Wasserlösliches Fullerenol mit optimierten Hydroxylgruppen verstärkt Zwei-Photonen-Photodynamische Inaktivierung infektiöser Mikroben

Zusammenfassung

Es wurde erfolgreich wasserlösliches Fullerenol [C₆₀(OH)₄₆] hergestellt, das einen hohen Singulett-Sauerstoff-Quantenausbeute aufwies und effizient reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzeugte. Zudem besaß das wasserlösliche C₆₀(OH)₄₆ mit höherer Zusammensetzung exponierter Hydroxylgruppen eine überlegene Zwei-Photonen-Stabilität und -Eigenschaften im Vergleich zu jenem mit geringerer Hydroxylgruppenzusammensetzung. Daher kann das hergestellte Fullerenol als effektiver Zwei-Photonen-Photosensibilisator dienen. Das wasserlösliche C₆₀(OH)₄₆ zeigte günstige Zwei-Photonen-Eigenschaften. Während der Zwei-Photonen-Photodynamischen Therapie erzielte es bei einer ultraniedrigen Energiedosis von 211,2 nJ Pixel⁻¹ mit 800 Scans und einer Photoanregungswellenlänge von 760 nm eine substantielle antimikrobielle Aktivität gegen Escherichia coli.

Einleitung

In den vergangenen Jahrzehnten wurden verschiedene Photosensibilisator-Moleküle (PS) synthetisiert [1]. Klinische Anwendungen existierender PSs sind jedoch mit Problemen behaftet. Die meisten PS-Moleküle sind hydrophob und aggregieren leicht in wässrigen Medien, was ihren Quantenausbeute (QY) verringert [2]. Zudem können aggregierte PSs nicht einfach intravenös injiziert werden. Eine selektive Anreicherung von PS-Molekülen in krankem Gewebe ist erforderlich, um Schäden an gesunden Zellen zu vermeiden. Die Entwicklung effektiver PS-Träger bleibt daher eine große Herausforderung für die Photodynamische Therapie (PDT). Entsprechend wächst das Interesse an Nanopartikeln als PS-Träger.

Fortschritte in der Nanobiotechnologie haben das Interesse an biomedizinischen Anwendungen einer neuen Klasse von Nanostrukturen [3–10] stimuliert, die ausschließlich aus Kohlenstoffatomen bestehen: Fulleren C₆₀, spheroidale Moleküle (0,72 nm Durchmesser), die ungiftig sind und einzigartige physikochemische Eigenschaften besitzen. Die geringe Größe lipophiler C₆₀-Moleküle bewirkt sterische Kompatibilität mit biologischen Molekülen und fördert ihre Integration in hydrophobe Membranbereiche [12, 13]. Aufgrund des erweiterten π-konjugierten Systems ihrer Molekülorbitale absorbiert Fulleren C₆₀ UV-vis-Licht und kann ROS mit nahezu 100 % Singulett-Sauerstoff-QY (Φ_Δ) erzeugen. Die physikochemischen Eigenschaften ermöglichen ROS-Generierung und Einsatz als PS für PDT. Fulleren können auch prooxidative Effekte induzieren, abhängig vom verwendeten Fulleren, Zelltyp und experimentellem Setup [14–17]. C₆₀ hat extrem geringe Löslichkeit in polaren Lösungen, was medizinische Anwendungen stark limitiert. Aufgrund von Doppelbindungen lässt sich C₆₀ jedoch leicht chemisch modifizieren, um die Wasserlöslichkeit zu erhöhen. Daher bieten wasserlösliche C₆₀-Derivate erweiterte medizinische Anwendungsmöglichkeiten, einschließlich Neuroprotektion, Wirkstoff- und Gentransfer, Photosensibilisierung und Biosensing.

Multiphotonen-Lasermikroskopie (Zwei-Photonen-Lasermikroskopie) nutzt lokalisierte „nichtlineare“ Anregung, um Fluoreszenz nur in einer dünnen, rastergescannten Ebene zu erregen. Sie wurde in verschiedenen Imaging-Studien eingesetzt [18]. Typischerweise wird sie mit Nahinfrarot (NIR)-Laseranregung gekoppelt, um die maximale Gewebetransmission für Bioimaging zu nutzen; NIR bietet Vorteile wie geringe Streuung, niedrige Energieabsorption, optimale Bestrahlungsdurchdringung und reduziertes Photobleaching [19, 20] und ist die bevorzugte Technik für Fluoreszenzmikroskopie in dickem Gewebe und tieferen biologischen Proben [21, 22]. Aufgrund ultraniedriger Energie und kurzer Photoanregung gilt Zwei-Photonen-Lasermikroskopie als Alternative zur PDT [23]. Obwohl einige PSs toxisch sind [24, 25], werden solche mit hoher Φ_Δ für PDT priorisiert. Ein hoher Φ_Δ-Wert ist besonders wünschenswert bei Zwei-Photonen-Techniken zur Evaluation molekularer Aktivitäten in Photoproperties und effizienten nichtlinearen mikroskopischen Studien, da das Verhältnis absorbierter Energie zum eingestrahlten Energiefluss hoch ist, was mögliche Photodamage minimiert [26]. Die Literatur enthält jedoch keine Studien, die Materialien mit Zwei-Photonen-Eigenschaften für PDT in Betracht ziehen. Um diese Forschungslücke zu schließen, wendete die vorliegende Studie wasserlösliches hydroxyliertes Fullerenol mit starker Elektronendonatorfähigkeit und großem π-konjugiertem System an, um die Ladungstransfereffizienz zu erhöhen und Zwei-Photonen-Eigenschaften zu verbessern. Speziell wurde wasserlösliches hydroxyliertes C₆₀(OH)₄₆ hergestellt und als Zwei-Photonen-PS für effektive Mikrobenentfernung mittels ultraniedrigenergetischer Femtosekundenlaserbestrahlung und nur 800 Scans unter Zwei-Photonen-Anregung (TPE; Anregungswellenlänge 760 nm) eingesetzt. Bei der ultraniedrigenergetischen Femtosekundenlaserbestrahlung betrug die Energie 211,2 nJ Pixel⁻¹ und die Leistung 2,112 mW (zur Berechnung der Laserleistung nach dem Objektiv siehe „Materialien und Methoden“ und Abb. 1a, wo die x-y-Fokalpunkt- und z-Achsen-Auflösung des Lasersystems ca. 0,37538 bzw. 0,90159 µm betragen); beim Scannvorgang betrug die gesamte effektive Belichtungszeit ca. 3,2621 s, Scanrate 4,0776 ms Scan⁻¹, Scanbereich 200 × 200 µm² (Details siehe „Materialien und Methoden“). Das wasserlösliche hydroxylierte C₆₀(OH)₄₆ erreichte eine nahezu 100 %ige Elimination von Escherichia coli (E. coli, Gram-negativer Bakterienstamm). Darüber hinaus zeigte wasserlösliches C₆₀(OH)₄₆ mit höherer Hydroxylgruppenzusammensetzung überlegene Zwei-Photonen-Photoproperties im Vergleich zu geringerem Hydroxylgruppenanteil unter TPE; daher kann das hergestellte wasserlösliche C₆₀(OH)₄₆ als vielversprechend für simultane PDT zur Elimination maligner Mikroben angesehen werden.

