects after 3 days of incubation. Furthermore, the photoexcited material-treated bacteria, particularly E. coli , exhibited unique morphologies with severe damage after 3 h of incubation (Fig. 5e, f; Additional file 1:Fig. S6). No heat-generated bubbles formed on the bacterial surface incurred damage, indicating that the water-soluble fullerenol did not have photothermal-mediated heat properties after photoexcitation (Additional file 1:Fig. S7). The viability of E. coli was also determined through fluorescence and quantification (Fig. 6). The green fluorescence indicative of living bacteria in Fig. 6a reveals that the bacteria exposed to laser treatment alone were largely undamaged, which is consistent with the results presented in Fig. 5a. Dead bacteria were detectable after treatment with the materials and laser exposure (red fluorescence in Fig. 6b), a finding that is also consistent with that in Fig. 5e. Bacterial viability was quantified for further antimicrobial testing. Nearly complete elimination of the material-treated bacteria (Fig. 6c) was observed. Viability was also quantified using a CFU assay (Figs. 4a, b and 5f, and Additional file 1:Fig. S6) to demonstrate the antibacterial efficiency of the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ in PDT. According to the results in Figs. 4, 5, and 6; Table 2; and Table S2 (Additional file 1), E. coli treated with the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ was susceptible to photoexcitation, leading to a higher death rate, increased ROS generation, and more severe morphological collapse compared with E. coli treated with the water-soluble C₆₀ (OH)₂₁ . In general, the absolute cross section for TPE makes fluorophores efficient for nonlinear microscopic studies because the ratio of the energy absorbed to the input energy flux to a specimen is high, thereby minimizing possible photodamage to specimens [39, 40]. When two-photon techniques are used to image molecular activities in living biological preparations and turbid tissues, a favorable cross section is desirable [61]. In the present study, the absolute cross section for TPE calculated for the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ was approximately 1037 GM (Goeppert-Mayer unit, with 1 GM =10 ⁻⁵⁰ cm ⁴ s photon ⁻¹ ) at a 760-nm excitation wavelength (fluorescein was the standard reference for the cross section [39, 40]; Fig. 1b and Tables 1 and 3); the absolute cross section calculated for the water-soluble C₆₀ (OH)₂₁ was approximately 1230 GM, which is similar to values obtained in relevant studies [62, 63]. These absolute cross sections could facilitate the two-photon process. Moreover, the fluorescence of the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ was illuminated through a two-photon process (Fig. 1b). The relative fluorescence QY was approximately 0.02 (the QY of Cy5.5 in dimethyl sulfoxide [31] served as a reference:QY_ref =0.28); similarly, the absolute QY [64] was approximately 0.01, and the same QYs were derived for one-photon excitation and TPE [31]. By contrast, the water-soluble C₆₀ (OH)₂₁ had lower relative and absolute QYs (0.06 and 0.05, respectively). In addition, this study investigated the lifetime of the fullerenols. The effects of radiative and nonradiative decay rates on QY and lifetime were calculated. The average lifetime of the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ was approximately 7.797 ns, as calculated from observed lifetimes of 0.149, 1.775, and 19.679 ns; the average lifetime of the water-soluble C₆₀ (OH)₂₁ was approximately 5.251 ns (Fig. 7 and Table 4). Therefore, the ratio of radiative to nonradiative decay rates of the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ was approximately0.020 (derived from rates of approximately 2.565 × 10 ⁶ s ⁻¹ to 1.257 × 10 ⁸ s ⁻¹ ), whereas that of the water-soluble C₆₀ (OH)₂₁ was approximately 0.064 (approximately 1.143 × 10 ⁷ s ⁻¹ and 1.790 × 10 ⁸ s ⁻¹ ; Additional file 1:Table S4). This finding is attributable to the existence of a hydroxyl group on the surface of the water-soluble fullerenol, which induced the nonradiative recombination of electron–hole pairs, leading to the inhibition of intrinsic state emission. However, hydroxylgroups at the edge of the water-soluble fullerenol may have a high occupied molecular orbital. This can be attributed to the strong orbital interaction between hydroxyl groups, which could thus increase the efficiency of intersystem crossing (rather than fluorescence generation) and generate numerous nanomaterial triplets with a high composition of hydroxyl groups; therefore, this would result in a high Φ _Δ value for the water-soluble fullerenol and induce the fullerenol to react with oxygen according to the Jablonski diagram [65]. Consequently, two-photon PDT can be effectively performed using ultralow energy in an extremely short time, thereby providing an alternative approach to killing malignant species.