Abbildung 1. a Z-Achsen-Scan eines Golddünnfilms zur Messung des Second-Harmonic-Generation-Signals an verschiedenen Positionen: z-Achsen-Auflösung des Lasersystems (FWHM) beträgt ca. 0,90159 µm (Gauß-Fit). b TPL-Intensitätsabhängigkeit von der Anregungsleistung (logarithmisch) der Materialien und Fluorophore; TPE-Exposition von 704,0 bis 2816,0 nJ Pixel⁻¹ für Rhodamin B und Fluorescein, von 1408,0 bis 2816,0 nJ Pixel⁻¹ für wasserlösliches C₆₀(OH)₂₁ Fullerenol, und von 1760,0 bis 2816,0 nJ Pixel⁻¹ für wasserlösliches C₆₀(OH)₄₆ Fullerenol. Anregungswellenlänge 760 nm. Applizierte Dosis: OD₆₀₀ 0,05 E. coli und 3 µg mL⁻¹ Materialien. Daten als Mittelwert ± SD (n = 6).

Materialien und Methoden

Herstellung und Charakterisierung wasserlöslicher Fullerenole, C₆₀(OH)₂₁ und C₆₀(OH)₄₆ [27]

Rohes Fulleren wurde kommerziell bezogen (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), und der C₆₀(OH)₁₂-Vorläufer wurde wie zuvor beschrieben hergestellt. Zunächst wurde 30 %ige Wasserstoffperoxidlösung (100 ml) zum Ausgangsmaterial, 0,5–1,0 g C₆₀(OH)₁₂, gegeben und die Mischung bei 60 °C unter Luft kräftig gerührt. Nach Abkühlung wurde ein Lösungsmittelmix aus 2-Propanol, Diethylether und Hexan (je 100–200 ml) zugegeben, anschließend zentrifugiert und dekantiert. Der verbleibende Feststoff wurde zweimal mit 200 ml Diethylether durch Zentrifugation und Dekantation gewaschen. Schließlich wurden die Endprodukte wasserlösliches C₆₀(OH)₂₁ und C₆₀(OH)₄₆ durch Trocknung des Rückstands unter Vakuum bei Raumtemperatur über Nacht erhalten. Das Gewicht des Endprodukts wurde durch thermogravimetrische Analyse kalibriert. Die Morphologie wurde per Hochauflösender Transmissionselektronenmikroskopie (HR-TEM, JEOL 3010, Akishima, Tokyo, Japan) bei ~1,11 ± 0,03 nm bzw. 1,13 ± 0,04 nm Auflösung für C₆₀(OH)₂₁ und C₆₀(OH)₄₆ beobachtet. Dynamische Lichtstreuung (DLS, Malvern Nano-ZS90, Worcestershire, UK) bestimmte die Partikelgröße. Die exponierten Funktionsgruppen wurden durch Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR, RX1, PerkinElmer, Waltham, MA, USA) untersucht. UV-vis-Spektroskopie erfolgte mit Spektrometer (U-4100, Hitachi, Chiyoda-ku, Tokyo, Japan). Die Oberflächenchemie des Fullerenols wurde durch Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS, PHI 5000 Spectrometer VersaProbe, Chanhassen, MN, USA) analysiert. Das Molekulargewicht wurde per Felddesorptions-(FD)-Massenspektrometrie (AccuTOF, GCx-plus, JEOL, Akishima, Tokyo, Japan) bestimmt; die Hydroxylgruppenzahl wurde als 21 bzw. 46 bestätigt.

Bakterienkulturen [28]

E. coli (eigene Laborstämme) wurden in Nähragar LB (pro Liter: Trypton 10 g, Hefeextrakt 5 g, Natriumchlorid 8 g, Agar 15 g, pH 7,5) (Sigma-Aldrich) bei 37 °C inkubiert.

Biokompatibilitätsassay mit Colony Forming Unit (CFU)-Zählmethode [28]

E. coli (OD₆₀₀ ~ 0,05) wurde mit Material (0–9 µg ml⁻¹) versetzt und 3 h bei 37 °C inkubiert (Zusatzdatei 1: Abb. S1). Nach Inkubation wurde die Mischung zentrifugiert, Bakterienpellets verdünnt (OD₆₀₀ ~ 0,05) und ein Verdünnungsfaktor von 10⁻⁵ bis 10⁻⁸ auf Agarplatten gebracht. Übernachtinkubation bei 37 °C. Überlebende Bakterien wurden als Prozentsatz (%) in CFU ml⁻¹ bestimmt. Daten als Mittelwert ± SD (n = 6).

Φ_Δ-Messung [29, 30]

Φ_Δ wurde in D₂O bei 355 nm gemessen, mit meso-Tetra(4-sulfonatophenyl)porphin-Dihydrochlorid (TSPP; Sigma-Aldrich) als Referenz (Φ_Δ = 0,64).

Fluoreszenz-QY-Messung [31, 32]

Die relative Photolumineszenz (PL)-QY des Kontrastmittels ist das Verhältnis emittierter zu absorbierter Photonen:

$$ \mathrm{QY}={\mathrm{QY}}_{\mathrm{ref}}\ (\eta^2/{\eta_{\mathrm{ref}}}^2)(I/A)({A}_{\mathrm{ref}}/{I}_{\mathrm{ref}}) $$ (1)

mit QY_ref = 0,28 (Cy5.5 in DMSO), η = Brechungsindex ddH₂O = 1,33 (η_ref DMSO = 1,48), I integrierte Fluoreszenzintensität, A Absorbanz bei Anregungswellenlänge. Ein-Photonen-Anregung (OPE) und TPE liefern gleiche QY.

Femtosekundenlaser-Optisches System für TPA- und TPL-Messungen [23, 28, 33–38]

Ein selbstgebautes Femtosekunden-Titan-Saphir-(ti-sa)-Laseroptisches System (Wiederholrate 80 MHz; Tsunami, Spectra-Physics, Santa Clara, CA, USA) wurde gemäß Vorarbeiten verwendet.

TPA-Messung

Bei Galvanometerscanner-Geschwindigkeit 2 m ms⁻¹ wurde das Anregungsspektrum bei 720–820 nm mit 2,8 mW Anregungsleistung gemessen [Leistung vor Objektiv; Leistung nach Objektiv (auf Probe) = 0,9856 mW oder 98,56 nJ Pixel⁻¹]. Dadurch wurden relative TPA-Spektren als Funktion der Anregungswellenlänge für die Fullerenole ermittelt.

TPL-Spektren-Messung

Das Material wurde TPE vom Femtosekundenlaser bei 760 nm, Scanbereich 200 × 200 µm², Frequenz 10 kHz, Belichtungszeit 1,638 s/(Scan, Pixel) = 100 µs, 128 × 128 Pixel/Scan, Pixelfläche 1562,5 × 1562,5 nm² ausgesetzt. Der Fokusfleckbereich wurde als πd²/4 berechnet, wobei d = 0,61 λ/NA der FWHM des Strahltaillenquerschnitts ist. Bei 760 nm Anregung und ×40 Öl-Immersionsobjektiv (NA 1,3) ergibt sich d = 0,61 × 800 nm/1,3 = 375,38 nm = 0,37538 µm; z-Achsen-Auflösung = 0,90159 µm. Belichtungszeit pro Scan für individuelles Nanomaterial: (Fokusfleckbereich/Pixelbereich) × 100 = 4,0776 ms; Gesamtbelichtungszeit t = 4,0776 ms × Scananzahl. Ein ×40 Öl-Immersionsobjektiv (NA 1,3) sammelte Signale; Detektionsbereich des Spektrometers 300–695 nm.

Zusätzlich wurden Laserleistungsberechnungen (mW oder nJ Pixel⁻¹) auf der Probe wie folgt durchgeführt: Für ×40 Öl-Immersionsobjektiv (NA 1,3) beträgt Transmissionsrate bei 760 nm ca. 88 %; Laserleistung vom Output zum Objektiv nur 40 % des ursprünglichen Outputs aufgrund von Verlusten. Berechnete Energie nach Objektiv (auf Probe) = P_output (mW) × 40 % × 88 % = 0,352 × P_output (mW). Beispiel: P_output = 2,8 mW → 0,9856 mW auf Probe. Bei 10 kHz Scanrate (jeder Puls 0,1 ms Pixel⁻¹) beträgt Energie auf Probe (J Pixel⁻¹) ca. P_output (mW) × 40 % × 88 % × 0,1 ms = 0,0352 × P_output (J Pixel⁻¹). Beispiel: 2,8 mW → 98,56 nJ Pixel⁻¹. Die Leistung nach Objektiv (auf Probe) wurde im gesamten Manuskript verwendet.

Messung des Absoluten TPE-Wirkungsquerschnitts [24, 36–48]

Der absolute TPE-Wirkungsquerschnitt wurde über Lumineszenzsignal per Femtosekundenlaseroptischem System gemessen. TPL von Fluorescein und Rhodamin B (Sigma-Aldrich) wurde verifiziert. Ergebnisse in Abb. 1b, ermittelt durch Messung der Emissionsintensitätsabhängigkeit bei Anregungsleistungsbereich 704 nJ Pixel⁻¹ (7,04 mW) bis 2816 nJ Pixel⁻¹ (28,16 mW). Quadratische Abhängigkeit mit Exponenten 2,03 (Fluorescein) und 2,02 (Rhodamin B) bei steigender Anregungsleistung zur Bestimmung der Lumineszenz aus TPE. Laut Literatur betragen Aktionsquerschnitte für Fluorescein und Rhodamin B 36,4 bzw. 68,0 GM (1 GM = 10⁻⁵⁰ cm⁴ s Photon⁻¹) bei 760 nm. Referenz: https://www.drbio.cornell.edu/cross_sections.html (Prof. Chris Xu, Cornell University). Berechnete TPE-Aktionsquerschnitte: 36,5 und 66,1 GM (< 5 % Abweichung). Rhodamin B wurde als Standardreferenz für Querschnittsbestimmung gewählt. Berechnete absolute TPE-Wirkungsquerschnitte für wasserlösliches C₆₀(OH)₂₁ und C₆₀(OH)₄₆: ca. 1230,51 GM bzw. 1037,21 GM. Messparameter in Tabelle 3. Keine Batch-zu-Batch-Variation bei Zwei-Photonen-Eigenschaften und -PDT-Fähigkeit.

Tabelle 1. Berechnete TPE-Wirkungsquerschnitte für Fluorescein und Rhodamin B.