TEM-Bilder. a Showing bare bacteria without any treatment. Bacteria treated with material for b 3 h and d 3 days of incubation. e The photoexcited material-treated bacteria (3 h of incubation) with a TPE power of 211.2 nJ pixel ⁻¹ with 800 scans (approximately 3.2621 s of total effective exposure time; Ex, 760 nm). c Uptake assay of bacteria and material at 37 °C. f Viability (%) was quantified following the determined viable count of material-treated bacteria via CFU assay by short excitation with the same treatment. Delivered dose OD600 ~ 0.05 of E. coli and 3 μg mL ⁻¹ water-soluble fullerenol C₆₀ (OH)₄₆ . Data are means ± SD (n =6)

Images obtained after laser photoexcitation exposure (211.2 nJ pixel ⁻¹ ) with 800 scans (approximately 3.2621 s of total effective exposure time; Ex, 760 nm) of a , b material-treated bacteria. The Live/Dead kit was used to stain bacteria before images were obtained. Scale bar, 50 μm. c Viability (%) determination results. Delivered dose, OD600 ~ 0.05 of E. coli and 3 μg mL ⁻¹ water-soluble fullerenol C₆₀ (OH)₄₆ . For the percentages alive and dead, p <0.001. *p value obtained using Student’s t Prüfung. Data are presented as mean ± SD (n =6)

Time-resolved room-temperature PL decay profiles of material (98.56 nJ pixel ⁻¹ ). Excitation wavelength, 760 nm. Delivered dose, OD₆₀₀ ~ 0.05 of E. coli and 3 μg mL ⁻¹ Materialien. Data are presented as means ± SD (n =6)

Conclusions

This study revealed that a water-soluble fullerenol material with a higher composition of hydroxyl groups had superior photoproperties to those of a fullerenol material with a lower composition of hydroxyl groups; the superior photoproperties can be attributed to the reduced laser exposure and materials used for treatment. Furthermore, the water-soluble fullerenol with a higher composition of hydroxyl groups exhibited high TPA, a favorable absolute cross section for TPE, and high two-photon stability. Therefore, this fullerenol has potential as a two-photon PS in two-photon PDT coupled with TPE. This property is probably due to the presence of a hydroxyl group on the surface of the water-soluble fullerenol, which caused the nonradiative recombination of electron–hole pairs, leading to the inhibition of intrinsic state emission. Moreover, hydroxyl groups at the edge of the water-soluble fullerenol may have a high occupied molecular orbital; this may be ascribed to the strong orbital interaction between the hydroxyl groups, thereby increasing intersystem crossing (rather than fluorescence generation) efficiency and generating numerous material triplets with a high composition of hydroxyl groups. Therefore, the water-soluble fullerenol would have a high Φ _Δ value and react with oxygen according to the Jablonski diagram. Consequently, two-photon PDT can be effectively performed using ultralow energy in an extremely short time. Accordingly, this efficient alternative approach to managing malignant species presents possibilities for future clinical applications.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

All datasets are presented in the main paper.

Abkürzungen

PS:

Photosensibilisatoren

QY:

Quantum yield

PDT:

Photodynamische Therapie

UV–vis:

Ultraviolett – sichtbar

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies

ψ _Δ :

Singlet oxygen QY

NIR:

Nahinfrarot

TPE:

Two-photon excitation

E. coli :

Escherichia coli

HR-TEM:

Hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopie

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

FTIR:

Fourier-Transformations-Infrarot

XPS:

Röntgenphotoelektronenspektroskopie

FD:

Field desorption

KBE:

Colony forming unit

TSPP:

Meso -tetra(4-sulfonatophenyl)porphine dihydrochloride

PL:

Photolumineszenz

DMSO:

Dimethylsulfoxid

OPE:

One-photon excitation

TPA:

Zwei-Photonen-Absorption

TPL:

Two-photon luminescence

ti-sa:

Titanium-sapphire

NA :

Numerische Apertur

FLIM:

Fluorescence lifetime imaging microscopy

¹ O₂ :

Singlet oxygen

SOSG:

Singlet Oxygen Sensor Green

t -MVP:

Trans-1-(2′-methoxyvinyl)pyrene

O₂ ^{. −} :

Superoxide radical anion

XTT:

2, 3-Bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide

GSH:

Glutathione, γ -l-glutamyl-l-cysteinyl-glycine

S₁ :

Singlet

T₁ :

Triplet

B. subtilis :

Bacillus subtilis

GM:

Goeppert-Mayer