Femtosekundenlaser-Optisches System (für FLIM) [39, 45]

Selbstgebautes Femtosekunden-ti-sa-Laseroptisches System (80 MHz; Tsunami, Spectra-Physics) gemäß Vorarbeiten. Lebenszeitdaten und -parameter durch Dreiexponentielle-Gleichungs-Fit bei TPE (Ex 760 nm) generiert.

Berechnung radiativer und nicht-radiativer Zerfallsraten [46]

PL-QY und Lebenszeit sind Hauptparameter bei Untersuchung der Emissionseigenschaften fluoreszierender Farbstoffe. QY (Q) lässt sich ausdrücken als:

$$ Q=\frac{\varGamma}{\varGamma + k} $$ (2)

wobei Γ radiative Zerfallsrate, k nicht-radiative Zerfallsrate. Fluoreszenzlebenszeit τ ist durchschnittliche Zeit für Elektron im angeregten Zustand zum Grundzustand:

$$ \tau =\frac{1}{\varGamma + k} $$ (3)

Aus Gleichungen (2) und (3) lassen sich radiative und nicht-radiative Zerfallsraten berechnen.

Bei Photonenabsorption wird ein schwach gebundenes Elektron des Fluorophors in höheres Energieniveau gehoben (angeregter Zustand A*). Dieser metastabile Zustand zerfällt entweder radiativ durch Fluoreszenzphotonenemission (A* → A + hν) oder nicht-radiativ durch Wärmeabgabe (A* → A + Wärme). Depopulation des angeregten Zustands hängt von verfügbaren Deaktivierungspfaden ab. Fluoreszenz ist radiative Deaktivierung des niedrigsten Schwingungsniveaus des ersten elektronisch angeregten Singulettzustands S₁ zum elektronischen Grundzustand S₀. Singulettzustände sind Energieniveaus, die ohne Spinflip besetzbar sind. Absorptions- und Emissionsprozesse werden im Jablonski-Diagramm veranschaulicht.

Fluoreszenzlebenszeit τ ist durchschnittliche Verweilzeit im angeregten Zustand S₁. τ = inverser Summe aller Depopulationsratenparameter (Gleichung 3), wobei nicht-radiative Ratekonstante k = k_ic (interne Konversion) + k_isc (Intersystem Crossing zum Triplettzustand). Fluoreszenzemission erfolgt stets vom niedrigsten Schwingungsniveau von S₁ (Kashas Regel), d. h. Fluorophor hat kein Gedächtnis des Anregungspfads; OPE und TPE liefern dasselbe Fluoreszenzspektrum, QY und Lebenszeit.

Bestimmung der Bakterienlebensfähigkeit nach Laserexposition [28]

CFU-Zählmethode

Bakterien (OD₆₀₀ ~ 0,05) + Material (3 oder 6 µg ml⁻¹), 3 h bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Nach Zentrifugation, Verdünnung (OD₆₀₀ ~ 0,05) TPE-Belichtung: 211,2 nJ Pixel⁻¹, 800 Scans (~3,2621 s effektive Gesamtbelichtungszeit; Ex 760 nm). Verdünnung 10⁻⁵ bis 10⁻⁸, Ausplattieren auf Agar, Übernachtinkubation 37 °C. Überlebende Bakterien als % (CFU ml⁻¹). Daten: Mittelwert ± SD (n = 6).

LIVE/DEAD-Kit

Gleiche Vorbehandlung wie CFU-Methode. Nach TPE-Belichtung Färbung mit LIVE/DEAD-Kit (SYTO 9 grün / Propidiumiodid rot) (Thermo Fisher Scientific) gemäß Anleitung. Bakterienlebensfähigkeit für Antimikrobielltests quantifiziert; nahezu alle nanomaterial-behandelten Bakterien tot nach Behandlung. Ähnliche Lebensfähigkeit per CFU-Methode quantifiziert für effiziente antibakterielle Effekte in PDT. Daten: Mittelwert ± SD (n = 6).

ROS-Detektion [23, 29, 34, 35, 49–55]

Singulett-Sauerstoff (¹O₂)

(a) Material (3 oder 6 µg ml⁻¹) + Bakterien (OD₆₀₀ ~ 0,05), 3 h Inkubation 37 °C Dunkel. TPE-Photoanregung (211,2 nJ Pixel⁻¹, 800 Scans; Ex 760 nm), dann Singulett-Sauerstoff-Sensor-Green (SOSG, 1 µM; Thermo Fisher) (Ex/Em: 488/525 nm). Fluoreszenzspektrometer-Messung. ROS-Neutralisation: 30 ppm Antioxidans α-Tocopherol/Methyl-linoleat (Sigma-Aldrich) im Dunkeln, gleiche TPE-Behandlung. (b) Gleiches Protokoll, aber Detektion mit 10 µM trans-1-(2'-methoxyvinyl)pyren (t-MVP, Thermo Fisher)/0,10 M SDS (Sigma-Aldrich) (Ex/Em: 352/465 nm). ROS-Neutralisation analog. Reaktion von t-MVP mit ¹O₂ ergibt fluoreszierendes Dioxetan-Intermediat, das zu 1-Pyrenkarboxaldehyd zerfällt. Hochselektiver Sonden, reagiert nicht mit anderen aktivierten Sauerstoffspezies (Hydroxylradikale, Superoxid, H₂O₂). Fluoreszenzspektrometer-Messung.

Superoxid-Radikal-Anion (O₂^•−)

(a) Material + Bakterien, 3 h Inkubation 37 °C Dunkel. TPE-Photoanregung (211,2 nJ Pixel⁻¹, 800 Scans; Ex 760 nm), dann XTT (0,45 mM; Sigma-Aldrich). XTT interagiert mit O₂^•− → XTT-Formazan, starke Absorption bei 470 nm. UV-vis-Spektrometer. ROS-Neutralisation: 30 ppm α-Tocopherol/Methyl-linoleat im Dunkeln, gleiche TPE-Behandlung. (b) Gleiches Protokoll, Detektion mit 50 mM Bicarbonatpuffer (pH 8,60) und Glutathion (GSH, γ-L-Glutamyl-L-cysteinyl-glycin, Sigma-Aldrich)/0,80 mM Bicarbonatpuffer (Ellman-Assay für O₂^•−). Weitere Experimente gemäß Vorarbeit. GSH-Verlust (%) = Differenz Absorption Probe vs. Negativkontrolle / Absorption Negativkontrolle. O₂^•−-Signal wie berechnet. Daten: Mittelwert ± SD (n = 6).

Aufnahme-Assay [35]

E. coli (OD₆₀₀ ~ 0,05) mit 3 µg ml⁻¹ Material inkubiert. Absorption von 3 µg ml⁻¹ Material per UV-vis (Abs ~ 203 nm) aufgezeichnet. Material + E. coli bei 37 °C von 1. bis 10. Stunde, zentrifugiert (1200 rpm), Überstandsabsorbanz gemessen. Differenz zur Originalabsorption = Aufnahmerate pro Zeitpunkt. Daten: Mittelwert ± SD (n = 6).

Statistische Analyse [56]

Signifikanzprüfung per Varianzanalyse. p-Wert für alle Behandlungen als signifikant betrachtet.

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung wasserlöslicher Fullerenole

Wasserlösliches C₆₀(OH)₄₆ (Fullerenol), kreisförmig und monodispers, wurde gemäß Vorarbeit [27] synthetisiert. Mittlere laterale Größe ~1,13 ± 0,04 nm (Niedrigvergrößerung Abb. 2a, HR-TEM Abb. 2b). Günstige Kristallinität mit gutem Gitterabstand, entsprechend d-Abstand der {1\( \overline{1} \)00}-Gitterstreifen. Partikel können in wässriger Lösung (pH 7,0) über Wasserstoffbrücken Aggregate bilden; mittlere Aggregatgröße ~130 nm (DLS). Aggregate blieben 3 Monate stabil in verschiedenen physiologischen Umgebungen (pH 7,0, 1× PBS, Kulturmedium; Zusatzdatei 1: Tabelle S1). UV-vis-Absorptionsspektrum: Peaks bei ~216 nm (π–π*-Übergang aromatischer C=C-Bindungen) und ~309 nm (n–π*-Übergänge C=O-Schulter). π-Elektronenübergang enthält Sauerstoff (Abb. 2c), typisch für wässrige Dispersionen, bestätigt Fullerenol-Präsenz. Weitere Charakterisierungen per FTIR, XPS, Massenspektrometrie. FTIR: charakteristische Bänder: C–O-Strecken ~1109 cm⁻¹ (Band 1), phenolisches C–OH-Strecken ~1271 cm⁻¹ (Band 2), tertiäres alkoholisches C=O-Strecken ~1422 cm⁻¹ (Band 3), C=C-Strecken ~1674 cm⁻¹ (Band 4), C=O-Strecken ~1721 cm⁻¹ (Band 5), C–H intermolekular wasserstoffbrückengebunden und Carboxylat O–H-Strecken ~3318 cm⁻¹ (Band 6). CO₂-Interferenzband. Diese Bänder belegen exponierte Hydroxyl- und Carbonylgruppen sowie aromatische C=C-Bindungen (Abb. 2d). XPS: dekouvlierte C(1s)-Spektren: nicht-sauerstoffhaltiger Ring (C–C/C=C, 286,1 eV), C–O-Bindung (286,9 eV), C=O-Bindung (288,0 eV). O(1s)/C(1s)-Verhältnis ~35,8 % (Abb. 2e). Molekulargewicht per FD-Massenspektrometrie (Zusatzdatei 1: Abb. S2); Hydroxylgruppenanzahl (C–OH) = 46 bestätigt, konsistent mit Atomverhältnissen und Bindungszusammensetzungen (Abb. 2). Charakterisierung bestätigt erfolgreiche Fullerenol-Synthese.

Abbildung 2. Funktionale Charakterisierung des synthetisierten wasserlöslichen C₆₀(OH)₄₆ Fullerenols. a Niedrigvergrößertes TEM-Bild, b HR-TEM-Bild mit {1\( \overline{1} \)00}-Gitterebenen, mittlere Größe 1,11 ± 0,03 nm, d-Abstand 0,213 nm. c UV-vis-, d FTIR-Spektren. e Dekonvolutierte C(1s) XPS-Spektren und Gauß-Fit-Peaks: nicht-sauerstoffhaltiger Ring, C–O, C=O. Atomverhältnisse und Bindungszusammensetzung in Tabelle zusammengefasst. O(1s)/C(1s) Atomverhältnis 35,8 %.

ROS-Generierung wasserlöslicher Fullerenole unter TPE

Ein PS absorbiert Lichtenergie und überträgt sie auf nicht-absorbierende Moleküle zur ROS-Generierung, die Zielzellen abtötet, Tumorvaskulatur schädigt und antitumorale Immunantwort aktiviert. PSs haben spezifische Elektronenanordnung in Molekülorbitalen. Im Grundzustand (Singulett) besitzen PSs Elektronenpaare mit entgegengesetztem Spin in niedrigenergetischen Orbitalen. Lichtabsorption bei geeigneter Wellenlänge hebt ein Elektron in hohes Orbital ohne Spinänderung (kurzlebiger S₁-Zustand, Nanosekunden). PS kann Energie durch Fluoreszenz oder Wärme verlieren und zum Grundzustand zurückkehren. Alternativ kann Intersystem Crossing (Spin-Inversion des angeregten Elektrons) im S₁ auftreten, was zum langlebigen Triplettzustand T₁ (Mikrosekunden) führt. Radiative Triplet-to-Singlet-Übergänge sind spinverboten (langsam). Aus T₁ kann PS zum Grundzustand durch Phosphoreszenz oder Energieübertragung auf ein anderes Molekül zurückkehren, oder durch interne Konversion/strahlunglose Übergänge bei Kollisionen. Je länger T₁-Lebenszeit, desto höher Kollisionswahrscheinlichkeit und ROS-Produktion [57–59]. Photosensibilisierung wasserlöslicher Fullerenole führt zu langlebigem T₁-Zustand und Energie/Elektronenübertragung auf molekularen Sauerstoff, erzeugt ROS wie ¹O₂ und O₂^•−, die Hauptrollen in PDT spielen. Daher müssen ¹O₂ und O₂^•− von wasserlöslichem C₆₀(OH)₄₆ direkt per Laserbestrahlung detektiert werden. Zur Detektion während PDT wurde PDT durch Kombination von angeregtem Triplett-C₆₀(OH)₄₆, Sauerstoff und Licht (geeignete Wellenlänge/Energie) sowie SOSG, t-MVP, XTT, GSH-Reagenzien initiiert [33, 34, 49–51]. Für bakterizide Potenzial wurde ~760 nm als effizienteste Wellenlänge für relatives maximales TPA-Verhältnis von C₆₀(OH)₄₆ unter TPE bestimmt (Abb. 3a), bedingt durch Interbandübergänge [52]. Diese Wellenlänge wurde in nachfolgenden Experimenten verwendet. C₆₀(OH)₄₆ wurde bei 211,2 nJ Pixel⁻¹, 800 Scans (Ex 760 nm; Gesamtbelichtung ~3,2621 s) und Dosis 3 oder 6 µg ml⁻¹ photoangeregt (Zusatzdatei 1: Tabelle S2). Zur Bestätigung ROS-Beteiligung an PDT-Effekten wurde α-Tocopherol zur ROS-Neutralisation verwendet [49, 53]. ROS-Menge verringerte sich nach α-Tocopherol-Zugabe, Bakterienlebensfähigkeit stieg wie erwartet. ROS-Menge hing von applizierter Dosis ab. Um versehentliche ¹O₂/O₂^•−-Produktion durch weißes Licht zu vermeiden [60], erfolgten PDT-Experimente im Dunkeln. Fokus auf ¹O₂- und O₂^•−-Mengen. C₆₀(OH)₄₆ zeigte beträchtliche antibakterielle Effekte, demonstriert Potenzial für PDT-Anwendung. Nach gleichen Experimenten war C₆₀(OH)₂₁ (Zusatzdatei 1: Abb. S3, S4; Abb. 3a) weniger effektiv in ¹O₂- und O₂^•−-Bildung als C₆₀(OH)₄₆ (Zusatzdatei 1: Tabelle S2). C₆₀(OH)₄₆ erzeugte mehr ¹O₂ und O₂^•−; Φ_Δ-Werte: ~0,93 (C₆₀(OH)₄₆) vs. ~0,85 (C₆₀(OH)₂₁) (Referenz: Φ_Δ = 0,64 für TSPP in D₂O [29, 30]).

Abbildung 3. a Relative TPA-Spektren des Materials. TPE als Funktion der Wellenlänge (720–820 nm) bei 98,56 nJ Pixel⁻¹ zur Signalüberwachung. Applizierte Dosis: 3 µg ml⁻¹ wasserlösliches C₆₀(OH)₄₆ oder C₆₀(OH)₂₁. Überlebende b materialbehandelte Bakterien per CFU-Assay als % für c Bakterien in CFU ml⁻¹. Applizierte Dosis: OD₆₀₀ ~ 0,05 E. coli und 0–9 µg ml⁻¹ wasserlösliches Fullerenol. d Phosphoreszenzspektren bei 1270 nm. Applizierte Dosis: 3 µg ml⁻¹ wasserlösliches Fullerenol. Daten: Mittelwert ± SD (n = 6).

Antimikrobielle Fähigkeitsbestimmung per TPE

Vor antimikrobiellen Experimenten wurde Toxizität wasserlöslicher Fullerenole geprüft, um Faktoren auszuschließen, die bakterielle Elimination beeinflussen und Ergebnisse verfälschen könnten. Um ROS-Produktion durch versehentliches weißes Licht zu vermeiden [35], fanden PDT-Experimente im Dunkeln statt. Gram-negatives E. coli als experimentelles Template. CFU-Assay zur Bestimmung überlebender Bakterien (%, entsprechend CFU ml⁻¹). Bakterien mit zwei Fullerenol-Typen (Dosis 0–9 µg ml⁻¹) behandelt, 3 h im Dunkeln bei 37 °C inkubiert, OD₆₀₀ ~ 0,05 (Zusatzdatei 1: Abb. S1). Bakterienwachstum durch OD₆₀₀-Messung überwacht. Initialer OD 0,05, beide Materialien erreichten ~0,37 im Zeitverlauf. Keines der Materialien inhibierte Bakterienproliferation. Fast 0 log₁₀-Reduktion überlebender Bakterien (Abb. 3b), Vitalität ~100 % (Abb. 3c). Materialien zeigten hervorragende Biokompatibilität. Daher wurden nach 3 h Dunkelinkubation bei 37 °C Experimente durchgeführt. Obwohl Fullerenol ROS generieren kann, können Material-Reagenz-Interaktionen (SOSG, t-MVP, XTT, GSH) False-Positive ROS-Signale erzeugen [52]. Daher wurden Bakterien in die Studie eingeführt und mit Materialien behandelt. ROS-Menge von photoangeregtem materialbehandeltem E. coli beobachtet. Tabelle 2 zeigt beobachtete ROS-Mengen, Trend ähnlich Tabellen S2–S3 (Zusatzdatei 1: Materialien allein und materialbehandeltes Gram-positives Bacillus subtilis); konsistent mit ¹O₂-Phosphoreszenzsignal bei 1270 nm (Abb. 3d). PDT gegen E. coli mit niedriger Energiedosis (211,2 nJ Pixel⁻¹, 800 Scans, ~3,2621 s; Ex 760 nm). PDT-Effekte auf E. coli-Vitalität bei zwei-Photonen-photoangeregten Materialien bestimmt (Abb. 4). Keine bakteriziden Effekte bei Bakterien allein (mit/ohne Laser) oder materialbehandelten Bakterien ohne Laser (Abb. 4a). Nach TPE war Bakterienvitalität relativ niedrig: C₆₀(OH)₂₁-Panel ~15 % Vitalität (~0,823 log₁₀-Reduktion, Abb. 4b). Im Gegensatz dazu: C₆₀(OH)₄₆-Panel ~0 % Vitalität (100 % Elimination, ~7,736 log₁₀-Reduktion). Bei Dosiserhöhung vollständige bakterizide Effekte für beide Materialien (Abb. 4c, d). Antimikrobielle Effekte unterschieden sich nicht nach Bakterientyp (Gram-negativ E. coli oder Gram-positiv B. subtilis) nach Photoanregung (Zusatzdatei 1: Abb. S5). Höhere Hydroxylgruppenzusammensetzung erhöhte bakterizide Fähigkeit im Vergleich zu niedrigerer unter identischen Bedingungen.

Abbildung 4. Vitalität (%) per CFU-Assay bei TPE 211,2 nJ Pixel⁻¹, 800 Scans (~3,2621 s; Ex 760 nm), Dosis a,b 3 oder c,d 6 µg ml⁻¹. Applizierte Dosis: OD₆₀₀ 0,05 E. coli. Daten: Mittelwert ± SD (n = 6). Für C₆₀(OH)₄₆- und C₆₀(OH)₂₁-behandeltes E. coli mit Photoanregung: ap < 0,001 und p = 0,662, bp < 0,001 und p = 0,658, cp < 0,001 und p < 0,001, dp < 0,001 und p < 0,001. *p-Wert per Student's t-Test.

Beobachtung materialbehandelter E. coli per TEM und Untersuchung Zwei-Photonen-Eigenschaften

Zur Beobachtung der Disruption materialbehandelter Bakterien nach Photoanregung wurde C₆₀(OH)₄₆ (hohe PDT-Effizienz) ausgewählt, Bakterien per TEM abgebildet. Nackte E. coli (Abb. 5a) wurden 3 h mit Fullerenol inkubiert → substanzielle Adsorption auf bakteriellen Oberflächen, keine ungewöhnlichen Morphologien (normale lebende Bakterien, Abb. 5b). Aufnahme-Assay: Adsorption auf Bakterienoberfläche, Burst-Rate ~85 % innerhalb erster 3 h (Abb. 5c); Sättigung von 3. bis 10. Stunde. Materialien adsorbierten und bildeten externe Barriere auf Bakterienoberfläche. Über 3 Tage Inkubation zeigten E. coli verzerrtes Aussehen und schwere morphologische Veränderungen (Abb. 5d), 0,940 log₁₀-Reduktion (~18 % Vitalität, Abb. 5f; Zusatzdatei 1: Abb. S6). Materialabsorption und -beschichtung unterdrückten Nährstoffaufnahme und veränderten Membranpermeabilität → interne osmotische Imbalancen → Wachstumsinhibition. Wasserlösliches Fullerenol hatte antibakterielle (bakteriostatische/bakterizide) Effekte nach 3 Tagen. Photoangeregte materialbehandelte Bakterien, besonders E. coli, zeigten einzigartige Morphologien mit schwerer Schädigung nach 3 h (Abb. 5e, f; Zusatzdatei 1: Abb. S6). Keine wärmeerzeugten Blasen auf Bakterienoberfläche → keine photothermalen Hitzeeigenschaften nach Photoanregung (Zusatzdatei 1: Abb. S7). E. coli-Vitalität auch per Fluoreszenz/Quantifizierung bestimmt (Abb. 6). Grüne Fluoreszenz lebender Bakterien (Abb. 6a): Laser-only-Bakterien weitgehend unbeschädigt (konsistent Abb. 5a). Tote Bakterien nach Material+Laser (rote Fluoreszenz, Abb. 6b), konsistent Abb. 5e. Bakterienvitalität quantifiziert (Abb. 6c): nahezu vollständige Elimination materialbehandelter Bakterien. Vitalität auch per CFU-Assay (Abb. 4a, b, 5f, Zusatzdatei 1: Abb. S6) für antibakterielle Effizienz von C₆₀(OH)₄₆ in PDT. Ergebnisse (Abb. 4, 5, 6; Tab. 2, S2) zeigen: E. coli mit C₆₀(OH)₄₆ anfälliger für Photoanregung → höhere Todesrate, mehr ROS, schwererer morphologischer Kollaps vs. C₆₀(OH)₂₁. Absoluter TPE-Wirkungsquerschnitt macht Fluorophore effizient für nichtlineare Mikroskopie, da Verhältnis absorbierter Energie zu Eingangsenergiefluss hoch → minimiert Photodamage [39, 40]. Bei Zwei-Photonen-Imaging molekularer Aktivitäten in lebenden biologischen Präparaten und trüben Geweben ist günstiger Querschnitt wünschenswert [61]. In dieser Studie: absoluter TPE-Wirkungsquerschnitt für C₆₀(OH)₄₆ ~1037 GM (1 GM = 10⁻⁵⁰ cm⁴ s Photon⁻¹) bei 760 nm (Fluorescein als Standardreferenz [39, 40]; Abb. 1b, Tab. 1, 3); für C₆₀(OH)₂₁ ~1230 GM, ähnlich relevanter Studien [62, 63]. Diese Querschnitte erleichtern Zwei-Photonen-Prozesse. Fluoreszenz von C₆₀(OH)₄₆ durch Zwei-Photonen-Prozess beleuchtet (Abb. 1b). Relative Fluoreszenz-QY ~0,02 (Referenz Cy5.5 in DMSO QY_ref=0,28 [31]); absolute QY ~0,01; gleiche QYs für OPE und TPE [31]. C₆₀(OH)₂₁ hatte niedrigere relative/absolute QYs (0,06/0,05). Lebenszeituntersuchung: Effekte radiativer/nicht-radiativer Zerfallsraten auf QY und Lebenszeit berechnet. Mittlere Lebenszeit C₆₀(OH)₄₆ ~7,797 ns (beobachtete Lebenszeiten 0,149, 1,775, 19,679 ns); C₆₀(OH)₂₁ ~5,251 ns (Abb. 7, Tab. 4). Verhältnis radiativer zu nicht-radiativer Zerfallsrate C₆₀(OH)₄₆ ~0,020 (Raten ~2,565×10⁶ s⁻¹ zu 1,257×10⁸ s⁻¹); C₆₀(OH)₂₁ ~0,064 (~1,143×10⁷ s⁻¹ und 1,790×10⁸ s⁻¹; Zusatzdatei 1: Tab. S4). Dies ist auf Hydroxylgruppen an Fullerenol-Oberfläche zurückzuführen, die nicht-radiative Rekombination von Elektron-Loch-Paaren induzieren → Inhibierung intrinsischer Zustandsemission. Hydroxylgruppen am Rand des Fullerenols können hochbesetztes Molekülorbital haben, bedingt durch starke Orbitalwechselwirkung zwischen Hydroxylgruppen → erhöhte Intersystem-Crossing-Effizienz (statt Fluoreszenz) → zahlreiche Materialtripletts bei hoher Hydroxylgruppenzusammensetzung → hohe Φ_Δ → Reaktion mit Sauerstoff per Jablonski-Diagramm [65]. Folglich kann Zwei-Photonen-PDT mit ultraniedriger Energie in extrem kurzer Zeit effektiv durchgeführt werden → alternativer Ansatz zur Abtötung maligner Spezies.

Abbildung 5. TEM-Bilder. a Unbehandelte Bakterien. b 3 h Materialinkubation. d 3 Tage Inkubation. e Photoangeregte materialbehandelte Bakterien (3 h Inkubation) bei TPE 211,2 nJ Pixel⁻¹, 800 Scans (~3,2621 s; Ex 760 nm). c Aufnahme-Assay Bakterien/Material bei 37 °C. f Vitalität (%) per CFU-Assay bei gleicher Behandlung. Applizierte Dosis: OD₆₀₀ ~ 0,05 E. coli, 3 µg ml⁻¹ C₆₀(OH)₄₆. Daten: Mittelwert ± SD (n = 6).

Abbildung 6. Bilder nach Laserphotoanregung (211,2 nJ Pixel⁻¹, 800 Scans, ~3,2621 s; Ex 760 nm) von a,b materialbehandelten Bakterien. LIVE/DEAD-Kit vor Bildaufnahme. Maßstab 50 µm. c Vitalitätsbestimmung (%). Applizierte Dosis: OD₆₀₀ ~ 0,05 E. coli, 3 µg ml⁻¹ C₆₀(OH)₄₆. Für % lebend/tot: p < 0,001. *p-Wert per Student's t-Test. Daten: Mittelwert ± SD (n = 6).

Abbildung 7. Zeitaufgelöste PL-Abfallprofile bei Raumtemperatur (98,56 nJ Pixel⁻¹). Anregungswellenlänge 760 nm. Applizierte Dosis: OD₆₀₀ ~ 0,05 E. coli, 3 µg ml⁻¹ Materialien. Daten: Mittelwert ± SD (n = 6).

Schlussfolgerungen

Diese Studie zeigte, dass wasserlösliches Fullerenol mit höherer Hydroxylgruppenzusammensetzung überlegene Photoproperties gegenüber geringerem Hydroxylgruppenanteil aufweist; überlegene Eigenschaften aufgrund reduzierter Laserexposition und Materialmenge für Behandlung. Höhere Hydroxylgruppenzusammensetzung → hohe TPA, günstiger absoluter TPE-Wirkungsquerschnitt, hohe Zwei-Photonen-Stabilität. Daher Potenzial als Zwei-Photonen-PS in Zwei-Photonen-PDT gekoppelt mit TPE. Ursache wahrscheinlich: Hydroxylgruppen an Fullerenol-Oberfläche → nicht-radiative Rekombination Elektron-Loch-Paare → Inhibierung intrinsischer Zustandsemission. Hydroxylgruppen am Rand → hochbesetztes Molekülorbital (starke Orbitalwechselwirkung) → erhöhte Intersystem-Crossing-Effizienz (statt Fluoreszenz) → zahlreiche Materialtripletts bei hoher Hydroxylgruppenzusammensetzung → hohe Φ_Δ → Reaktion mit Sauerstoff per Jablonski-Diagramm. Folglich effektive Zwei-Photonen-PDT mit ultraniedriger Energie in extrem kurzer Zeit. Effizienter alternativer Ansatz zum Management maligner Spezies mit Möglichkeiten für zukünftige klinische Anwendungen.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle Datensätze sind im Hauptartikel dargestellt.

Abkürzungen

PS:

Photosensibilisatoren

QY:

Quantenausbeute

PDT:

Photodynamische Therapie

UV–vis:

Ultraviolett–sichtbar

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies

Φ_Δ:

Singulett-Sauerstoff-QY

NIR:

Nahinfrarot

TPE:

Zwei-Photonen-Anregung

E. coli:

Escherichia coli

HR-TEM:

Hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopie

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

FTIR:

Fourier-Transform-Infrarot

XPS:

Röntgenphotoelektronenspektroskopie

FD:

Felddesorption

CFU:

Koloniebildende Einheiten

TSPP:

Meso-Tetra(4-sulfonatophenyl)porphin-Dihydrochlorid

PL:

Photolumineszenz

DMSO:

Dimethylsulfoxid

OPE:

Ein-Photonen-Anregung

TPA:

Zwei-Photonen-Absorption

TPL:

Zwei-Photonen-Lumineszenz

ti-sa:

Titan-Saphir

NA:

Numerische Apertur

FLIM:

Fluoreszenzlebenszeit-Imaging-Mikroskopie

¹O₂:

Singulett-Sauerstoff

SOSG:

Singulett-Sauerstoff-Sensor-Green

t-MVP:

Trans-1-(2'-methoxyvinyl)pyren

O₂^•−:

Superoxid-Radikal-Anion

XTT:

2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilid

GSH:

Glutathion, γ-L-Glutamyl-L-cysteinyl-glycin

S₁:

Singulett

T₁:

Triplett

B. subtilis:

Bacillus subtilis

GM:

Goeppert-Mayer